專(zhuān)利名稱：輪狀病毒pcr檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)及醫(yī)學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，尤其涉及一種輪狀病毒PCR檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
輪狀病毒(Rotavirus,簡(jiǎn)稱RV)屬于呼腸孤病毒科輪狀病毒屬,病毒粒子呈圓形，由形似車(chē)輪而得名，為無(wú)囊膜·病毒，具有11個(gè)片斷的雙股RNA基因組，主要感染兒童和動(dòng)物，引起嬰幼兒嚴(yán)重胃腸炎和脫水性腹瀉，新生仔畜的重劇性胃腸炎，在發(fā)展中國(guó)家每年有60萬(wàn)嬰幼兒由于輪狀病毒感染引起脫水死亡。根據(jù)輪狀病毒VP6的抗原性，目前將其分為A G7個(gè)組。其中，A組輪狀病毒是秋冬季嬰幼兒腹瀉的最重要病原，在發(fā)展中國(guó)家，每年約有87萬(wàn)兒童死于輪狀病毒感染；B組輪狀病毒由我國(guó)洪濤等發(fā)現(xiàn)，主要感染青壯年，20年前在我國(guó)曾造成大規(guī)模暴發(fā)性腹瀉流行；C組輪狀病毒主要感染青少年，并引起散發(fā)流行。因此對(duì)輪狀病毒的檢測(cè)顯得尤為重要，目前常用的針對(duì)輪狀病毒的經(jīng)典檢測(cè)技術(shù)，主要包括電鏡技術(shù)和分離培養(yǎng)。電鏡技術(shù)具有快捷、簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)，相對(duì)于單純依賴形態(tài)學(xué)觀察的普通負(fù)染電鏡技術(shù)，免疫電鏡技術(shù)通過(guò)在電鏡下檢測(cè)特異的凝集反應(yīng)或利用特異的抗體標(biāo)記物檢測(cè)抗原物質(zhì)，具有更高的靈敏度和特異性。由于病毒顆粒易于降解常常影響正確診斷，并且電鏡設(shè)備昂貴，難以普及，故電鏡技術(shù)的應(yīng)用大大受到限制。而傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)技術(shù)主要包括以下步驟:1)標(biāo)本處理；2)病毒接種與培養(yǎng)；3)病毒RNA提取；4)瓊脂糖電泳。最終檢測(cè)結(jié)果通過(guò)電泳進(jìn)行判定，且細(xì)胞培養(yǎng)法檢測(cè)輪狀病毒(A、B、C組)具有周期長(zhǎng)、操作煩瑣、易污染、程序復(fù)雜等缺點(diǎn)，因此需要開(kāi)發(fā)能快速檢測(cè)輪狀病毒(A、B、C組)的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明實(shí)施例的目的在于提供一種輪狀病毒(A、B、C組)檢測(cè)試劑盒，旨在解決現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)費(fèi)用高，效率低，檢測(cè)周期長(zhǎng)等問(wèn)題。本發(fā)明實(shí)施例是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種輪狀病毒PCR檢測(cè)試劑盒，包含第一反應(yīng)液和第二反應(yīng)液，其中該第一反應(yīng)液包含第一引物對(duì)(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2)、第一探針SEQ ID NO:3，第二引物對(duì)(SEQ ID NO:4 和 SEQ ID NO:5)、第二探針 SEQ ID N0:6，第三引物對(duì)(SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8)、第三探針SEQ ID NO:9，該第二反應(yīng)液包含逆轉(zhuǎn)錄酶和DNA聚合酶。本發(fā)明實(shí)施例的另一目的在于提供一種輪狀病毒的檢測(cè)方法，該檢測(cè)方法利用本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒，通過(guò)熒光定量PCR過(guò)程進(jìn)行檢測(cè)。本發(fā)明實(shí)施例提供的輪狀病毒PCR檢測(cè)試劑盒可針對(duì)A、B、C三組輪狀病毒進(jìn)行同步檢測(cè)，該檢測(cè)試劑盒利用一步法熒光定量PCR技術(shù)對(duì)輪狀病毒進(jìn)行檢測(cè)和分型。本發(fā)明實(shí)施例提供的輪狀檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)便，可快速讀取結(jié)果，相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)中的檢測(cè)方法具有快速、靈敏、安全和方便等優(yōu)點(diǎn)。


