一種利用乳酸菌生物合成納米氧化鋅的方法及納米氧化鋅復(fù)合飼料添加劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵和納米【技術(shù)領(lǐng)域】，提供了一種利用乳酸菌生物合成納米氧化鋅的方法及納米氧化鋅復(fù)合飼料添加劑。本發(fā)明利用乳酸菌合成納米級(jí)氧化鋅后可開發(fā)一種全新的富含納米氧化鋅的飼料添加劑。這種添加劑應(yīng)用于乳豬飼料中，添加量低于1000ppm（以氧化鋅計(jì)）。因此除有效防止動(dòng)物鋅中毒，減少鋅對(duì)環(huán)境的污染之外，還能通過乳酸菌和氧化鋅的共同作用，有效防止斷奶豬仔的腹瀉，改善腸道健康水平，甚至可以全部或部分替代抗生素，減少抗生素殘留，提高食品安全性能。
【專利說明】一種利用乳酸菌生物合成納米氧化鋅的方法及納米氧化鋅復(fù)合飼料添加劑
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵和納米【技術(shù)領(lǐng)域】，更具體地，涉及一種利用乳酸菌生物合成納米氧化鋅的方法及納米氧化鋅復(fù)合飼料添加劑。
【背景技術(shù)】
[0002]納米氧化鋅具有獨(dú)特的性狀。納米氧化鋅是一種新型高功能精細(xì)無機(jī)產(chǎn)品，又稱為超微細(xì)氧化鋅，其粒徑一般小于lOOnm。由于顆粒尺寸的細(xì)微化，比表面積增加，使納米氧化鋅產(chǎn)生了其本體塊狀材料所不具備的表面效應(yīng)、小尺寸效應(yīng)和宏觀量子隧道效應(yīng)等。
[0003]納米氧化鋅可作為飼料添加劑。將納米氧化鋅作為飼料添加劑添加到動(dòng)物飼料中，其高生物活性和吸收率可以有效地減少腹瀉，降低料肉比，并且對(duì)環(huán)境無污染，是代替高劑量普通氧化鋅理想的飼料添加劑，在飼料行業(yè)的應(yīng)用前景廣闊。
[0004]傳統(tǒng)生產(chǎn)方法高能耗高污染。目前納米氧化鋅的工業(yè)化生產(chǎn)多采用沉淀法等傳統(tǒng)方法。這些傳統(tǒng)方法多需要高溫等高耗能條件，然而隨著科技的進(jìn)步，未來的納米材料生產(chǎn)技術(shù)將向低成本、低消耗、低污染的方向發(fā)展。
[0005]生物合成納米材料是“綠色”生產(chǎn)。生物合成納米材料的方法將成為未來納米材料生產(chǎn)技術(shù)的突破口，尋找新的具有較強(qiáng)吸附和還原能力的生物體并優(yōu)化其還原條件將是這種新技術(shù)的主要目標(biāo)。納米生物合成技術(shù)具有清潔、無毒、環(huán)境友好和可持續(xù)發(fā)展，反應(yīng)條件溫和可控，不需添加任何還原劑，效率高等優(yōu)點(diǎn)，是一種“綠色”生產(chǎn)方法，是目前納米合成領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。目前人們正嘗試以植物、植物細(xì)胞以及植物提取物，微生物等生物載體合成納米材料。
`[0006]微生物合成納米材料是可行的。微生物在自然界分布廣、易分離培養(yǎng)、生長繁殖快、結(jié)構(gòu)簡單且培養(yǎng)方法比較簡單，作為納米材料生物合成的載體具有很好的前景。如研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過礦化后的內(nèi)孢菌酵母細(xì)胞壁上沉積殼鞘狀的納米結(jié)構(gòu)二氧化硅，其厚度約150nm左右；以醋酸銅為原料，氫氧化鈉為沉淀劑，在傳統(tǒng)直接沉淀法的基礎(chǔ)上，以光合細(xì)菌培養(yǎng)液為分散劑，制得了納米氧化銅微粒，平均粒徑為40nm左右；從金、銀礦中篩選出對(duì)銀離子具有強(qiáng)吸附能力的乳酸菌，以硝酸銀為底物還原銀離子。
[0007]因此，利用乳酸菌合成納米氧化鋅、開發(fā)富含納米氧化鋅的乳酸菌微生態(tài)制劑具有重要的意義。但目前未見相應(yīng)技術(shù)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服傳統(tǒng)納米氧化鋅制備工藝中的不足，提供一種利用乳酸菌生物合成納米氧化鋅的方法。
[0009]本發(fā)明要解決的另一技術(shù)問題是提供所述方法合成的納米氧化鋅。
[0010]本發(fā)明要解決的還一技術(shù)問題是提供所述納米氧化鋅的應(yīng)用。
