GsHSFB2b蛋白在培育耐逆性轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種GsHSFB2b蛋白在培育耐逆性轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了如下1）-3）中任一種物質(zhì)在調(diào)控植物耐逆性或培養(yǎng)耐逆性植物中的應(yīng)用：1）蛋白GsHSFB2b；2）編碼蛋白GsHSFB2b的DNA分子；3）含有編碼蛋白GsHSFB2b的DNA分子的重組載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌；所述蛋白GsHSFB2b的氨基酸序列為序列表中的序列2。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明從野生大豆中克隆了一個HSF家族的轉(zhuǎn)錄因子基因GsHSFB2b，該基因?qū)ε嘤湍嬷参锲贩N，特別是培育耐非生物脅迫作物、林草等新品種具有重要的理論及實際意義。
【專利說明】GsHSFB2b蛋白在培育耐逆性轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種GsHSFB2b蛋白在培育耐逆性轉(zhuǎn)基因植 物中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 環(huán)境中物理化學(xué)因素的變化，例如干旱、鹽堿、低溫等對植物的生長發(fā)育有重要 影響，嚴重時會造成農(nóng)作物大規(guī)模減產(chǎn)，培育耐逆性作物是種植業(yè)的主要目標之一。目前， 基因工程育種已經(jīng)成為增強作物耐逆性的重要方法之一。高等植物細胞有多種途徑應(yīng)答環(huán) 境中的各種逆境脅迫，其涉及一批與植物的耐逆性相關(guān)蛋白。這些蛋白主要可分為兩類，一 類是調(diào)控蛋白，例如蛋白激酶、轉(zhuǎn)錄因子等；一類是效應(yīng)蛋白，例如滲透調(diào)節(jié)劑：甜菜堿、脯 氨酸、甘油等及轉(zhuǎn)運蛋白、水孔蛋白等。
[0003] 1962年Rittossa在研究果蠅唾液腺在熱環(huán)境下的蛋白質(zhì)時發(fā)現(xiàn)了熱激蛋白。 之后發(fā)現(xiàn)熱激蛋白家族廣泛存在于微生物、植物和動物中，其成員，例如，HSP60、HSP70及 HSP90作為分子伴侶，幫助其它蛋白正確折疊及胞內(nèi)分布等，以維持該蛋白的正常功能。熱 激蛋白參與多種生物學(xué)過程。自1982年在冷泉港召開了第一次熱激蛋白研討會之后，對于 熱激蛋白的研究越來越受到關(guān)注。熱激蛋白的表達受熱激轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，熱激轉(zhuǎn)錄因子 是一個保守的家族，可以和熱激蛋白基因中的特異熱激元件結(jié)合，調(diào)控其轉(zhuǎn)錄。
[0004] 根據(jù)基本結(jié)構(gòu)的差異，熱激因子可分為三類，HSFA、HSFB和HSFC。熱激因子在擬 南芥中研究的較詳盡。擬南芥熱激因子所參與的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)是多變而復(fù)雜的，已經(jīng)初步闡明 了 21個熱激因子所參與的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。早先的研究表明編碼熱激蛋白和熱激因子的基因均 受高溫誘導(dǎo)，與耐高溫相關(guān)。隨著大豆基因組測序的完成，在栽培大豆基因組中聚類了 25 個熱激因子，已經(jīng)鑒定了與耐非生物脅迫相關(guān)和與抗生物脅迫相關(guān)的成員。大豆起源于我 國。我國有最豐富的野生大豆資源。已從黑龍江野生大豆資源中篩選到2個耐2. 5%鹽的 材料，編號為Y20和Y55。從耐鹽材料中發(fā)掘耐鹽相關(guān)基因，可為培育耐鹽大豆提供基因資 源。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的一個目的是提供如下1) _3)中任一種物質(zhì)的新用途。
