專利名稱：一種有效分離純化腫瘤細胞中雙微體的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種有效分離純化腫瘤細胞中雙微體的方法，屬染色體外DNA成分分離純化技術領域
背景技術：
雙微體(double minute chromosomes, DMs)是染色體外環(huán)狀成對、可自主復制的染色小體，無中心粒和端粒，常見于多種腫瘤細胞內，是基因擴增的主要細胞遺傳學標志，也是癌基因擴增的載體，它能為細胞生長提供選擇優(yōu)勢，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展和細胞耐藥性的形成密切相關。DMs常見于多種類型的人類實體瘤(原發(fā)瘤及轉移灶)、細胞系、滲出液或外周血淋巴細胞等。早在1962年，Spriggs等人在人結腸癌細胞和肺癌胸水轉移細胞中首先觀察到了 DMs的存在，此后在白血病及神經母細胞瘤、乳腺癌、宮頸癌、前列腺癌、胃腺癌、淋巴瘤、結腸癌、骨肉瘤、小細胞肺癌等其他人類腫瘤中也觀察到了 DMs。雙微體是基因擴增的載體，其上主要含有癌基因、耐藥基因和其他未知功能的連接序列，因此，DMs大致包括腫瘤自發(fā)產生、正常細胞中癌基因誘導產生以及腫瘤細胞耐藥后產生三大類。癌基因的擴增和過表達與多種腫瘤的演進顯著相關。雙微體攜帶多拷貝的癌基因，在腫瘤演進的晚期發(fā)揮重要影響，與腫瘤患者的不良預后相關，并且可應用于腫瘤轉移及復發(fā)的監(jiān)測。同時，作為癌基因擴增的重要形式，雙微體的檢測對尋找基因治療的有效靶點尤為重要。針對雙微體的深入研究有可能分離出與腫瘤發(fā)生、進展、以及預后相關的新基因，獲得有價值的腫瘤分子標記物，為腫瘤患者的臨床診斷、治療、預后評鑒提供新的靶點，這對腫瘤遺傳學的發(fā)展及其臨床應用具有重要作用。更有意義的是，去除腫瘤細胞中存在的雙微體，消除雙微體上癌基因為腫瘤細胞提供的生長優(yōu)勢和耐藥性，將對腫瘤的治療和藥物抵抗具有重要意義，是臨床腫瘤治療的一種有效手段。在基因擴增研究的早期階段，科研人員應用Southern印記雜交、熒光原位雜交技術(FISH)已在一些腫瘤中成功鑒定出發(fā)生擴增的區(qū)域。隨著生物學技術的日新月異，目前已有多種技術被應用到擴增基因的鑒定，如fiber-FISH技術和比較基因組雜交(comparative genomic hybridization, CGH)。CGH技術能顯示腫瘤細胞中擴增序列的染色體起源，但并不能區(qū)分染色體外遺傳結構-DMs上發(fā)生的擴增與染色體內基因組DNA的擴增，且當擴增子很小、拷貝數較低或是樣品存在正常細胞污染時CGH技術難以檢測擴增序列。為進一步了解DMs上擴增基因的組成、功能、與特定腫瘤發(fā)生發(fā)展的關系及與腫瘤耐藥機制的相關性，DMs的分離與純化顯得至關重要。自從1962年發(fā)現DMs以來，由于普通的分子生物學技術不能簡便、高效地獲取DMs，致使DMs的結構及組成研究一直進展緩慢。DMs研究的滯后很大程度上是由于缺乏有效的分離手段。在以往 的研究中，差速離心(differential gradient centrifugation)、流式細胞分選術(fluorescence activated cell sorting)、通過誘導S期細胞核出芽及微核形成選擇性的捕獲DMs、脈沖場凝膠電泳(pulsed-field electrophoresis)等手段都曾應用于DMs的分離和純化。上述幾種方法各具特點:流式細胞分選術可大量高效獲取DMsJM其不足之處是對實驗材料的細胞分散度要求較高，不適用于聚集性強的細胞系；此法主要根據熒光信號及染色體數目多少判斷DMs，DMs純度極易受染色體斷裂形成的小片段干擾。通過誘導S期細胞核出芽及微核形成選擇性捕獲DMs方法的主要技術是離心，簡便易操作，可被大多數臨床及基礎研究實驗室采用，但缺點是多次離心又會對染色體完整性造成不可避免的外力損傷；研究者應用低濃度的羥基脲(HU)誘導產生雙微體型微核，由于不嚴格要求樣本富含雙微體或附加體，使得此方法同樣適用于低DMs發(fā)生率、低擴增水平的細胞系，并且不同細胞系的微核化效果往往也存在較大差異；同時，不能排除大小相近的染色體片段對DMs純度的影響。脈沖場凝膠電泳操作簡單，亦可實現大量、高效收集DMs的目的，此手段與其他幾種方法相比可獲得較大、較完整的DMs，但該方法的不足之處是操作相對復雜，涉及的成敗因素較多，如完整染色體DNA的制備、不同規(guī)格瓊脂糖的選擇、瓊脂糖濃度、電壓大小和脈沖時間等，最難克服的障礙也是無法避免染色體基因組DNA的污染?？傊陨戏椒ǘ夹枰罅康募毎鳛槠鹗疾牧?，并且在樣品制備及分離過程中不可避免地會有染色體斷裂形成的小片段或是與DMs大小相近的染色體、標記染色體等混ADMs中，嚴重干擾DMs的純度，對于部分實驗如測序分析等無法滿足進一步研究的需要。染色體顯微切割技術是細胞遺傳學與分子遺傳學相結合的一項橋梁技術。