[0011]本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn):提供一種利用乳酸菌生物合成納米氧化鋅的方法，包括以下步驟:
S1.發(fā)酵培養(yǎng)乳酸菌，得到發(fā)酵液；
S2.在SI得到的發(fā)酵液中攪拌加入可溶性鋅鹽溶液底物，得到混 合液；
S3.調(diào)節(jié)混合液pH值到6.0~7.0，將混合液置于60~90°C的水浴中孵化10~60分
鐘；
S4.將S3孵化后的混合液恒溫陳化8~24小時(shí)；
S5.陳化后的混合液經(jīng)離心收集納米氧化鋅和乳酸菌體的混合物；
S6.將納米氧化鋅和乳酸菌體的混合物干燥后得到納米氧化鋅和乳酸菌體，將納米氧化鋅和乳酸菌體的混合物煅燒后得到單一的納米氧化鋅產(chǎn)品。
[0012]其中，SI所述乳酸菌發(fā)酵方式為常規(guī)發(fā)酵或高細(xì)胞密度發(fā)酵中的一種。
[0013]其中，SI所述的乳酸菌為發(fā)明人從斷奶乳豬糞便中篩選馴化后得到的鋅耐受性較高的唾液乳桿菌L3，所述唾液乳桿菌L3菌株于2013年04月08日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)是CCTCCM2013126 ;保藏單位的地址為:中國.武漢.武漢大學(xué)。也包括且不限于植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、其它市售的唾液乳桿菌、保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、糞腸球菌以及屎腸球菌、雙歧桿菌等對(duì)腸道有益的乳酸菌的一種或幾種。
[0014]SI所述發(fā)酵培養(yǎng)的條件優(yōu)選為:
種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基選用MRS液體培養(yǎng)基，pH值為6.2~6.4，121°C濕熱滅菌20~30min，冷卻至37°C備用；甘油菌種活化培養(yǎng)12~16h后，接入發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量為3%~5% (V/V)，培養(yǎng)10~12h后加入等體積量的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)8~10h，細(xì)胞數(shù)達(dá)IO9 ~1010CFU/ml。
[0015]所述MRS液體培養(yǎng)基的組成為:
蛋白胨log、牛肉膏10g、酵母浸膏5g、葡萄糖20g、K2HP042g、檸檬酸二胺2g、MgSO4.7Η200.58g、MnSO4.4Η200.25g、吐溫 801ml、乙酸鈉 10g、水 1000ml, ρΗ6.2 ~6.4，121。。滅菌 15min。
[0016]S2所述發(fā)酵液和可溶性鋅鹽溶液底物等體積量。
[0017]所述可溶性鋅鹽優(yōu)選氯化鋅(ZnCl2)或硫酸鋅(ZnSO4),鋅鹽濃度為0.1~1.0M。濃度優(yōu)選為0.35M。
[0018]S3所述水浴的溫度優(yōu)選為80°C，加熱時(shí)間優(yōu)選為25min。
[0019]S4所述陳化的溫度為37°C，陳化時(shí)間為9小時(shí)。
[0020]優(yōu)選地，S5所述離心的條件為3500rpm, 20min。
[0021]優(yōu)選地，S6所述干燥條件為60~90°C。更為優(yōu)選地，S6所述干燥條件為80°C恒溫干燥箱干燥24h。獲得富納米氧化鋅、乳酸菌細(xì)胞及其代謝產(chǎn)物的混合物，可作為飼料添加劑。
[0022]優(yōu)選地，S6所述煅燒條件為500~600°C。更為優(yōu)選地，S6所述煅燒條件為于550°C煅燒lh。乳酸菌細(xì)胞及其他有機(jī)物均被灰化，獲得更均一的納米氧化鋅，用途更加廣泛。
[0023]本發(fā)明提供所述方法制備得到的納米氧化鋅。
[0024]本發(fā)明同時(shí)提供所述納米氧化鋅的應(yīng)用，可作為一種全新的鋅源添加在禽類或者豬的飼料中，尤其是添加于斷奶乳豬飼料中。添加量低于lOOOppm。
[0025]本發(fā)明的有益效果是:
本發(fā)明提供了一種新的制備方法，在乳酸菌發(fā)酵液中添加一定濃度的可溶性鋅鹽底物，經(jīng)過適宜工藝條件的孵化和陳化后得到含納米氧化鋅的乳酸菌混合液，乳酸菌是人和動(dòng)物胃腸道的一種共生菌，是人和動(dòng)物腸道有益菌是共認(rèn)安全(GRAS)的可直接被人和動(dòng)物食用的細(xì)菌，本發(fā)明采用乳酸菌合成納米氧化鋅乳酸菌，有效發(fā)揮乳酸菌作為益生菌的重要作用，發(fā)揮提高營養(yǎng)物質(zhì)利用率、預(yù)防和治療疾病、綜合調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫機(jī)能等方面功倉泛。
[0026]本發(fā)明開發(fā)得到富含納米氧化鋅的乳酸菌微生態(tài)制劑。本發(fā)明利用乳酸菌合成納米級(jí)氧化鋅后可開發(fā)一種全新的富含納米氧化鋅的飼料添加劑。這種添加劑應(yīng)用于乳豬飼料中，添加量低于1000ppm (以氧化鋅計(jì))。因此除有效防止動(dòng)物鋅中毒，減少鋅對(duì)環(huán)境的污染之外，還能通過乳酸菌和氧化鋅的共同作用，有效防止斷奶豬仔的腹瀉，改善腸道健康水平，甚至可以全部或部分替代抗生素，減少抗生素殘留，提高食品安全性能。
[0027]本發(fā)明在乳酸菌轉(zhuǎn)化合成納米氧化鋅過程中，通過精確確定鋅鹽底物濃度、孵化的水浴溫度、孵化時(shí)溶液的PH值、孵化時(shí)間和陳化的時(shí)間，得到形態(tài)分布均勻、粒徑在IOOnm左右的納米氧化鋅和乳酸菌混合產(chǎn)物，并以此為基礎(chǔ)制備由納米氧化鋅和乳酸菌細(xì)胞及代謝產(chǎn)物組成的飼料添加劑。
[0028]本發(fā)明提供的常溫干燥后乳酸菌生物合成的納米氧化鋅、細(xì)胞和代謝產(chǎn)物的混合物可作為一種全新的鋅源添加在斷奶乳豬飼料中，替代普通氧化鋅，添加量只有普通氧化鋅的二分之一或更低，從而改善斷奶豬仔的腸道功能，有效防止腹瀉；同時(shí)，大大降低由于大劑量添加普通氧`化鋅導(dǎo)致的嚴(yán)重的環(huán)境污染。
[0029]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)勢(shì):
(I)本發(fā)明將乳酸菌和納米氧化鋅兩種物質(zhì)有機(jī)結(jié)合，即作為目前普通氧化鋅的替代品，使用量小，在改善乳豬腸道功能防止腹瀉的同時(shí)也有效防止鋅中毒，以及普通氧化鋅對(duì)環(huán)境造成的污染。
[0030](2)本發(fā)明提供的納米氧化鋅具有很高的光催化活性，能自行分解出自由移動(dòng)的帶負(fù)電的電子(e)，同時(shí)留下帶正電的空穴(h)，形成空穴-電子對(duì)，空穴可以激活氧和氫氧根，使吸附于其上的水和空氣變成活性的氧和氫氧根，從而具有很強(qiáng)的氧化還原作用，能損傷細(xì)菌的細(xì)胞膜而達(dá)到殺滅細(xì)菌的作用。
[0031](3)本發(fā)明利用乳酸菌生物合成納米級(jí)氧化鋅，與現(xiàn)有傳統(tǒng)方法相比，本發(fā)明能耗低，簡單易行，達(dá)到節(jié)能減排、綠色生產(chǎn)的目的。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0032]圖1為實(shí)施例1利用唾液乳桿菌L3生物方法制備的納米氧化鋅煅燒后產(chǎn)品透射電鏡圖。
[0033]圖2為實(shí)施例2利用植物乳桿菌生物制備的納米氧化鋅煅燒后產(chǎn)品透射電鏡圖?！揪唧w實(shí)施方式】
[0034]下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明，除非特別說明，本發(fā)明采用的原料和方法、設(shè)備為本【技術(shù)領(lǐng)域】常規(guī)的原料、方法和設(shè)備。
[0035]實(shí)施例1
利用發(fā)明人與2011年06月從斷奶乳豬糞便中篩選馴化后得到的高耐鋅的唾液乳桿菌L3生物合成的納米氧化鋅產(chǎn)品制備方法包括如下步驟:所述高耐鋅的唾液乳桿菌L3菌株于2013年04月08日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)是CCTCCM2013126。 [0036]S1.乳桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)。種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基選用MRS液體培養(yǎng)基，pH值為6.2~6.4，121 °C濕熱滅菌20~30min，冷卻至37°C備用。甘油菌種活化培養(yǎng)12~16h后，接入發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量為3%~5% (V/V)，培養(yǎng)IOh后加入等體積量的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)8h，細(xì)胞數(shù)達(dá)109CFU/ml，得到發(fā)酵液；
