專利名稱:一種啟動子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域,具體涉及一種啟動子及其應(yīng)用,即一種植物啟動子,在損傷脅迫下能夠啟動調(diào)控基因的表達。
背景技術(shù):
在基因工程研究中,使外源目的基因在受體生物中表達,以提高作物對干旱、鹽、堿以及病蟲害等環(huán)境脅迫的抗性,或提高作物品質(zhì)及改良作物農(nóng)藝性狀等,已成為目前作物品種改良的一種重要手段。近年來,有關(guān)啟動子的分離和研究成為國內(nèi)外研究的熱點之一?;蚬こ痰陌l(fā)展為作物抗病蟲害研究以及植物生物反應(yīng)器的研究作出了巨大的貢獻。但是,如何控制外源基因定時定量地高效表達,是限制基因工程技術(shù)在作物遺傳改良方面有效應(yīng)用的重要因素。除了尋找有效的目的基因之外,尋找有效控制外源基因表達的啟動子成為基因工程改良中需要解決的重要問題。使用組成型啟動子驅(qū)使外源基因表達,不僅造成資源浪費,還直接影響植株的生長發(fā)育及正常的生理代謝,而使用誘導(dǎo)型啟動子,不僅不會造成各種資源的浪費,又能增強植物體對外界的抗性,減少對植物生長發(fā)育及其他代謝途徑的影響(朱麗萍等,2010,遺傳32,229-234)。因此,研究和利用誘導(dǎo)型啟動子,對于研究植物響應(yīng)各種脅迫的生理機理以及研究農(nóng)作物的抗逆基因工程都有重要的意義,在基礎(chǔ)研究和植物生物技術(shù)方面也有著廣闊的應(yīng)用前景。啟動子根據(jù)其功能和作用方式大致分為組成型啟動子、組織特異性啟動子和誘導(dǎo)型啟動子三種。組成型啟動子在所有器官和組織中都能啟動基因的持續(xù)表達,不具備時空特異性。目前植物中應(yīng)用最廣泛的是來自花椰菜花葉病毒(CaMV) 35S啟動子,最新發(fā)現(xiàn)的一個組成型啟動子是來自冰葉日中花的多聚泛素McUBIl基因啟動子,其在瞬時表達分析中比35S啟動子還要穩(wěn)定。其它的還有玉米泛素Ubiquitin啟動子(Streatfield等,2004,Transgenic Res 13,299-312)、水稻 RuBQ2 啟動子(Wang 等,2003,Plant CellRep 22,129-134)、水稻SUI I啟動子(魏晶等,2012,華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報31,139-146)等。該類啟動子活性較高,但由于 其導(dǎo)致外源基因在轉(zhuǎn)基因植物整個生長時期的不同部位表達,影響植物的生長發(fā)育和正常生理代謝,有些產(chǎn)物可能造成毒害作用,不利于品質(zhì)和產(chǎn)量的提高,甚至?xí)?dǎo)致植物的死亡。因此,為了更好地調(diào)控植物基因的表達,特異型啟動子和誘導(dǎo)型啟動子的研究和應(yīng)用越來越受到人們重視。組織特異型啟動子是指基因只在某些特定的器官或組織中表達,往往具有發(fā)育調(diào)節(jié)的特征,啟動區(qū)內(nèi)含有種類、數(shù)量不同的順式作用元件。目前對特異型啟動子的分離和研究很廣泛,如煙草根特異性TobRB7啟動子(曲波等,2008,吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院學(xué)報17,9-15)、煙草花藥特異性TA29啟動子(黃海泉等,2012,江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)40,26-28)、煙草葉片特異性rbcS啟動子(孫家利等,2010,中國煙草學(xué)報16,80-85)、玉米葉片特異性PPCAl 啟動子(Gowik等,2004,Plant Cell 16,1077-1090)、草莓果實特異性GalUR 啟動子(Agius等,2005,J Exp Bot 56,37-46)等。該類啟動子的深入研究有助于闡明植物生長發(fā)育和生理代謝的基礎(chǔ)理論,而且具有廣泛的應(yīng)用價值。
誘導(dǎo)型啟動子是指正常狀態(tài)下不表達或低表達,受到某些物理或化學(xué)信號的刺激,可以大幅度地提高基因的表達水平一類啟動子。根據(jù)誘導(dǎo)因素,誘導(dǎo)型啟動子可分為光誘導(dǎo)型啟動子、溫度誘導(dǎo)型啟動子、損傷誘導(dǎo)型啟動子、激素誘導(dǎo)型啟動子和真菌誘導(dǎo)型啟動子等。其特點是:受到物理或化學(xué)因素的誘導(dǎo);含有多種功能元件,協(xié)同增強或降低啟動子的活性;部分誘導(dǎo)型啟動子同時具有組織特異性啟動子的特點。Kasuga等利用誘導(dǎo)型rd29A啟動子代替CaMV35S啟動子轉(zhuǎn)化擬南芥,提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗旱性,同時減少了組成型過表達造成的植株生長停滯或矮化現(xiàn)象的發(fā)生(Narusaka等,2003,PlantJ 34,137-148)。