圖1為現(xiàn)有技術(shù)提供的熒光定量PCR的Ct值判定示意圖；圖2為本發(fā)明實(shí)施例提供的輪狀病毒檢測(cè)方法流程圖；圖3為本發(fā)明實(shí)施例提供的輪狀病毒檢測(cè)的陽(yáng)性結(jié)果熒光曲線圖；圖4為本發(fā)明實(shí)施例提供的輪狀病毒檢測(cè)的陰性結(jié)果熒光曲線圖；圖5為本發(fā)明實(shí)施例的輪狀病毒檢測(cè)結(jié)果圖譜。
具體實(shí)施例方式為了使本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題、技術(shù)方案及有益效果更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。本發(fā)明實(shí)施例提供一種針對(duì)輪狀病毒(A、B和C組)的PCR檢測(cè)試劑盒，該檢測(cè)試劑盒包含第一反應(yīng)液和第二反應(yīng)液，其中該第一反應(yīng)液包含第一引物對(duì)(SEQ ID NO:1和SEQID NO:2)、第一探針 SEQ ID NO:3，第二引物對(duì)(SEQ ID NO:4 和 SEQ ID NO:5)、第二探針SEQ ID NO:6，第三引物對(duì)(SEQ ID NO:7 和 SEQ ID NO:8)、第三探針 SEQ ID N0:9，該第二反應(yīng)液包含逆轉(zhuǎn)錄酶和DNA聚合酶。具體地，上述三組引物對(duì)和探針序列為:針對(duì)A組輪狀病毒的第一引物對(duì):
正向引物:5’-GTCCGAACTAGCAGATTTG-3’ SEQ ID NO:1，反向引物:5’-TGCCTCATCAGTTTGTTG-3’ SEQ ID NO:2，針對(duì)A組輪狀病毒的第一探針序列:5，-TCCATAGGATTACATAACCACTCATTAAGT-3，SEQ ID NO:3 ；針對(duì)B組輪狀病毒的第二引物對(duì):正向引物:5’-CAGACGATTCACTCAACATG-3’ SEQ ID NO:4，反向引物:5’-TCCTGATTTTCTTCATCTTG-3’ SEQ ID NO:5，針對(duì)B組輪狀病毒的第二探針序列:5’-GTAACCAATCAGTCACAAGAGTCCATA-3’ SEQ ID NO:6 ；針對(duì)C組輪狀病毒的第三引物對(duì):正向引物:5’-CCGTTCTATGTGATTCTCATTCAG-3，SEQ ID NO:7，反向引物:5’-CATGGAAATCCCGGTTGAA-3’ SEQ ID NO:8，針對(duì)C組輪狀病毒的第三探針序列:5，-CTGGCATCGCTGAATCTCTTCTGACG-3’ SEQ ID NO:9。本發(fā)明實(shí)施例采用了熒光定量PCR技術(shù)，其基本原理為:在PCR反應(yīng)體系中加入一種或多種熒光化學(xué)物質(zhì)，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷積累，熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過(guò)一個(gè)循環(huán)，收集一個(gè)熒光信號(hào)強(qiáng)度，這樣就可以通過(guò)熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化，得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖，如圖1所示，Ct值為每個(gè)PCR反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，而在曲線指數(shù)擴(kuò)增階段，PCR產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，可據(jù)此進(jìn)行定量分析。