1981年，德國的歐洲分子生物學實驗室(European Molecular Biology Laboratory, EMBL)的Scaleghe等首次應用染色體微切割技術，成功分離并克隆了果蠅多線X染色體的特定區(qū)域，并通過蛋白酶消化、酚抽提、EcoR I酶切進行重組克隆。此后，染色體微切割和微克隆方法被廣泛應用于鼠、人等 多物種的染色體特定區(qū)域的分離及克隆，但當時所切割的染色體DNA量少，通常需切割上百條染色體才能滿足研究需求。1989年，Ludecke等人報道了用微切割技術分離人類G帶染色體并結合PCR擴增，對切取的片段進行體外擴增和微克隆，從而使該技術取得了突破性進展。Melters等1992年報道了染色體微切割技術，并通過DOP-PCR擴增切割的染色體片段，熒光標記后作為Micro-FISH探針；其重大突破在于在PCR擴增過程中引入簡并引物，在減少工作量的同時，還解決了探針片段受酶切位點限制、文庫不全和部分序列高度富集的現象。此后Guan等又在此基礎上做出改進，在PCR前加入拓撲異構酶I，對DNA片段進行預處理以松弛超螺旋，這使切割分離的染色體片段可以產生更多的MiCT0-FISH探針，既降低了工作強度又減少了污染機會，提高了擴增效率。通常，只要切割1-5個拷貝的靶片段即可滿足實驗的需要。經過對多種腫瘤細胞中DMs的分離鑒定，發(fā)明人發(fā)現染色體微切割技術可成功地從染色體中期分裂相中剝離、收集較高純度的DMs。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的為提供一種有效分離純化腫瘤細胞中雙微體的方法，包括以下步驟:(I)選擇含有雙微體腫瘤細胞的實驗材料(2)腫瘤細胞中期染色體標本制備在處于對數生長期的腫瘤細胞培養(yǎng)基中加入終濃度為0.05ug/mL的秋水仙素，37°C條件下繼續(xù)培養(yǎng)一定時間，1000r/min離心8min收集細胞沉淀，棄上清，輕彈離心管底部將細胞制成懸液，加入9mL37°C預熱的0.075mol/L KC1，37°C低滲約13min后，逐滴加入ImL新鮮配制的固定液,輕輕混勻懸液；1600r/min離心7min,棄去上清,加入固定液至IOmL, 1600r/min離心7min,再用新鮮配制的固定液將細胞沉淀洗兩次,根據細胞沉淀的多少留l_2mL的上清液制備細胞懸液并滴片，自然風干，Giemsa染液染色3 5min，晾干后于顯微鏡下進行染色體分析，觀察細胞遺傳學特征，并隨機選取50個中期分裂相進行雙微體計數，其中所述的固定液是甲醇與冰醋酸的體積比為3:1 ；(3)染色體顯微切割和DOP-PCR將染色體懸液滴在蓋玻片上，制備新鮮的染色體標本，37°C老化3天；Giemsa染色5min后空氣干燥，37 °C溫育過夜；在光學顯微鏡下找到含有DMs的分裂相，用細玻璃針從腫瘤細胞中期分裂相中切割20個拷貝的DMs,轉移至5 μ L含IU Topoiosomerase I的收集液中，37°C溫預Ih后，96°C變性lOmin，進行8個循環(huán)的預擴增，預擴增設定的條件為94。V lmin, 30°C 2min，37 V 2min,每個循環(huán)中30 °C時加入0.3U Sequenase ;8個循環(huán)后，在上述體系中加入50 μ LPCR 混合物，PCR 混合物為 5 μ LlO XPCR buffer,5 μ L2mmol/L dNTPs、l μ LlOO μ mol/L LUNl引物、2U AmpliTaqLD酶、加ddH20至50 μ L，進行DOP-PCR 一擴擴增，擴增條件為:940C 5min ；94°C lmin,56°C lmin,72°C 1.5min，30 個循環(huán)；72°C 5min。取2 μ L —擴產物配制 DOP-PCR 二擴體系，包括 5 μ LlO X PCR buffer,5 μ L2mmol/L dNTPsUyL100ymol/L UNl 引物、2U AmpliTaqLD 酶、加 ddH20 至 50 μ L，進行二擴擴增，擴增條件為 940C 5min ；94°C lmin,56°C lmin,72°C 1.5min，設置為 25 個循環(huán)；72°C 5min。(4)熒光原位雜交驗證獲得雙微體的純度和特異性①PCR反應標記熒光探針取二擴DOP-PCR 反應 產物 luL，加入 4uL Random primer，95 °C IOmin 在 PCR 儀上進行探針標記，然后取出立即放在冰上2min ;再加入dNTP MIX1.6uL，加入Cy3_dUTP或Green-dUTP3.2uL,加入 Klenow fragment0.2uL ;37°C水浴避光孵育 3h,然后加入 IuL 終止