其他誘導(dǎo)型啟動子如水稻質(zhì)膜CaATPase啟動子受干旱、寒冷、茉莉酸甲酯以及脫落酸的誘導(dǎo)(Huda等,2013,PLoS One 8),遼寧堿蓬甜菜BADH啟動子也是鹽誘導(dǎo)性啟動子(李秋莉等,2006,生物工程學(xué)報22,77-81);擬南芥RBCS-1A啟動子是光誘導(dǎo)型啟動子,同時具有組織特異性(習(xí)雨琳等,2012,作物學(xué)報38,1561-1569);甘藍型油菜MAPK7基因家族及其啟動子受高溫、損傷及植物激素的誘導(dǎo)(朱斌等,作物學(xué)報,2013)。對于誘導(dǎo)型啟動子,目的基因只有在接受誘導(dǎo)信號后才會表達,不僅不會造成各種資源的浪費,又能增強植 物體對外界的抗性,減少對植物生長發(fā)育及其他代謝途徑的影響。因此,研究和利用誘導(dǎo)型啟動子,對于研究植物響應(yīng)各種脅迫的生理機理以及研究農(nóng)作物的抗逆基因工程都有重要的意義,在基礎(chǔ)研究和植物生物技術(shù)方面也有著廣闊的應(yīng)用前景。然而到目前為止,有關(guān)煙草損傷誘導(dǎo)表達基因啟動子的研究卻仍顯薄弱和滯后,這也在一定程度上制約了其功能解析與應(yīng)用探索研究。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種啟動子及其應(yīng)用,即一種來源于煙草的,并能在植物中高度表達的損傷誘導(dǎo)型啟動子。本發(fā)明的一個目的是提供一種損傷誘導(dǎo)型啟動子,其核苷酸序列為SEQ ID N0:1。本發(fā)明的第二個目的是提供一種用于植物轉(zhuǎn)化的損傷誘導(dǎo)型啟動子真核表達載體,該載體的啟動子是核苷酸序列為SEQ ID NO:1的啟動子;該表達載體可使外源目的基因的高效表達。本發(fā)明進一步提供了一種在植物中表達外源基因的方法,是用上述重組表達載體,將外源目的基因?qū)朐撦d體,轉(zhuǎn)化植物,獲得的轉(zhuǎn)化植物通過機械損傷可以誘導(dǎo)外源基因的表達。本發(fā)明對煙草高效誘導(dǎo)型啟動子的分離鑒定,能夠為煙草生物反應(yīng)器的研發(fā)提供實驗和技術(shù)支撐。利用高效誘導(dǎo)型啟動子,以煙草作為生物反應(yīng)器,表達疫苗、抗體及其他藥用蛋白等,可突破傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)范疇,延伸到醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
圖1:本發(fā)明的NtL0X3啟動子連接T載體質(zhì)粒PCR鑒定電泳圖;圖2:本發(fā)明的NtL0X3啟動子連接pCAMBIA1301質(zhì)粒PCR電泳圖;圖3:本發(fā)明的NtL0X3啟動子連接pCAMBIA1301酶切鑒定電泳圖;圖4:本發(fā)明的植物表達載體構(gòu)建示意圖;圖5:本發(fā)明pCAMBIA1301::NtL0X3-Promoter轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌PCR鑒定電泳具體實施例方式下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的方法進行詳細(xì)的描述,但是以下描述的目的是示例性的,而不是限制本發(fā)明的范圍。實施例1:煙草脂氧合酶基因NtL0X3啟動子的分離1.1、煙草基因組DNA的制備取種植于溫室兩個月的煙草,取其嫩葉,采用CTAB法提取基因組DNA,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后與_20°C進行保存。1.2 NtL0X3啟動子的克隆和序列分析以煙草基因組DNA為模板,上游引物為:GGGGTACCGCCAGGTCTAAGGAAGG(SEQID NO:
2),下游引物為:GAAGATCTAATAATAATAGTTCTCTCTTCAATT (SEQ ID NO:3),通過 PCR 擴增得到NtL0X3啟動子候選區(qū),PCR反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性4min,94°C變性4min,49.3°C退火45s,72°C延伸2min,共28個循環(huán),4°C保存。將PCR產(chǎn)物連接到pEASY_Tl載體,克隆并進行質(zhì)粒PCR檢測(質(zhì)粒命名為pEASY-Tl::NtL0X3-Promoter)(圖1 ),并測序獲得長度為1847bp 的 NtL0X3 啟動子,其序列為 SEQ ID NO:1。然后使用 PLACE 軟件(http://www.dna.affrc.R0.jp/PLACE/)對啟動子序列中的順式作用元件進行預(yù)測分析,發(fā)現(xiàn)該啟動子含有真核生物啟動子的基本保守元件TATA-box和CAAT-box,還含有可能的損傷和MeJA應(yīng)答元件GT-box (GTGTGCA)、CATG-box (CATG)和W_box (TCACC/T)元件等。