S2.SI培養(yǎng)結(jié)束后邊攪拌邊向發(fā)酵液中緩慢加入等體積量的0.35MZnCl2溶液。
[0037]S3.調(diào)節(jié)混合液pH值到6.0，將上述混合液置于80°C水浴中加熱25min進(jìn)行孵化。
[0038]S4.孵化結(jié)束后放入37°C恒溫箱陳化9h。
[0039]S5.陳化后離心收集菌體和納米氧化鋅沉淀物。
[0040]S6.離心產(chǎn)物80°C恒溫干燥箱干燥24h，得到粉末樣品；將離心產(chǎn)物550°C煅燒lh，有機(jī)物完全灰化，得單一的納米氧化鋅，煅燒得到的單一納米氧化鋅透射電鏡圖見附圖1所示。
[0041]乳酸菌在較高鋅離子環(huán)境下其菌體細(xì)胞壁上吸附有鋅結(jié)晶體。通過精確限定和控制底物濃度、孵化時(shí)間、孵化溫度以及陳化時(shí)間，可實(shí)現(xiàn)控制菌體細(xì)胞壁上氧化鋅晶體的形成，研究發(fā)現(xiàn)在0.35MZnCl2底物濃度、80°C水浴孵化溫度、25min孵化時(shí)間以及恒溫陳化時(shí)間為9h時(shí)得到的氧化鋅晶體粒徑在50nm左右，且晶體形狀均勻。
[0042]實(shí)施例2
利用植物乳桿菌(購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心)制備納米氧化鋅步驟如下:S1.植物乳桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)。甘油菌種活化培養(yǎng)16~24h后，接入發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量為3%~5%V/V，培養(yǎng)14h后加入等量的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12h，細(xì)胞數(shù)達(dá)109CFU/ml。
[0043]S2.邊攪拌邊向發(fā)酵液中緩慢加入等量的0.35MZnCl2溶液。
[0044]S3.調(diào)節(jié)混合液pH值至6.0后置于80°C水浴中加熱25min進(jìn)行孵化。
[0045]S4.孵化后放入37°C恒溫箱陳化9h。
[0046]S5.陳化后離心收集菌體和納米氧化鋅沉淀物。
[0047]S6.離心產(chǎn)物于550°C煅燒lh，有機(jī)物完全灰化，得單一的納米氧化鋅。
[0048]對(duì)樣品進(jìn)行透射電鏡分析，樣品平均粒徑約為80nm。納米氧化鋅透射電鏡圖見附圖2所示。
[0049]實(shí)施例3
利用植物乳桿菌(購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心)制備納米氧化鋅步驟如下:
S1.植物乳桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)。甘油菌種活化培養(yǎng)16~24h后，接入發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量為3%~5%V/V，培養(yǎng)14h后加入等量的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12h，細(xì)胞數(shù)達(dá)109CFU/ml。
[0050]S2.邊攪拌邊向發(fā)酵液中緩慢加入等量的0.35MZnS04液。
[0051]S3.調(diào)節(jié)混合液pH值至6.0后置于80°C水浴中加熱25min進(jìn)行孵化。
[0052]S4.孵化后放入37°C恒溫箱陳化9h。
[0053]S5.陳化后離心收集菌體和納米氧化鋅沉淀物。[0054]S6.離心產(chǎn)物90°C恒溫干燥箱干燥24h，得到粉末樣品。
[0055]實(shí)施例4
利用嗜酸乳桿菌(購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心)生物合成的納米氧化鋅產(chǎn)品制備方法包括如下步驟:
51.乳桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)。種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基選用MRS液體培養(yǎng)基，pH值為6.2~6.4，121 °C濕熱滅菌20~30min，冷卻至37°C備用。甘油菌種活化培養(yǎng)12~16h后，接入發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量為3%~5% (V/V)，培養(yǎng)IOh后加入等體積量的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)8h，細(xì)胞數(shù)達(dá)109CFU/ml，得到發(fā)酵液；
52.SI培養(yǎng)結(jié)束后邊攪拌邊向發(fā)酵液中緩慢加入等體積量的0.35MZnCl2溶液。
[0056]S3.調(diào)節(jié)混合液pH值至6.0后置于80°C水浴中加熱25min進(jìn)行孵化。
[0057]S4.孵化結(jié)束后放入37°C恒溫箱陳化9h。
[0058]S5.陳化后離心收集菌體和納米氧化鋅沉淀物。
[0059]S6.離心產(chǎn)物80°C恒溫干燥箱干燥24h，得到粉末樣品。
[0060]實(shí)施例5
利用保加利亞乳桿菌制備納米氧化鋅步驟如下:
S1.保加利亞乳桿菌(購于廣東省微生物菌種保藏中心)的發(fā)酵培養(yǎng)。甘油菌種活化培養(yǎng)16~24h后，接入發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量為3%~5%V/V，培養(yǎng)14h后加入等量的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12h，細(xì)胞數(shù)達(dá)109CFU/ml。
[0061]S2.邊攪拌邊向發(fā)酵液中緩慢加入等量的0.35MZnCl2溶液。
[0062]S3.調(diào)節(jié)混合液pH值至6.0后置于80°C水浴中加熱25min進(jìn)行孵化。
[0063]S4.孵化后放入37°C恒溫箱陳化9h。
[0064]S5.陳化后離心收集菌體和納米氧化鋅沉淀物。
[0065]S6.離心產(chǎn)物于550°C煅燒lh，有機(jī)物完全灰化，得單一的納米氧化鋅。
[0066]對(duì)樣品進(jìn)行透射電鏡分析，樣品平均粒徑小于lOOnm。
[0067]實(shí)施例6
利用嗜熱鏈球菌制備納米氧化鋅步驟如下:
S1.嗜熱鏈球菌(購于廣東省微生物菌種保藏中心)的發(fā)酵培養(yǎng)。甘油菌種活化培養(yǎng)16~24h后，接入發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量為3%~5%V/V，培養(yǎng)14h后加入等量的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12h，細(xì)胞數(shù)達(dá)109CFU/ml。
[0068]S2.邊攪拌邊向發(fā)酵液中緩慢加入等量的0.35MZnCl2溶液。
[0069]S3.調(diào)節(jié)上述混合液pH值至6.0后置于80°C水浴中加熱25min進(jìn)行孵化。
[0070]S4.孵化后放入37°C恒溫箱陳化9h。
[0071]S5.陳化后離心收集菌體和納米氧化鋅沉淀物。
[0072]S6.離心產(chǎn)物于550°C煅燒lh，有機(jī)物完全灰化，得單一的納米氧化鋅。
[0073]對(duì)樣品進(jìn)行透射電鏡分析， 樣品平均粒徑小于lOOnm。
[0074]實(shí)施例7
利用糞腸球菌制備納米氧化鋅步驟如下:
S1.糞腸球菌(購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心)的發(fā)酵培養(yǎng)。甘油菌種活化培養(yǎng)16~24h后，接入發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量為3%~5%V/V，培養(yǎng)14h后加入等量的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12h，細(xì)胞數(shù)達(dá)109CFU/ml。
