接骨木鐮刀菌檢測試劑盒及檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于植物病原真菌的種類分子鑒定【技術(shù)領(lǐng)域】。目的是提供一種基于聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）的簡便快速的檢測植物病原真菌接骨木鐮刀菌（Fusarium?sambucinum）的試劑盒及檢測方法。檢測試劑盒包括一對鑒定接骨木鐮刀菌的特異引物序列和Mix，一對引物序列分別為：Fs-F：5’-GAC?CCA?AAT?CTA?AGC?TCG?CC-3’；Fs-R：5’-GAA?GGG?CAT?GTC?GCT?CAA?G-3’。檢測方法為：利用Fs-F和Fs-R引物對接骨木鐮刀菌的基因組DNA進行PCR擴增，可以獲得長度為309bp的特異性擴增片段，非接骨木鐮刀菌不能擴增獲得此片段。PCR反應(yīng)對接骨木鐮刀菌基因組DNA濃度的檢測極限可達70-100pg/μL。利用本發(fā)明，可準確、方便、快速地檢測接骨木鐮刀菌。
【專利說明】接骨木鐮刀菌檢測試劑盒及檢測方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及植物病原真菌的種類分子鑒定【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 馬鈴薯干腐病是世界馬鈴薯貯藏期重要病害之一，由多種鐮刀菌 spp.)引起。其中接骨木鐮刀菌適應(yīng)性強、分布廣泛、致病力強，一直是北美和歐洲部分地 區(qū)馬鈴薯干腐病的優(yōu)勢病原菌，并且也是我國河北、甘肅和內(nèi)蒙古等地馬鈴薯干腐病的優(yōu) 勢病原菌。傳統(tǒng)鐮刀菌鑒定采用形態(tài)學(xué)方法進行。然而，鐮刀菌分類系統(tǒng)繁多復(fù)雜，并且溫 度、濕度、pH值、光照等培養(yǎng)條件的改變，都會導(dǎo)致鐮刀菌的形態(tài)特征發(fā)生明顯變化，加之形 態(tài)鑒定本身比較耗時，鐮刀菌的準確鑒定面臨著巨大挑戰(zhàn)。近年來，隨著分子生物學(xué)的發(fā) 展，特別是GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫中真菌序列的不斷豐富，為鐮刀菌的準確、快速地鑒定 開辟了新的方向。
[0003] 翻譯延伸因子（Translation elongation factor-1 alpha，TEF-1 α )基因包含廣 泛的系統(tǒng)發(fā)生學(xué)信息，在鐮刀菌鑒定上，TEF-la序列具有很大的優(yōu)勢。首先，TEF-la序列 在鐮刀菌種的水平信息含量高；其次，在鐮刀菌屬內(nèi)未檢測到非同源性的基因拷貝。本發(fā)明 通過對鐮刀菌屬TEF-1 α全部序列組成的數(shù)據(jù)組進行比較分析，找到了接骨木鐮刀菌種內(nèi) 保守，而與其他種類鐮刀菌存在差異的DNA變異區(qū)，設(shè)計出接骨木鐮刀菌的特異引物，并建 立了準確、方便、快速的檢測接骨木鐮刀菌的試劑盒及檢測方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種準確、方便、快速鑒定接骨木鐮刀菌的檢測試劑盒及檢 測方法。具體包括一對自主設(shè)計的特異性PCR引物和Mix，以及整套PCR鑒定程序和步驟。
[0005] 1.本發(fā)明的技術(shù)方案如下：首現(xiàn)從Genebank核酸序列數(shù)據(jù)庫中下載鐮刀菌屬 TEF-1 α基因的所有序列。對下載序列組成的數(shù)據(jù)組進行比對和分析后，找出接骨木鐮刀菌 種內(nèi)保守，而與其他種類鐮刀菌存在差異的DNA區(qū)域，根據(jù)序列差異設(shè)計骨木鐮刀菌的特 異引物Fs-F和Fs-R。提取病菌基因組DNA并測定濃度，利用自行設(shè)計的特異性引物對，在 給定條件下進行PCR反應(yīng)，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測是否有309 bp的DNA片段出現(xiàn)，便可準 且鑒別瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。同時，將已知濃度的接骨木鐮刀菌基因組DNA按10倍梯度稀 釋法稀釋后進行PCR擴增，確定該方法對接骨木鐮刀菌基因組DNA檢測的極限濃度。