具體地，本發(fā)明的PCR檢測(cè)試劑盒中，第一反應(yīng)液還包含PCR反應(yīng)緩沖液，MgCl2,dNTP等PCR反應(yīng)所必需的組分，且可以添加滅菌超純水以使第一反應(yīng)液以及第二反應(yīng)液的體積分別達(dá)到一定數(shù)量。具體地，本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒中，該第一反應(yīng)液與第二反應(yīng)液通過(guò)石蠟分隔開(kāi)，在具體操作中可先將第一反應(yīng)液加入至PCR反應(yīng)管中，然后加入液態(tài)的石臘，待石臘凝固后在其上面加入第二反應(yīng)液。兩種反應(yīng)液的添加先后順序可以替換。利用石蠟將第一反應(yīng)液和第二反應(yīng)液分隔開(kāi)，以避免保存過(guò)程中兩者的相互影響，延長(zhǎng)了保存期限，并且提高了檢測(cè)的精確度和靈敏度。該石蠟的優(yōu)選用量為1.5-2微升。具體地，本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒采用的探針序列SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6和SEQID NO:9的5’端分別連接有熒光基團(tuán)，3’端分別連接有淬滅基團(tuán)。熒光基團(tuán)能發(fā)出熒光信號(hào)，淬滅基團(tuán)可以抑制熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光信號(hào)，而在熒光定量PCR反應(yīng)過(guò)程中，探針與目的DNA序列的結(jié)合后經(jīng)過(guò)DNA聚合酶的剪切作用使得熒光基團(tuán)能發(fā)出熒光，因此通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)的積累可以對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析。本發(fā)明實(shí)施例中使用的熒光基團(tuán)可以為FAM、HEX或R0X，其中FAM為Carboxyfluorescein，中文名稱為羧基熒光素，HEX為hexachloro-fIuorescein,中文名稱為六氣突光素，ROX 為 5-Carboxy-X-rhodamine,中文名稱為5-羧基-X-羅丹明。三種熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光不同，因此三種探針?lè)謩e對(duì)應(yīng)使用不同的熒光基團(tuán)以使檢測(cè)結(jié)果容易判斷，并且該三種探針可分別對(duì)應(yīng)于其中任一種熒光基團(tuán)。本發(fā)明實(shí)施例中使用的淬滅基團(tuán)為DABCYL,即4，4-Dimethylamino-azobenzene_4’ _carboxylic acid,中文名稱為4_ 二甲胺偶氮苯_4’ -羧酸。具體地，本發(fā)明實(shí)施例的檢測(cè)試劑盒中使用的引物和探針在母液中儲(chǔ)存，儲(chǔ)存時(shí)的濃度為45-55 μ M0優(yōu)選地，該儲(chǔ)存濃度為50 μ M0在制備試劑盒時(shí)將各種母液加入至PCR反應(yīng)管中相互混合并與其它組分混合以獲得第一反應(yīng)液。具體地，本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒中，第二反應(yīng)液還包含顯色劑，顯色劑在該試劑盒中起到指示的作用，通過(guò)其 指示可防止加樣時(shí)出現(xiàn)誤操作，而其自身不參與PCR反應(yīng)。在優(yōu)選的實(shí)施例中，該顯色劑為溴酚藍(lán)。優(yōu)選地，在本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒中還可包含RNA酶抑制劑，RNA酶抑制劑濃度為5-10U/反應(yīng)，加入RNA酶抑制劑以防止待檢測(cè)病毒RNA的降解，使檢測(cè)結(jié)果更準(zhǔn)確。具體地，在本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒中，該DNA聚合酶可以為任何適用于熒光定量PCR反應(yīng)的Taq酶，優(yōu)選地，該DNA聚合酶為Ex Taq酶，該Ex Taq酶可用于熱啟動(dòng)PCR反應(yīng)，熱啟動(dòng)PCR反應(yīng)可以優(yōu)化目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物，同時(shí)也抑制非特異性擴(kuò)增，以增強(qiáng)特異性，提高檢測(cè)準(zhǔn)確度。具體地，本發(fā)明實(shí)施例的檢測(cè)試劑盒可包含用于提取待檢測(cè)輪狀病毒的樣品總RNA的制劑，在該方案中，本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒中含有Trizol試劑、氯仿/異戊醇(24:1)、異丙醇、DEPC-H2O15在一可選方案中，本發(fā)明實(shí)施例的檢測(cè)試劑盒直接對(duì)輪狀病毒樣品的總RNA進(jìn)行檢測(cè)，即本發(fā)明實(shí)施例的檢測(cè)試劑盒中不包含提取輪狀病毒RNA的試劑。