緩沖液。反應結束后，取標記好探針3uL，加入ssDNA3uL，加入Cot I DNA3uL，加入ddH2041uL,加入3mol/L ρΗ5.2的乙酸鈉5uL，混勻；加110uL_20°C放置的預冷乙醇，混勻后-80°C放置Ih沉淀DNA，14000Xg，4°C離心15min，棄上清，室溫避光干燥5min，用9uL雜交液重懸標記好的探針，于37°C水浴溶解l_2h ;備用。②熒光原位雜交將已制備好并經過老化處理的中期染色體標本進行預處理，標本上每個樣加IOOyTL Rnase工作液，去除RNA，蓋上蓋玻片，放在濕盒中，37°C孵育40min ;室溫2 X SSC洗3min ;75%、85%、100%梯度乙醇脫水各3min，吹干；每個樣加100 μ L胃蛋白酶工作液，蓋上蓋玻片，放在濕盒中，37°C孵育消化15min ;然后用IXPBS洗滌5min ;放入1%多聚甲醛溶液IOmin ;再用1父？85洗滌51^11 ;75%、85%、100%梯度乙醇脫水，各3min，吹風機吹干，其中所述的Rnase工作液為10mg/ml Rnase用2XSSC稀釋100倍；胃蛋白酶工作液為1%胃蛋白酶，用0.0lN鹽酸稀釋200倍；探針在75°C變性5min，立即置于冰上2min，而后37°C水浴15min_lh，進行預復性；
將玻片放入預熱的體積分數為70%的甲酰胺，75°C水浴變性3min ;在4°C預冷的2XSSC中洗兩次，每次洗3min ;并在75%、85%、100%梯度的乙醇中脫水，各3min，吹干，進行中期染色體標本的變性，之后，在玻片待雜交區(qū)加10 UL變性的探針混合物，立即蓋上蓋玻片，用rubber cement封片，玻片在濕盒內37°C雜交過夜,用鑷子除去rubber cement封片劑；將玻片放入44°C水浴預熱的體積分數為50%甲酰胺中，夾住玻片晃動，使蓋玻片脫落，開始計時15min,即在甲酰胺中浸泡15min,然后放入2 X SSC中洗兩次,每次洗3min,75%、85%、100%梯度乙醇脫水各3min，吹干，加LDAPI復染，24mmX32mm蓋玻片封片。避光保存或在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像，用安裝有CCD攝像頭的熒光顯微鏡觀察熒光信號，100倍鏡拍照，Metamorphy軟件采圖。進一步的，針對腫瘤自發(fā)產生、正常細胞中癌基因誘導產生以及腫瘤細胞耐藥后產生DMs選擇了 5個含有DMs的腫瘤細胞系作為研究材料，分別是人卵巢癌細胞系UACC-1598-4,人結腸癌細胞系NC1-H508、人結腸癌細胞系NC1-H716、鼠移植瘤細胞系T-NIH-3T3-SE1-UMTX耐藥人結腸癌細胞系HT-29-4。人卵巢癌細胞系UACC-1598-4，其親本人卵巢癌細胞系UACC-1598中自發(fā)地存在DMs，但每個細胞中的含量并不均等，少則沒有DMs，多則成百上千，變化區(qū)間非常大。故本發(fā)明人對UACC-1598細胞系進行單克隆培養(yǎng)，獲得多個由單個細胞分裂而得的細胞亞系。其中克隆4，即UACC-1598-4中DMs數目較多，基本上每個核型都含有DMs。人結腸癌細胞系NC1-H508、NCI_H716中皆自發(fā)地含有DMs，購自美國ATCC細胞庫。鼠移植瘤細胞系T-NIH-3T3-SE1-1是將癌基因SE1-1轉染模式細胞-小鼠胚胎成纖維細胞NIH-3T3，接種到裸鼠皮下，建立SE1-1致瘤模型，并將腫瘤在裸鼠體內傳代，應用原代培養(yǎng)、核型分析發(fā)現，SE1-1所致腫瘤細胞中存在一個細胞遺傳學上的重要改變，即出現了大量基因擴增的載體-雙微體，并且隨著腫瘤在裸鼠體內傳代次數的增加，DMs數目明顯增多。因此，這是一個由癌基因誘導產生DMs的良好實驗材料。MTX耐藥人結腸癌 細胞系HT-29-4中DMs為體外用藥物篩選、誘導產生。其親本人結腸癌細胞系HT-29本身并沒有雙微體的存在?；熕幬锇奔奏┻?methotrexate，MTX)是一種抗代謝類抗腫瘤藥，與二氫葉酸還原酶具有高度親和力，以競爭方式與其結合，使葉酸不能轉變?yōu)樗臍淙~酸，從而使脫氧鳥苷酸不能轉變?yōu)槊撗踵奏ず塑账幔罱K阻止DNA合成。發(fā)明人選的HT-29-4即以MTX作為誘導劑，誘導體外培養(yǎng)的人結腸癌HT-29細胞產生抗藥性，逐漸升高MTX濃度至lX10_4mol/L，細胞內出現雙微體。該細胞系為腫瘤耐藥后產生DMs的一個良好的模型。以上五個細胞系不僅包含了多種腫瘤類型以及目前腫瘤中所有來源的DMs，而且相互之間還具有一定的互補性。染色體微切割提供了一種從任何細胞遺傳學可分辨的區(qū)域分離DNA的直接方法。因此，在顯微鏡下即可分辨染色體DNA和染色體外的DMs DNA,從直觀上就可以輕松地避免基因組DNA的污染，得到高純度的DMs，非常適于DMs的分離純化。與以上幾種方法相比，這一技術更加直觀、高效，且特異性強。用該方法分離DMs既可避免其它染色體的污染，又能收獲高純度產物，而且起始所需材料少，在DMs數量較多的細胞中，僅需幾個分散良好的分裂相即可滿足分離DMs的需要。因此，該技術十分適于DMs的選擇性分離，特別適合于腫瘤樣品及短期培養(yǎng)的細胞。