[0075]S2.邊攪拌邊向發(fā)酵液中緩慢加入等量的0.35MZnCl2溶液。
[0076]S3.調(diào)節(jié)上述混合液pH值至6.0后置于80°C水浴中加熱25min進(jìn)行孵化。
[0077]S4.孵化后放入37°C恒溫箱陳化9h。
[0078]S5.陳化后離心收集菌體和納米氧化鋅沉淀物。
[0079]S6.離心產(chǎn)物于550°C煅燒lh，有機(jī)物完全灰化，得單一的納米氧化鋅。
[0080]對(duì)樣品進(jìn)行透射電鏡分析，樣品平均粒徑小于lOOnm。
[0081]實(shí)施例8
利用屎腸菌制備納米氧化鋅步驟如下:
S1.屎腸球菌(購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心)的發(fā)酵培養(yǎng)。甘油菌種活化培養(yǎng)16~24h后，接入發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量為3%~5%V/V，培養(yǎng)14h后加入等量的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12h，細(xì)胞數(shù)達(dá)109CFU/ml。
[0082]S2.邊攪拌邊向發(fā)酵液中緩慢加入等量的0.35MZnCl2溶液。
[0083]S3.調(diào)節(jié)上述混合液pH值 至6.0后置于80°C水浴中加熱25min進(jìn)行孵化。
[0084]S4.孵化后放入37°C恒溫箱陳化9h。
[0085]S5.陳化后離心收集菌體和納米氧化鋅沉淀物。
[0086]S6.離心產(chǎn)物于550°C煅燒lh，有機(jī)物完全灰化，得單一的納米氧化鋅。
[0087]對(duì)樣品進(jìn)行透射電鏡分析，樣品平均粒徑小于lOOnm。
[0088]實(shí)施例9
利用雙歧桿菌制備納米氧化鋅步驟如下:
S1.雙歧桿菌(購于廣東省微生物菌種保藏中心)的發(fā)酵培養(yǎng)。甘油菌種活化培養(yǎng)16~24h后，接入發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量為3%~5%V/V，培養(yǎng)14h后加入等量的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12h，細(xì)胞數(shù)達(dá)109CFU/ml。
[0089]S2.邊攪拌邊向發(fā)酵液中緩慢加入等量的0.35MZnCl2溶液。
[0090]S3.調(diào)節(jié)混合液pH值至6.0后置于80°C水浴中加熱25min進(jìn)行孵化。
[0091 ] S4.孵化后放入37°C恒溫箱陳化9h。
[0092]S5.陳化后離心收集菌體和納米氧化鋅沉淀物。
[0093]S6.離心產(chǎn)物于550°C煅燒lh，有機(jī)物完全灰化，得單一的納米氧化鋅。
[0094]對(duì)樣品進(jìn)行透射電鏡分析，樣品平均粒徑小于lOOnm。
[0095]實(shí)施例10
利用普通市售的唾液乳桿菌制備納米氧化鋅步驟如下:
S1.唾液乳桿菌(購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心)的發(fā)酵培養(yǎng)。甘油菌種活化培養(yǎng)16~24h后，接入發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量為3%~5%V/V，培養(yǎng)14h后加入等量的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12h，細(xì)胞數(shù)達(dá)109CFU/ml。
[0096]S2.邊攪拌邊向發(fā)酵液中緩慢加入等量的0.35MZnC12溶液。
[0097]S3.調(diào)節(jié)上述混合液pH值至6.0后置于80°C水浴中加熱25min進(jìn)行孵化。
[0098]S4.孵化后放入37°C恒溫箱陳化9h。
[0099]S5.陳化后離心收集菌體和納米氧化鋅沉淀物。
[0100]S6.離心產(chǎn)物于550°C煅燒lh，有機(jī)物完全灰化，得單一的納米氧化鋅。[0101]對(duì)樣品進(jìn)行透射電鏡分析，樣品平均粒徑小于lOOnm。
[0102]實(shí)施例11
本發(fā)明制備的實(shí)施例1中干燥后樣品進(jìn)行致病菌抑菌性能檢測(cè)。