因此在檢測(cè)前需提取輪狀病毒RNA，提取RNA通常使用Trizol及相關(guān)試劑進(jìn)行，具體操作步驟可按照Trizol試劑的說(shuō)明書(shū)執(zhí)行。在優(yōu)選的實(shí)施例中，本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒還可包括陰性對(duì)照液和陽(yáng)性對(duì)照液，其中陰性對(duì)照液中含有非輪狀病毒類(lèi)RNA的其他病毒或細(xì)菌RNA序列，如諾如病毒，札如病毒，星狀病毒，腺病毒RNA中的任一種，也可以不包含任何RNA序列；陽(yáng)性對(duì)照中含有輪狀病毒(A、B、C組)總RNA序列。在檢測(cè)過(guò)程中，向檢測(cè)反應(yīng)管中加入提取的待檢測(cè)樣品的RNA，同時(shí)向陰性對(duì)照反應(yīng)管中加入陰性對(duì)照液，向陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)管中加入陽(yáng)性對(duì)照液。具體地，本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒可配置成20 μ L反應(yīng)體系或者其他合適的反應(yīng)體系(如25μ L或50μ L)。對(duì)于20 μ L反應(yīng)體系,第一反應(yīng)液體積為18 μ L,第二反應(yīng)液體積為2 μ L，同時(shí)使用20 μ L石蠟將兩者分隔開(kāi)?？砂凑赵摫壤?第一反應(yīng)液:第二反應(yīng)液=18:2)將反應(yīng)體系放大，但石蠟的體積不變。本發(fā)明實(shí)施例還提供一種輪狀病毒檢測(cè)方法，該檢測(cè)方法利用本發(fā)明提供的檢測(cè)試劑盒通過(guò)熒光定量PCR反應(yīng)進(jìn)行，檢測(cè)流程如圖2所示。具體地，在上述輪狀病毒檢測(cè)方法中，可以對(duì)待測(cè)樣品提取RNA后進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。如果已經(jīng)提取出病毒RNA，則可以直接進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR檢測(cè)。本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒中包含了逆轉(zhuǎn)錄酶，因此本發(fā)明設(shè)定的熒光定量PCR檢測(cè)程序中包括逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程。具體地，在利用本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)過(guò)程中，PCR反應(yīng)條件為:42-50°C:10-15min ；92-95 °C:2_3min ；92-95°C:5_10s，55_6(TC:40_80s ;40 個(gè)循環(huán)。具體地，上述第一階段:42 -50°C:10-15min，可以使RNA逆轉(zhuǎn)錄為DNA，以便進(jìn)行下一步PCR檢測(cè)。具體地，在PCR反應(yīng)結(jié)束后可獲得熒光定量PCR反應(yīng)結(jié)果，通過(guò)對(duì)該反應(yīng)結(jié)果分析，可得到檢測(cè)結(jié)果，分析依據(jù)如下:陽(yáng)性結(jié)果:擴(kuò)增曲線圖Ct值< 35，并有明顯指數(shù)增長(zhǎng)，如圖3所示。陰性結(jié)果:擴(kuò)增曲線圖Ct值> 35或無(wú)Ct值，后者如圖4所示。該P(yáng)CR檢測(cè)過(guò)程通過(guò)一步法實(shí)現(xiàn)了 mRNA逆轉(zhuǎn)錄與cDNA的PCR反應(yīng)連續(xù)進(jìn)行，簡(jiǎn)化了針對(duì)RNA病毒的檢測(cè)程序，縮短了檢測(cè)時(shí)間。以下通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述。實(shí)施例一含有RNA提取液的試劑盒制備1.合成引物及探針序列合成以下引物和連接有熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的探針序列:針對(duì)A組輪狀病毒的第一引物對(duì):正向引物:5’-GTCCGAACTAGCAGATTTG-3’SEQ ID NO:1，反向引物:5’-TGCCTCATCAGTTTGTTG-3’SEQ ID NO:2，針對(duì)A組輪狀病毒的第一探針序列:5，- (FAM)TCCATAGGATTACATAACCACTCATTAAGT(DABCYL)-3 ’ SEQ ID NO: 3 ;針對(duì)B組輪狀病毒的第二引物對(duì):正向引物:5’-CAGACGATTCACTCAACATG-3’SEQ ID NO:4，反向引物:5，-TCCTGATTTTCTTCATCTTG-3，SEQ ID NO:5，針對(duì)B組輪狀病毒的第二探針序列:
5’ -(HEX)GTAACCAATCAGTCACAAGAGTCCATA (DABCYL)-3’ SEQ ID NO:6 ；針對(duì)C組輪狀病毒的第三引物對(duì):正向引物:5，-CCGTTCTATGTGATTCTCATTCAG-3，SEQ ID NO:7，反向引物:5’-CATGGAAATCCCGGTTGAA -3，SEQ ID NO:8，針對(duì)C組輪狀病毒的第三探針序列:5，- (ROX)CTGGCATCGCTGAATCTCTTCTGACG(DABCYL)-3， SEQ ID NO:9。將上述引物和探針制備成50 μ M的儲(chǔ)存液保存。2.制備PCR反應(yīng)液按如下組分配制本發(fā)明檢測(cè)試劑盒的第一反應(yīng)液:
10><buffer(不含鎂離子)2微升
MgCl2 (25mM)2 微升
dNTP2微升A組輪狀病毒正向引物(SEQ丨DNO:l) 0.1微升 A組輪狀病毒反向引物(SEQ ID NO:2) 0.1微升 A組輪狀病毒探針(SEQ ID NO:3)O, I微升
B組輪狀病毒正向引物(SEQ ID NO:4) 0.1微升
B組輪狀病毒反向引物(SEQ ID NO:5) 0.1微升 B組IM大病毒探針(SEQ ID NO:6)0.1微升
C組輪狀病毒正向引物(SEQ ID NO:7) 0.1微升 C組輪狀病毒反向引物(SEQ ID NO:8) 0.1微升
C組輪狀病毒探針(SEQ ID NO:9)0.1微升，然后加入滅菌超純水使總體積達(dá)到18微升。在上述總體積為18微升的第一反應(yīng)液上加入2微升液態(tài)石蠟，待該石蠟?zāi)毯笤谑炆厦婕尤胍韵陆M分的第二反應(yīng)液:Ex Taq酶0.15微升
M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶0,1微升
溴酚藍(lán)0.01微升
RNA峰抑制剩0.2微升》最后加滅菌超純水使第二反應(yīng)液體積達(dá)到2微升，即獲得本實(shí)施例的PCR反應(yīng)液。3.制備陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照陰性對(duì)照液:利用Trizol提取諾如病毒RNA基因組，具體操作步驟按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，溶于Tris-EDTA緩沖液(0.01ΜρΗ8.0)。該陰性對(duì)照液置于0.6mL普通帶蓋離心管(紫色透明)中。陽(yáng)性對(duì)照液:先分離出A、B、C組輪狀病毒并分別提取總RNA做為陽(yáng)性模板，使用Tris-EDTA緩沖液(0.0lM pH8.0)稀釋后冷凍保存。該陽(yáng)性對(duì)照液置于0.6mL普通帶蓋離心管(橙紅色透明)中。4.RNA提取試劑每份RNA提取試劑包括以下組分:13ml Trizol,置于30mL棕色平口瓶(配棕色蓋)中；氯仿/異戍醇(24:1),總體積為3mL,置于8mL棕色平口瓶(配綠色蓋)中；9mL異丙醇，置于20mL棕色平口瓶(配黃色蓋)中；DEPC水，置于兩支1.5mL普通凍存管(配黃色蓋)中，每支含有1.5mLDEPC水。5.試劑盒組裝每份試劑盒中包含3條PCR反應(yīng)八聯(lián)管，每個(gè)八聯(lián)管中含有步驟2制備的由第一反應(yīng)液、第二反應(yīng)液和石蠟組成的組合物，每份試劑盒中還包含步驟3和4中制得的組分。實(shí)施例二不含RNA提取試劑的檢測(cè)試劑盒1.合成引物和探針序列，同實(shí)施例一步驟I。2.按如下組分配制第一反應(yīng)液:按如下組分配制本發(fā)明檢測(cè)試劑 盒的第一反應(yīng)液:I Oxbuffer (不含鎂離子)2.5微升
MgCi2 (25mM)4 微升
dNTP4微升 A組輪狀病毒正向引物(SEQ ID NO:!) 0.2微升 A組輪狀病毒反向引物(SEQ ID NO:2) 0.2微升 A組輪狀病毒探針{SEQ ID NO:3) 0.2微升 B組輪狀病毒正向引物(SEQ ID NO:4) 0.2微升 B組輪狀病毒反向引物(SEQ ID NO:5) 0.2微升 B組輪狀病毒探針(SEQ ID NO:6) 0.2微升 C組輪狀病毒正向引物(SEQ ID NO:7) 0.2微升 C組輪狀病毒反向引物(SEQ ID NO;8) 0.2微升