并且，此方法操作相對簡便，具體流程如下:腫瘤細胞染色體被制成中期涂片，研究者在顯微鏡下找到DMs，用極細的玻璃針尖(或是激光微切割)，將目的條帶從玻片上“刮”下來，通常切割10-20個拷貝的DMs即可獲得足夠的DMsDNA ;經拓撲異構酶I預處理DMs DNA, DOP-PCR技術擴增這些分離出來的DMs片段；將切割擴增的DNA進行純化后熒光標記制備FISH探針；將來源于DMs的探針雜交到含有DMs的腫瘤染色體分裂相中，可清晰地證實探針來源的真實性和驗證染色體微切割的特異性。此外，還可以將由此獲得的DMs探針雜交到正常染色體分裂相，進行逆向染色體涂染，用于研究DMs的來源、結構和形成機制等，對于確定染色體斷裂點的位置也具有十分重要的意義。同時，由于該方法獲得的DMs DNA純度很高，應用該方法獲得的DMs DNA還可用于制成DNA微克隆文庫，用于后續(xù)的DNA序列測定分析以及定位克隆的研究。本發(fā)明的方法通過對染色體微切割結合DOP-PCR、FISH技術的優(yōu)化可實現對雙微體簡便、高效、高純度的分離和特異性的驗證。將DOP-PCR分離的DMs DNA標記為探針，FISH技術與中期核型雜交，探針信號可特異性的覆蓋中期核型的所有DMs上，因而證明我們分離的DMs的純度高、特異性強，并為后續(xù)DMs相關實驗的開展奠定了堅實的基礎。其中，Giemsa染液:吉姆薩染液，用于細胞及染色體的染色；FISH技術:熒光原位雜交技術；Topoiosomerase 1:拓撲異構酶 I ;Sequenase:測序酶；DOP-PCR:簡并-PCR，是引物合成的時候在某個位置用兩種以上的堿基代替原來的單堿基滲入oligo鏈，獲得多種產物的PCR反應，可用來擴增未知的DNA序列，構建特異性DNA文庫；TE:TE 緩沖液，pH = `8.0，是 Tris+EDTA 緩沖液，組成濃度:10mM Tris-HCl 和 ImMEDTA ；Rnase工作液:RNA酶工作液，配置:10mg/ml Rnase，用2 X SSC稀釋100倍；2XSSC:檸檬酸鈉緩沖液，主要用于核酸雜交，不同濃度作用不同:常用2X，
0.5 X等，2 X SSC是一種高鹽洗液，可洗去部分非特異性結合的探針；IXPBS:磷酸鹽緩沖液，常用濃度為IX，用于清洗組織和細胞，維持滲透壓；rubber cement:橡皮泥,用于封閉蓋玻片；DAP1-Λ' , 6_ 二脈基-2-苯基Π引噪(4' , 6-diamidino_2-phenylindole),是一種能夠與DNA強力結合的熒光染料，常用于熒光顯微鏡觀測細胞和染色體；0.075mol/L KCl:0.075mol/L的氯化鉀溶液，是實驗室常用的低滲溶液；UNl引物:是簡并PCR中的一種簡并引物，序列為:UN1:5， -CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG-3，；ssDNA:單鏈DNA，用于核酸雜交過程中封閉非特異性的重復序列；Cot I DNA:鮭魚精DNA，用于核酸雜交過程中封閉非特異性的重復序列；Cy3-dUTP:熒光染料Cy3標記的dUTP，用于隨機引物法標記探針，Cy3是一種3H-吲哚菁類染料；Green-dUTP:突光染料Green標記的dUTP,用于隨機引物法標記探針；Random primer:隨機引物,商品化的已合成好的任意序列的引物,可擴增出多種產物；隨機引物可會在全基因組范圍內有結合位點；Klenow fragment:克列諾片段或稱克列諾酶,E.coli DNA聚合酶I經胰蛋白酶或枯草桿菌蛋白酶部分水解生成的C末端605個氨基酸殘基片段，該片段保留了 DNA聚合酶I的5' -3'聚合酶和3' -5'外切酶活性，但缺少完整酶的5' -3'外切酶活性。


圖1為人卵巢癌細胞系UACC-1598-4中期染色體標本(X 1000)和DMs計數圖；其中，觀察到細胞中期分裂相中存在大量DMs (染色體之間成對或單個出現的點狀物)，DMs計數均數為113.4 ;圖2為人結腸癌細胞系NC1-H508中期染色體標本(X 1000)和DMs計數圖；其中，觀察到不同的中期分裂相中，DMs數目差異較大，DMs數目多的核型可有上百個，DMs少的僅有幾個，而有的核型中沒有DMs，DMs計數均數為29.5 ；圖3為人結腸癌細胞系NC1-H716中期染色體標本(X1000)和DMs計數圖；其中，可觀察到細胞中期分裂相中大多數都存在上百個DMs，DMs計數均數為147.7 ；圖4為對鼠移植瘤細胞系T-NIH-3T3-SE1-1中期染色體標本(X 1000)和DMs計數圖；其中，觀察到細胞中期分裂相中含有較多DMs，各個分裂相中DMs數目存在差異，DMs計數均數為75.3 ；圖5為對MTX耐藥人結腸癌細胞系HT-29-4中期染色體標本(X 1000)和DMs計數圖；其中，觀察到細胞中期分裂相中存在DMs，DMs計數均數為33.3 ；圖6為染色體微切割雙微體示意圖；其中，切割前在顯微鏡下找到腫瘤細胞染色體中期核型中的DMs，紅色圈·內為DMs，然后用極細的玻璃針尖將其從玻片上“刮”下來，A:切割前，B:切割后，圈內為DMs ;圖7為DMs特異性探針與UACC-1598-4細胞中期分裂相雜交結果(X 1000)圖；其中，FISH結果顯示:細胞中的DMs上存在特異性的雜交信號，表明切割片段來源于DMs，A:Cy3標記DMs DNA為探針，B =DAPI染核，C:圖A，B的融合；圖8為DMs特異性探針與NC1-H508細胞中期分裂相雜交結果(X1000)圖；其中，FISH結果顯示:細胞中的DMs上存在特異性的雜交信號，表明切割片段來源于DMs，A:Cy3標記DMs DNA為探針，B =DAPI染核，C:圖A，B的融合；圖9為DMs特異性探針與NC1-H716細胞中期分裂相雜交結果(X1000)圖；其中，FISH顯示:細胞中的DMs上存在特異性的雜交信號，表明切割片段來源于DMs，A:Cy3標記DMs DNA為探針，B =DAPI染核，C:圖A，B的融合；圖10為DMs特異性探針與T-NIH-3T3-SE1-1細胞中期分裂相雜交結果(X 1000)圖；其中，FISH結果顯示:細胞中的DMs上存在特異性的雜交信號，表明切割片段來源于DMs, A =Green標記DMs DNA為探針，B =DAPI染核，C:圖A，B的融合；圖11為DMs特異性探針與HT-29-4細胞中期分裂相雜交結果(X 1000)圖；其中，FISH結果顯示:細胞中的DMs上存在特異性的雜交信號，表明切割片段來源于DMs，A:Cy3標記DMs DNA為探針，B =DAPI染核，C:圖A，B的融合。
具體實施例方式下面結合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內。試驗材料:人卵巢癌細胞系UACC-1598-4，其親本人卵巢癌細胞系UACC-1598中自發(fā)地存在DMs，但每個細胞中的含量并不均等，少則沒有DMs，多則成百上千，變化區(qū)間非常大。發(fā)明人對UACC-1598細胞系進行單克隆培養(yǎng)，獲得多個由單個細胞分裂而得的細胞亞系。其中克隆4，即UACC-1598-4中DMs數目較多，基本上每個核型都含有DMs。人結腸癌細胞系NC1-H508、NCI_H716中皆自發(fā)地含有DMs，購自美國ATCC細胞庫。鼠移植瘤細胞系T-NIH-3T3-SE1-1是將癌基因SE1-1轉染模式細胞-小鼠胚胎成纖維細胞NIH-3T3，接種到裸鼠皮下，建立SE1-1致瘤模型，并將腫瘤在裸鼠體內傳代，應用原代培養(yǎng)、核型分析發(fā)現，SE1-1所致腫瘤細胞中存在一個細胞遺傳學上的重要改變，即出現了大量基因擴增的載體-雙微體，并且隨著腫瘤在裸鼠體內傳代次數的增加，DMs數目明顯增多。因此，這是一個由癌基因誘導產生DMs的良好實驗材料。MTX耐藥人結腸癌細胞系HT-29-4中DMs為體外用藥物篩選、誘導產生。其親本人結腸癌細胞系HT-29本身并沒有雙微體的存在?；熕幬锇奔奏┻?methotrexate，MTX)是一種抗代謝類抗腫瘤藥，與二氫葉酸還原酶具有高度親和力，以競爭方式與其結合，使葉酸不能轉變?yōu)樗臍淙~酸，從而使脫氧鳥苷酸不能轉變?yōu)槊撗踵奏ず塑账?，最終阻止DNA合成。發(fā)明人所選的HT-29-4即以MTX作為誘導劑，誘導體外培養(yǎng)的人結腸癌HT-29細胞產生抗藥性，逐漸升高MTX濃度至lX10_4mol/L，細胞內出現雙微體。該細胞系為腫瘤耐藥后產生DMs的一個良好的模型。試驗試劑:所有使用·的試劑均為市售；探針標記試劑盒:購自invitrogen公司，貨號:18094-011,所含試劑有:Randomprimer、dNTP MIX、Klenow fragment、終止緩沖液、Control DNA 和 ddH20。實施例11、將實驗材料進行細胞培養(yǎng)1.1人卵巢癌細胞系UACC-1598-4用含10%胎牛血清的RPM1-1640全培養(yǎng)基，在5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中于37°C培養(yǎng)。1.2人結腸癌細胞系NC1-H508、NC1-H716用含10% FBS的RPM1-1640全培養(yǎng)基，在相同條件下培養(yǎng)。1.3鼠移植瘤細胞系T-NIH-3T3-SE1-1用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，在相同條件
下培養(yǎng)。1.4MTX耐藥人結腸癌細胞系HT-29-4用含10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基，在相同條件下培養(yǎng)。2、腫瘤細胞中期染色體標本的制備2.1人卵巢癌細胞系UACC-1598-4的染色體標本制備在處于對數生長期的人卵巢癌細胞UACC-1598-4培養(yǎng)基中加入終濃度為