[0006] 本發(fā)明提供了如下1 )_3)中任一種物質(zhì)在調(diào)控植物耐逆性或培育耐逆性植物中的 應(yīng)用：1)蛋白GsHSFB2b ;2)編碼蛋白GsHSFB2b的DNA分子；3)含有編碼蛋白GsHSFB2b的 DNA分子的重組載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌；
[0007] 所述蛋白GsHSFB2b的氨基酸序列為序列表中的序列2。
[0008] 上述應(yīng)用中，所述編碼蛋白GsHSFB2b的DNA分子的核苷酸序列為序列表中的序列 1 ;
[0009] 所述含有編碼蛋白GsHSFB2b的DNA分子的重組載體為將所述編碼蛋白GsHSFB2b 的DNA分子插入表達載體中，得到表達蛋白GsHSFB2b的重組載體。
[0010] 在本發(fā)明的實施例中，表達載體為pBin438,重組載體為將序列表中的序列1所示 的核苷酸插入pBin438的BamH I和ΚρηΙ酶切位點之間得到的載體。
[0011] 上述應(yīng)用中，調(diào)控植物耐逆性為提高植物耐逆性。
[0012] 上述應(yīng)用中，所述耐逆性為耐鹽性、耐干旱和/或耐低溫。
[0013] 上述應(yīng)用中，所述低溫為4°C ;所述植物為雙子葉植物或單子葉植物；所述雙子葉 植物具體為大豆。
[0014] 上述提高植物耐逆性具體體現(xiàn)為將編碼蛋白GsHSFB2b的DNA分子通過含有編碼 蛋白GsHSFB2b的DNA分子的重組載體導(dǎo)入植物中，得到轉(zhuǎn)基因毛狀根，在鹽脅迫、低溫脅迫 或干旱脅迫下，所述轉(zhuǎn)基因毛狀根的增長率大于與轉(zhuǎn)空載體毛狀根；其中，轉(zhuǎn)空載體毛狀根 為將pBin438轉(zhuǎn)入植物得到的轉(zhuǎn)空載體毛狀根。
[0015] 本發(fā)明的另一個目的是提供沉默或抑制植物中蛋白GsHSFB2b表達的物質(zhì)的新用 途。
[0016] 本發(fā)明提供的沉默或抑制植物中蛋白GsHSFB2b表達的物質(zhì)在降低植物耐逆性中 的應(yīng)用。
[0017] 上述應(yīng)用中，所述沉默或抑制植物中蛋白GsHSFB2b表達的物質(zhì)為重組載體，
[0018] 所述重組載體為將DNA分子1和DNA分子2均插入表達載體中，得到沉默或抑制 植物中蛋白GsHSFB2b表達的重組載體；所述DNA分子1的核苷酸序列（編碼序列）為序列 1的自5'末端第441-800位核苷酸；所述DNA分子2的核苷酸序列(編碼序列）為所述DNA 分子1的反向互補序列。
[0019] 在本發(fā)明的實施例中，表達載體為pZHOl，重組載體為將序列1的自5'末端第 441-800位核苷酸插入pZHOl載體的SacI和ΚρηΙ酶切位點，且將序列1的自5'末端第 441-800位核苷酸的反向互補序列插入pZHOl載體的Sail和Xbal位點間，得到的載體。
[0020] 上述應(yīng)用中，所述耐逆性為耐鹽性、耐干旱和/或耐低溫。
[0021] 上述應(yīng)用中，所述低溫為4°C ;所述植物為單子葉植物或雙子葉植物。所述雙子葉 植物具體為大豆。
[0022] 上述降低植物耐逆性具體體現(xiàn)為將重組載體導(dǎo)入植物中，得到轉(zhuǎn)基因毛狀根，在 鹽脅迫、低溫脅迫或干旱脅迫下，所述轉(zhuǎn)基因毛狀根的增長率小于轉(zhuǎn)空載體毛狀根；其中， 轉(zhuǎn)空載體毛狀根為將PZH01轉(zhuǎn)入植物得到的轉(zhuǎn)空載體毛狀根。
[0023] 本發(fā)明的第三個目的是提供重組載體。
[0024] 本發(fā)明提供的重組載體，為將編碼蛋白GsHSFB2b的DNA分子插入表達載體中，得 到表達蛋白GsHSFB2b的重組載體；所述蛋白GsHSFB2b的氨基酸序列為序列表中的序列2 ; 所述編碼蛋白GsHSFB2b的DNA分子的核苷酸序列具體為序列表中的序列1。
[0025] 在本發(fā)明的實施例中，表達載體為pBin438,含有編碼蛋白GsHSFB2b的DNA分子的 重組載體為將序列表中的序列1所示的核苷酸插入pBin438的BamH I和ΚρηΙ酶切位點之 間得到的載體。