[0006] 2.鑒定方法是采用以下步驟： (1) 菌絲DNA的提??； (2) 擴增DNA片段，即進行聚合酶鏈式反應(yīng)，用于聚合酶鏈式反應(yīng)的一對引物的DNA序 列為： Fs-F:5, -GAC CCA AAT CTA AGC TCG CC-3,； Fs-R:5, -GAA GGG CAT GTC GCT CAA G-3,； (3) 瓊脂糖凝膠電泳分析；
【權(quán)利要求】
1. 一套接骨木鐮刀菌的檢測試劑盒，其特征在于：試劑盒包括一對特異性引物序列和 Mix。
2. 如權(quán)利要求1所述的接骨木鐮刀菌的檢測試劑盒，其特征在于：一對專一性PCR引 物 DNA 序列為：Fs-F :5, -GAC CCA AAT CTA AGC TCG CC-3，，F(xiàn)s-R :5, -GAA GGG CAT GTC GCT CAA G-3，。
3. 如權(quán)利要求1所述的接骨木鐮刀菌的檢測試劑盒，其特征在于：試劑盒Mix的成分 為 Taq 酶（0· 1-0. 3 U/μ L)、dATP (0· 03-0. 10 mM)、dTTP (0· 03-0. 10 mM)、dGTP(0. 03-0. 10 mM)、dCTP(0. 03-0. 10 mM)、MgCl2(0. 3-1. 0 mM)、KC1(130-150 mM)、Tris-HCl(20-30 mM, pH 9·0-9·5)、1% Triton X-100 及穩(wěn)定劑。
4. 如權(quán)利要求1所述的接骨木鐮刀菌的檢測試劑盒檢測方法，其特征在于：提取病菌 基因組DNA并測定濃度，利用特異引物，在給定條件下進行PCR反應(yīng)，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢 測，出現(xiàn)309 bp特異性擴增條帶的菌株為接骨木鐮刀菌。
5. 如權(quán)利要求4所述的接骨木鐮刀菌的檢測試劑盒檢測方法，其特征在于：鑒定接骨 木鐮刀菌的聚合酶鏈式反應(yīng)體系為(參考反應(yīng)體系為25 μ L): Mix 12. 5 μ L ； 上游引物Fs-F 1 uL； 下游引物Fs-R 1 uL； 模板 DNA 1 μ L ； 無菌 ddH20 9. 5 μ L。
6. 如權(quán)利4所述的試劑盒檢測方法，其特征在于：鑒定接骨木鐮刀菌的聚合酶鏈式反 應(yīng)條件為： 起始變性階段：94°C、4 min ; 變性階段： 94 °C、30-40 s; 退火階段： 61°C、30-40 s; 延伸階段： 72 °C、20-25 s; 循環(huán)次數(shù)： 28個循環(huán)； 最后延伸階段：72°C、7-10 min，反應(yīng)結(jié)束后在4°C保存。
7. 如權(quán)利要求1所述的接骨木鐮刀菌的檢測試劑盒，其特征在于：聚合酶鏈式反應(yīng)檢 測接骨木鐮刀菌基因組DNA的濃度極限值為70-100 pg/μ L。
【文檔編號】C12R1/77GK104120168SQ201310145104
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2013年4月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年4月24日
【發(fā)明者】朱杰華, 楊志輝, 魏巍, 張維宏, 陶晡, 楊毅清, 張春艷, 何佳昱, 胡珍珠 申請人:河北農(nóng)業(yè)大學(xué)