0.05 μ g/mL的秋水仙素，37°C條件下繼續(xù)培養(yǎng)1.5h，1000r/min離心8min收集細胞沉淀。棄上清，輕彈離心管底部將細胞制成懸液，加入9mL37°C預熱的0.075mol/LKC1，37°C低滲13min后，逐滴加入ImL新鮮配制的固定液(甲醇:冰醋酸=3: I)，輕輕混勻懸液；1600r/min離心7min,棄去上清,加入固定液至IOmL, 1600r/min離心7min。再用新鮮配制的固定液將細胞沉淀洗兩次，留適量的上清液制備細胞懸液并滴片，自然風干。Giemsa染液染色3 5min，晾干后于顯微鏡下進行染色體分析，觀察細胞遺傳學特征。并隨機選取50個中期分裂相進行雙微體計數，GraphPad Prism5軟件作圖，見圖1。2.2人結腸癌細胞系NC1-H508的染色體標本制備在處于對數生長期的人結腸癌細胞系NC1-H508培養(yǎng)基中加入終濃度為0.05 U g/mL的秋水仙素，37°C條件下繼續(xù)培養(yǎng)1.5h，1000r/min離心8min收集細胞沉淀。其余步驟同上,見圖2。2.3人結腸癌細胞系NC1-H716的染色體標本制備在處于對數生長期的人結腸癌細胞系NC1-H716培養(yǎng)基中加入終濃度為0.05 U g/mL的秋水仙素，37°C條件下繼續(xù)培養(yǎng)lh，1000r/min離心8min收集細胞沉淀。其余步驟同上，見圖3。2.4鼠移植瘤細胞系T-NIH-3T3-SE1-1的染色體標本制備在處于對數生長期的鼠移植瘤細胞系T-NIH-3T3-SE1-1培養(yǎng)基中加入終濃度為
0.05 u g/mL的秋水仙素，37°C條件下繼續(xù)培養(yǎng)2.5h，1000r/min離心8min收集細胞沉淀。其余步驟同上，見圖4。2.5MTX耐藥人結腸癌細胞系HT-29-4的染色體標本制備在處于對數生長期的MTX耐藥人結腸癌細胞系HT-29-4培養(yǎng)基中加入終濃度為
0.05 u g/mL的秋水仙素，37°C條件下繼續(xù)培養(yǎng)lh，1000r/min離心8min收集細胞沉淀。其余步驟同上，見圖5。3、染色體顯微切割和DOP-PCR將染色體懸液滴在蓋玻片上，制備新鮮的染色體標本，37°C老化3天；Giemsa染色5min后空氣干燥，37 °C溫育過夜。在光學顯微鏡下找到含有DMs的分裂相，用細玻璃針分別從UACC-1598-4、NC1-H508、NC1-H716、T-NIH-3T3-SE1-1、HT-29-4 細胞中期分裂相中切割 20 個拷貝的 DMs，轉移至 5 u L 收集液( 含 IU Topoiosomerase I 及 5iimol/L UNl 引物,200 u mol/L dNTPs,20mmol/L MgC12,40mmol/L Tris-HCl (pH7.5), 50mmol/LNaCl)中。37°C溫預 Ih 后，96°C變性IOmin,進行8個循環(huán)的預擴增(94°C lmin, 30°C 2min, 37 °C 2min),每個循環(huán)中30°C時加A 0.3U Sequenase0然后，在上述體系中加入50 ii LPCR混合物，混合物體系為:5 ii LlOXPCRbuffer ；5iiL2mmol/L dNTPs ； I u LlOO u mol/L UNl 引物；2U AmpliTaqLD 酶，加 ddH20 至 50 y L，此步 PCR(—擴)，DOP-PCR 反應條件為:94°C 5min ；94°C lmin, 56°C lmin, 72°C 1.5min，設置為30個循環(huán)；72°C 5min。將2 ii L —擴產物加入 DOP-PCR 體系，體系為:5 u LlOXPCR buffer ；5 u L2mmol/L dNTPs ；lu L100umol/L UNl 引物；2U AmpliTaqLD 酶，加 ddH20 至 50 y L，此步 PCR(二擴)，DOP-PCR 反應條件為:94°C 5min ；94V lmin, 56°C lmin,72°C 1.5min，設置為 25 個循環(huán)；72°C 5min。4、熒光原位雜交(FISH)驗證獲得雙微體的純度和特異性4.1PCR反應標記突光探針
取二擴DOP-PCR 反應產物 luL，加入 4uL Random primer，95 °C IOmin 在 PCR 儀上進行探針標記，然后取出立即放在冰上2min ;再加入dNTP MIX1.6uL，加入Cy3_dUTP或Green-dUTP3.2uL,加入 Klenow fragment0.2uL ;37°C水浴避光孵育 3h,然后加入 IuL 終止