并通過轉(zhuǎn)基因試驗表明損傷可以誘導(dǎo)該啟動子的高水平活性。實施例2:植物損傷誘導(dǎo)型表達載體的構(gòu)建將PCAMBIA1301載體用Kpn I/Bgl II酶切后,回收大片段待用。將實施例1中的pEASY-Tl::NtL0X3-Promoter質(zhì)粒經(jīng)Kpn I/Bgl II酶切后,回收長為1847bp的啟動子目的片段。在10μ1體系中,把目的片段與載體片段用Τ4 DNA連接酶連接,通過PCR鑒定(圖2)和酶切鑒定(圖3)來確定為陽性重組子。從而使本發(fā)明的啟動子取代載體PCAMBIA1301上的CaMV35S啟動子,與Gus基因融合,得到表達Gus基因的植物重組表達載體pCAMBIA1301::NtL0X3-Promoter (圖 4)。實施例3:鑒定煙草損傷誘導(dǎo)型啟動子的活性3.1農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化通過電擊轉(zhuǎn)化法,將在實施例2中構(gòu)建的表達Gus基因的植物重組表達載體PCAMBIA1301::NtL0X3-Promoter轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌中EHA105中,提取質(zhì)粒并進行PCR鑒定(圖5),確定質(zhì)粒真正的轉(zhuǎn)入到了農(nóng)桿菌中。取煙草種子,利用酒精和次氯酸鈉消毒后播種到發(fā)苗培養(yǎng)基上,等苗子長到0.5cm左右轉(zhuǎn)到移苗培養(yǎng)基上。待葉片長至5-8片葉的時候,選取綠色葉片,進行上述的轉(zhuǎn)入了 pCAMBIA1301::NtL0X3-Promoter的農(nóng)桿菌侵染,具體就是將28 V培養(yǎng)的農(nóng)桿菌,0D600=0.8,加入20mg/L的AS (乙酰丁香酮),利用葉盤轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化煙草,并通過選擇培養(yǎng)基進行篩選。3.2轉(zhuǎn)基因植株Gus表達活性分析取轉(zhuǎn)基因煙草Tl代葉片進行Gus組織化學(xué)染色。待轉(zhuǎn)基因煙草植株長至6片左右的葉片時,取一片葉進行傷害處理,將葉片的葉脈以及葉片邊緣進行損傷,然后進行Gus組織化學(xué)檢測。Gus染色液成分為:0.1M磷酸緩沖液,50mM K3Fe (CN) 6,50mM K4Fe (CN)6,0.5MNa2EDTA, l%Triton,20mM X-Gluc0將損傷后的葉片于Gus染色液中37°C浸泡過夜,然后用70%的乙醇漂洗,再次加入70%的乙醇脫色,在倒置顯微鏡下觀察染色情況,并拍照記錄。結(jié)果表明,Gus活性強的顯示出很深的藍色,無藍色表示Gus活性較低。在未損傷的葉片部位,檢測到Gus低水平表達或不表達,而在葉片的損傷部位,NtL0X3啟動子驅(qū)動Gus有明顯的高水平表達,損傷區(qū)域顯示很深的藍色。上述結(jié)果表明本發(fā)明的啟動子具有很強的損傷誘導(dǎo)的活性。對其它指示基因的研究也正式本發(fā)明篩選的啟動子具有損傷誘導(dǎo)的活性 。
權(quán)利要求
1.一種啟動子,其特征在于,所述的啟動子的核苷酸序列為SEQ ID N0:1。
2.權(quán)利要求1所述的啟動子在制備真核表達載體中的應(yīng)用。
3.一種真核表達載體,所述的真核表達載體的啟動子為權(quán)利要求1所述的啟動子。
4.一種在植物中表達外源基因的方法,是將外源目的基因?qū)霗?quán)利要求3所述的真核表達載體,轉(zhuǎn)化植物,并通過機械損傷方式來誘導(dǎo)外源基因的表達。
5.權(quán)利要求1所 述的啟動子是從煙草中制備的。
全文摘要
本發(fā)明提供一種損傷誘導(dǎo)型啟動子,其核苷酸序列為SEQ ID NO:1。該啟動子可以用來構(gòu)建真核表達載體,用于在植物中表達外源基因。本發(fā)明對煙草高效誘導(dǎo)型啟動子的分離鑒定,能夠為煙草生物反應(yīng)器的研發(fā)提供實驗和技術(shù)支撐。利用高效誘導(dǎo)型啟動子,以煙草作為生物反應(yīng)器,表達疫苗、抗體及其他藥用蛋白等,可突破傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)范疇,延伸到醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
文檔編號C12N15/113GK103205429SQ20131014606
公開日2013年7月17日 申請日期2013年4月24日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月24日
發(fā)明者解敏敏, 王根洪, 夏慶友, 孫玉合, 龔達平 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所