[0103]分別以大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌作為指示菌，實(shí)施例1中的樣品與普通氧化鋅產(chǎn)品(天津市福晨化學(xué)試劑廠生產(chǎn))進(jìn)行抑菌性能的檢測(cè)試驗(yàn)對(duì)比，在含培養(yǎng)基試管中分別加入不同濃度的兩種產(chǎn)品，37°C搖床300r/min培養(yǎng)24h后采用吸光光度法測(cè)61Onm處各試管的OD值。與空白組對(duì)照，24h后OD值無明顯變化的試管其濃度為該產(chǎn)品的最小抑菌濃度。
[0104]表1為不同氧化鋅樣品對(duì)各致病菌的最小抑菌濃度表
【權(quán)利要求】
1.一種利用乳酸菌生物合成納米氧化鋅的方法，其特征在于，包括以下步驟: 51.發(fā)酵培養(yǎng)乳酸菌，得到發(fā)酵液； 52.在SI得到的發(fā)酵液中攪拌加入可溶性鋅鹽溶液底物，得到混 合液； 53.調(diào)節(jié)混合液pH值到6.0-7.0,將混合液置于60~90°C的水浴中孵化10~60分鐘； 54.將S3孵化后的混合液恒溫陳化8~24小時(shí)； 55.陳化后的混合液經(jīng)離心收集納米氧化鋅和乳酸菌體的混合物； 56.將納米氧化鋅和乳酸菌體的混合物干燥后得到納米氧化鋅和乳酸菌體，將納米氧化鋅和乳酸菌體的混合物煅燒后即得到單一的納米氧化鋅產(chǎn)品； 其中，SI所述的乳酸菌為唾液乳桿菌、植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、鼠李糖 乳桿菌、保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、糞腸球菌、屎腸球菌或雙歧桿菌中的一種或幾種； S2所述發(fā)酵液和可溶性鋅鹽溶液底物等體積量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述利用乳酸菌生物合成納米氧化鋅的方法，其特征在于，所述乳酸菌為唾液乳桿菌L3，所 述唾液乳桿菌L3菌株于2013年04月08日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)是CCTCC M 2013126。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述利用乳酸菌生物合成納米氧化鋅的方法，其特征在于，S2所述可溶性鋅鹽溶液濃度為0.1~1.0M。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述利用乳酸菌生物合成納米氧化鋅的方法，其特征在于，S2所述可溶性鋅鹽為氯化鋅或硫酸鋅。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述利用乳酸菌生物合成納米氧化鋅的方法，其特征在于，S3所述水浴的溫度為80°C，加熱時(shí)間為25min。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述利用乳酸菌生物合成納米氧化鋅的方法，其特征在于，S4所述陳化的溫度為37°C，陳化時(shí)間為9小時(shí)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述利用乳酸菌生物合成納米氧化鋅的方法，其特征在于，S6所述干燥條件為80~100°C恒溫干燥箱干燥20~24h ；S6所述煅燒條件為于550°C煅燒lh。
8.權(quán)利要求1~7任一項(xiàng)所述方法制備得到的納米氧化鋅產(chǎn)品。
9.權(quán)利要求8所述納米氧化鋅產(chǎn)品作為禽類或豬飼料的添加劑應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，應(yīng)用于制備斷奶乳豬飼料添加劑。
【文檔編號(hào)】C12R1/225GK103602707SQ201310147492
【公開日】2014年2月26日 申請(qǐng)日期:2013年4月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年4月25日
【發(fā)明者】胡文鋒, 劉小陽, 龐旭, 吳俊松, 鄭育鵬, 林曉慧 申請(qǐng)人:胡文鋒, 蘇州萬生源生物科技有限公司, 生物源生物技術(shù)（深圳）有限公司