緩沖液。反應結束后，取標記好探針3uL，加入ssDNA3uL，加入Cot I DNA3uL, ddH2041uL,3mol/L乙酸鈉(ρΗ5.2)5uL，混勻；加110uL_20°C放置的預冷乙醇，混勻后_80°C放置Ih014000 X g，4°C離心15min，棄上清，室溫避光干燥5min，用9uL雜交液重懸標記好的探針，于37°C水浴溶解l_2h，備用。4.2熒光原位雜交(I) FISH 玻片處理:將已制備 好并經過老化處理的中期染色體標本進行預處理，標本上每個樣加IOOyL Rnase工作液，去除RNA，蓋上蓋玻片，放在濕盒中，37 °C孵育40min ;室溫2 X SSC3min ;75 %、85 %、100 %梯度乙醇脫水各3min，吹干；每個樣加100 μ L胃蛋白酶工作液，蓋上蓋玻片，放在濕盒中，37°C孵育消化15min ;然后用1\ 83洗滌51^11 ;放入1%多聚甲醛溶液IOmin ;再用I XPBS洗滌5min ;75%、85 %、100 %梯度乙醇脫水，各3min，吹風機吹干，其中所述的Rnase工作液為lOmg/mlRnase用2 X SSC稀釋100倍；胃蛋白酶工作液為1%胃蛋白酶，用0.0lN鹽酸稀釋200倍。(2)探針的變性:探針在75°C變性5min，立即置于冰上2min，而后37°C水浴45min，進行預復性。(3)中期染色體的變性:將玻片放入預熱的70%甲酰胺，75°C水浴變性3min ；在4°C預冷的2XSSC中洗兩次，每次洗3min ;并在75%、85%、100%梯度乙醇中脫水，各3min,吹干。(4)雜交:在玻片待雜交區(qū)加IOyL變性的探針混合物，立即蓋上蓋玻片，用rubber cement封片，玻片在濕盒內37°C雜交過夜。(5)洗片:用鑷子除去rubber cement封片劑；將玻片放入44°C水浴預熱的50%甲酰胺中，夾住玻片晃動，使蓋玻片脫落，計時15min。2 X SSC中洗兩次，每次洗3min，75 %、85%、100%梯度乙醇脫水各3min，吹干。加5μ LDAPI復染，蓋玻片(24_X32mm)封片。避光保存或在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。4.3FISH 圖像采集用安裝有CXD攝像頭的熒光顯微鏡觀察熒光信號，用63倍油鏡尋找目的區(qū)域，100倍鏡拍照，Metamorphy 軟件采圖，DMs 特異性探針與 UACC-1598-4、NC1-H508、NC1-H716、T-NIH-3T3-SE1-U HT-29-4細胞中期分裂相雜交結果見圖7-11。本發(fā)明應用染色體微切割分離了五個腫瘤細胞系中的DMs DNA，DOP-PCR擴增后利用熒光原位雜交對其特異性進行確認，發(fā)現在五種腫瘤細胞中都獲得了成功，從而獲得純度高可應用于后續(xù)研究的DMs，這為腫瘤細胞及抗性細胞中雙微體研究的進一步展開奠定了基礎?；驍U增的發(fā)生及演化是一個非常復雜的過程，與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展、預后以及耐藥性產生密切相關。作為基因擴增的一種重要形式，目前對DMs起源、形成、自主復制及穩(wěn)定存在等方面的了解尚淺，而且現已獲得的研究結果也呈現高度的多樣性與復雜性。因而成功分離DMs是DMs研究的關鍵，對進一步了解 DMs上擴增基因的組成和功能，發(fā)現新的與腫瘤相關的候選癌基因。
權利要求
1.一種有效分離純化腫瘤細胞中雙微體的方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)選擇含有雙微體腫瘤細胞的實驗材料 (2)腫瘤細胞中期染色體標本制備 在處于對數生長期的腫瘤細胞培養(yǎng)基中加入終濃度為O. 05μ g/mL的秋水仙素，37°C條件下繼續(xù)培養(yǎng)一定時間，1000r/min離心Smin收集細胞沉淀，棄上清，輕彈離心管底部將細胞制成懸液，加入9mL37°C預熱的O. 075mol/L KC1，37°C低滲約13min后，逐滴加入ImL新鮮配制的固定液，輕輕混勻懸液；1600r/min離心7min,棄去上清,加入固定液至IOmL,·1600r/min離心7min,再用新鮮配制的固定液將細胞沉淀洗兩次,根據細胞沉淀的多少留·l-2mL的上清液制備細胞懸液并滴片，自然風干，Giemsa染液染色3 5min，晾干后于顯微鏡下進行染色體分析，觀察細胞遺傳學特征，并隨機選取50個中期分裂相進行雙微體計數，其中所述的固定液是甲醇與冰醋酸的體積比為3 I ； (3)染色體顯微切割和DOP-PCR 將染色體懸液滴在蓋玻片上，制備新鮮的染色體標本，37°C老化3天；Giemsa染色5min后空氣干燥，37 °C溫育過夜； 在光學顯微鏡下找到含有DMs的分裂相，用細玻璃針從腫瘤細胞中期分裂相中切割20個拷貝的DMs,轉移至5 μ L含IU Topoiosomerase I的收集液中，37°C溫預Ih后,96°C變性IOmin,進行8個循環(huán)的預擴增,預擴增設定的條件為94°C lmin, 30°C 2min, 37°C 2min,每個循環(huán)中30°C時加入0. 