C組輪狀病毒探針(SEQ ID NO:9)0.2微升，然后加入滅菌超純水使總體積達(dá)到18微升，其中上述兩對(duì)引物和兩種探針混合之前的濃度均為50 μ M。在上述總體積為18微升的第一反應(yīng)液上加入2μ L液態(tài)石蠟，待該石蠟?zāi)毯笤谑炆厦婕尤胍韵陆M分的第二反應(yīng)液:
Ex Taq峰0.3微升
M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶0,3微升
溴酚藍(lán)0.02微升
RNA酶抑制劑0.2微升，最后加滅菌超純水使體積達(dá)到2微升。3.制備陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照陰性對(duì)照液:利用Trizol提取札如病毒總RNA，具體操作步驟按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，溶于Tris-EDTA緩沖液(0.01ΜρΗ8.0)。該陰性對(duì)照液置于0.6mL普通帶蓋離心管(紫色透明)中。陽(yáng)性對(duì)照液:先分離出A、B、C組輪狀病毒并分別提取總RNA做為陽(yáng)性模板，使用Tris-EDTA緩沖液(0.0lM pH8.0 )稀釋后冷凍保存。該陽(yáng)性對(duì)照液置于0.6mL普通帶蓋離心管(橙紅色透明)中。4.試劑盒組裝每份試劑盒中包含3條PCR反應(yīng)八聯(lián)管，每個(gè)八聯(lián)管中含有步驟2制備的由第一反應(yīng)液、第二反應(yīng)液和石蠟組成的PCR反應(yīng)液，該試劑盒還包括陰性對(duì)照液和陽(yáng)性對(duì)照液。實(shí)施例三輪狀病毒(hRV)檢測(cè)本實(shí)施例共檢測(cè)25例樣本，具體檢測(cè)流程如圖2所示。1.樣本RNA提取取糞便樣品lg，用IOOul生理鹽水稀釋?zhuān)?000rpm離心兩分鐘,取上清100 μ L加入
1.5mL離心管中，加入500 μ L Trizol試劑,按照Trizol說(shuō)明書(shū)指示提取RNA,操作步驟如下:室溫劇烈震蕩15秒，靜置5分鐘，再加入120 U L氯仿/異戊醇(24:1)，用手劇烈震蕩15秒，室溫靜置5分鐘。然后12000rpm4°C離心15分鐘，取上清(不能吸出中間白色層)置于另一新離心管中；加入等體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置10分鐘。對(duì)上述離心管12000rpm4°C離心10分鐘，棄上清，用75%的冰乙醇洗滌沉淀，12000rpm4°C離心5分鐘，棄乙醇。沉淀室溫干燥除去乙醇，用20 50 μ L DEPC-H2O溶解沉淀待檢。2.RT-PCR 一步法檢測(cè)取5μ L步驟I獲得的待檢樣本RNA，加入實(shí)施例一制備的PCR反應(yīng)液中，利用熒光定量 PCR 儀(ICycler/MJ 0pticon2)檢測(cè)。PCR反應(yīng)條件:
45 °C: 12min ；94°C:3min ；94°C:7s，58°C:70s，40 個(gè)循環(huán)。3.結(jié)果判斷每次檢測(cè)均設(shè)置陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，結(jié)果符合要求認(rèn)為檢測(cè)合格，進(jìn)行下一步分析，如不符合要求，重新檢測(cè)。根據(jù)擴(kuò)增圖譜判定結(jié)果判斷依據(jù)如下:陽(yáng)性結(jié)果:擴(kuò)增曲線圖Ct值< 35，并有明顯指數(shù)增長(zhǎng)，見(jiàn)圖3 ；陰性結(jié)果:擴(kuò)增曲線圖Ct值> 35或無(wú)Ct值，見(jiàn)圖4。4.檢測(cè)結(jié)果25例樣本檢測(cè)結(jié)果如下表I所示(以傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)法作為參考):表I 一步法RT-PCR檢測(cè)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種輪狀病毒PCR檢測(cè)試劑盒,包含第一反應(yīng)液和第二反應(yīng)液,其中所述第一反應(yīng)液包含第一引物對(duì)SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2、第一探針SEQ ID NO:3，第二引物對(duì)SEQID NO:4 和 SEQ ID NO:5、第二探針 SEQ ID NO:6，第三引物對(duì) SEQ ID NO:7 和 SEQ ID NO:8、第三探針SEQ ID NO:9，所述第二反應(yīng)液包含逆轉(zhuǎn)錄酶和DNA聚合酶。