3U Sequenase ;8個循環(huán)后，在上述體系中加入50 μ L PCR混合物,PCR 混合物為 5yL IOXPCR buffer,5 μ L2mmol/L dNTPsU μ L 100ymol/L UNl 引物、·2U AmpliTaqLD酶、加 ddH20至 50 μ L，進行DOP-PCR —擴擴增，擴增條件為94°C 5min ；94°Clmin,56°C lmin,72°C I. 5min，30 個循環(huán)；72°C 5min ； 取 2yL—擴產物配制 DOP-PCR 二擴體系，包括 5yL10XPCR buffer、5yL 2mmol/LdNTPsU μ L 100ymol/L UNl 引物、2U AmpliTaqLD 酶、加 ddH20 至 50 μ L，進行二擴擴增，擴增條件為 94°C 5min ；94°C lmin，56°C lmin，72°C I. 5min，設置為 25 個循環(huán)；72°C 5min ； (4)熒光原位雜交驗證獲得雙微體的純度和特異性 ①PCR反應標記突光探針 取二擴DOP-PCR反應產物luL，加入4uL Random primer, 95°C IOmin在PCR儀上進行探針標記，然后取出立即放在冰上2min ;再加入dNTP MIX1. 6uL，加入Cy3_dUTP或Green-dUTP·3. 2uL,加入Klenow fragment O. 2uL ;37°C水浴避光孵育3h,然后加入IuL終止緩沖液； 取標記好探針3uL,加入ssDNA 3uL,加入Cot I DNA 3uL,加入ddH20 41uL,加入3mol/LpH5. 2的乙酸鈉5uL，混勻；加110uL-20°C放置的預冷乙醇，混勻后_80°C放置Ih沉淀DNA，·14000 X g，4°C離心15min，棄上清，室溫避光干燥5min，用9uL雜交液重懸標記好的探針，于·37°C水浴溶解l_2h ;備用； ②熒光原位雜交 將已制備好并經過老化處理的中期染色體標本進行預處理，標本上每個樣加100 μ LRnase工作液，去除RNA，蓋上蓋玻片，放在濕盒中，37 °C孵育40min ;室溫2 X SSC洗3min ；·75%、85%、100%梯度乙醇脫水各311^11，吹干；每個樣加100 μ L胃蛋白酶工作液，蓋上蓋玻片，放在濕盒中，37°C孵育消化15min ;然后用IXPBS洗滌5min ;放入1%多聚甲醛溶液IOmin ;再用IXPBS洗滌5min ;75%、85%、100%梯度乙醇脫水，各3min，吹風機吹干，其中所述的Rnase工作液為10mg/ml Rnase用2X SSC稀釋IOO倍；胃蛋白酶工作液為1%胃蛋白酶，用0. OlN鹽酸稀釋200倍； 探針在75°C變性5min，立即置于冰上2min，而后37°C水浴15min_lh，進行預復性； 將玻片放入預熱的體積分數為70%的甲酰胺，75°C水浴變性3min ;在41預冷的·2X SSC中洗兩次，每次洗3min ;并在75%、85%、100 %梯度的乙醇中脫水，各3min，吹干，進行中期染色體標本的變性，之后，在玻片待雜交區(qū)加10 UL變性的探針混合物，立即蓋上蓋玻片，用rubber cement封片，玻片在濕盒內37°C雜交過夜,用鑷子除去rubber cement封片劑；將玻片放入44°C水浴預熱的體積分數為50%甲酰胺中，夾住玻片晃動，使蓋玻片脫落，開始計時15min,即在甲酰胺中浸泡15min,然后放入2 X SSC中洗兩次,每次洗3min,75%、85%、100%梯度乙醇脫水各3min，吹干，加5iiL DAPI復染，24mm X 32mm蓋玻片封片；避光保存或在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像，用安裝有CCD攝像頭的熒光顯微鏡觀察熒光信號，100倍鏡拍照，Metamorphy軟件采圖。
2.根據權利要求I所述的方法，其特征在于，步驟(I)所述的含有雙微體腫瘤細胞的實驗材料包括人卵巢癌細胞系UACC-1598-4、人結腸癌細胞系NCI-H508、人結腸癌細胞系NCI-H716、鼠移植瘤細胞系T-NIH-3T3-SEI-1或MTX耐藥人結腸癌細胞系HT-29-4。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種有效分離純化腫瘤細胞中雙微體的方法，是通過染色體微切割結合DOP-PCR、FISH技術的優(yōu)化實現對雙微體簡便、直觀、高效、高純度的分離和特異性的驗證。首先在顯微鏡下找到腫瘤細胞染色體中期核型中的DMs將其從玻片上“刮”下來；經拓撲異構酶I處理，DOP-PCR技術擴增分離出來的DMs DNA；將DOP-PCR產物標記為探針，FISH技術與中期核型雜交，探針信號可特異性覆蓋中期核型的所有DMs上。本發(fā)明的目的是提供一種雙微體簡單、高效的分離純化方法，進而提供一種適用于多種腫瘤細胞中雙微體分離純化的方法，屬染色體外DNA成分分離純化技術領域。
文檔編號C12Q1/68GK103255132SQ20131014649
公開日2013年8月21日 申請日期2013年4月24日 優(yōu)先權日2013年4月24日
發(fā)明者傅松濱, 張春玉, 白靜, 金焰, 孫冬琳 申請人:哈爾濱醫(yī)科大學