2.如權(quán)利要求1所述的輪狀病毒PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述第一反應(yīng)液與所述第二反應(yīng)液通過(guò)石蠟分隔開(kāi)。
3.如權(quán)利要求1所述的輪狀病毒PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述第一探針SEQIDNO:3、第二探針SEQ ID NO:6及第三探針SEQ ID NO:9的5’端分別連接有熒光基團(tuán)，3’端分別連接有淬滅基團(tuán)。
4.如權(quán)利要求3所述的輪狀病毒PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述熒光基團(tuán)為FAM、HEX或ROX，所述淬滅基團(tuán)為DABCYL。
5.如權(quán)利要求1所述的輪狀病毒PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述第二反應(yīng)液還包含顯色劑。
6.如權(quán)利要求1所述的輪狀病毒PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述第二反應(yīng)液還包含RNA酶抑制劑。
7.如權(quán)利要求1所述的輪狀病毒PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于，還包含陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照。
8.如權(quán)利要求1所述的輪狀病毒PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于，還包含RNA提取試劑。
9.一種輪狀病毒檢測(cè)方法，所述檢測(cè)方法利用權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的檢測(cè)試劑盒通過(guò)PCR反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)。
10.如權(quán)利要求9所述的輪狀病毒檢測(cè)方法，其特征在于，所述PCR反應(yīng)條件設(shè)定為:42-50 0C:10-15min ；92-95°C:2-3min ； 92-95°C:5-10s,55-60°C:40-80s ;40 個(gè)循環(huán)。
全文摘要
本發(fā)明適用于生物技術(shù)及醫(yī)學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，提供了一種輪狀病毒PCR檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法。該檢測(cè)試劑盒包含第一反應(yīng)液和第二反應(yīng)液，該第一反應(yīng)液包含引物對(duì)SEQ ID NO1和SEQ ID NO2、探針SEQ ID NO3，引物對(duì)SEQ ID NO4和SEQ ID NO5、探針SEQ ID NO6，引物對(duì)SEQ ID NO7和SEQ ID NO8、探針SEQ ID NO9，該第二反應(yīng)液包含逆轉(zhuǎn)錄酶和DNA聚合酶。本發(fā)明的檢測(cè)方法利用本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒通過(guò)PCR反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)。本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒可針對(duì)A、B、C三組輪狀病毒進(jìn)行同步檢測(cè)，操作簡(jiǎn)便，可快速讀取結(jié)果。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103224998SQ20131014515
公開(kāi)日2013年7月31日 申請(qǐng)日期2013年4月24日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月24日
發(fā)明者田仁鵬, 吳成貢, 王茵茵, 盧柳燕 申請(qǐng)人:深圳市生科源技術(shù)有限公司