[0026] 本發(fā)明的第四個目的是提供重組載體。
[0027] 本發(fā)明提供的重組載體，為將DNA分子1和DNA分子2均插入表達載體中，得到沉 默或抑制植物中蛋白GsHSFB2b表達的重組載體；所述DNA分子1的核苷酸序列為序列1的 自5'末端第441-800位核苷酸；所述DNA分子2的核苷酸序列為所述DNA分子1的反向互 補序列。
[0028] 在本發(fā)明的實施例中，表達載體為pZHOl，重組載體為將序列1的自5'末端第 441-800位核苷酸插入pZHOl載體的SacI和ΚρηΙ酶切位點，且將序列1的自5'末端第 441-800位核苷酸的反向互補序列插入pZHOl載體的Sail和Xbal位點間，得到的載體。
[0029] 可用現(xiàn)有的植物表達載體構(gòu)建含有GsHSFB2b基因的重組載體。
[0030] 上述植物表達載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。所述植 物表達載體還可包含外源基因的3'端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號和任何其它參與 mRNA加工或基因表達的DNA片段。所述聚腺苷酸信號可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mRNA前體的 3'端，如農(nóng)桿菌冠癭瘤誘導(dǎo)（Ti)質(zhì)?；颍ㄈ珉僦铣擅窷os基因）、植物基因(如大豆貯 存蛋白基因）3'端轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)均具有類似功能。
[0031] 使用GsHSFB2b構(gòu)建重組植物表達載體時，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一 種增強型啟動子或組成型啟動子(如花椰菜花葉病毒（CAMV)35S啟動子、玉米的泛素啟動 子（Ubiquitin))，或組織特異表達啟動子(如種子特異表達的啟動子)，它們可單獨使用或 與其它植物啟動子結(jié)合使用。此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達載體時，還可使用增強 子，包括翻譯增強子或轉(zhuǎn)錄增強子，這些增強子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起 始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制 信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來 自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。
[0032] 為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所用植物表達載體進行 加工，如加入可在植物中表達的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因（GUS基因、 螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標記物(慶大霉素標記物、卡那霉素標記物等）或是抗 化學(xué)試劑標記基因(如抗除莠劑基因）等。
[0033] 轉(zhuǎn)化的細胞、組織或植物理解為不僅包含轉(zhuǎn)化過程的最終產(chǎn)物，也包含其轉(zhuǎn)基因 子代。
[0034] 本發(fā)明中所述的"多核苷酸"、"多核苷酸分子"、"多核苷酸序列"、"編碼序列"、"開 放閱讀框（0RF)"等包括單鏈或雙鏈的DNA和RNA分子，可包含一個或多個原核序列，cDNA 序列，包含外顯子和內(nèi)含子的基因組DNA序列，化學(xué)合成的DNA和RNA序列，以及有義和相 應(yīng)的反義鏈。
[0035] 本發(fā)明基因可通過如下方式導(dǎo)入宿主中：將本發(fā)明基因插入表達盒中，再將表達 盒通過植物表達載體、非致病自我復(fù)制的病毒或農(nóng)桿菌導(dǎo)入宿主。攜帶本發(fā)明基因的表達 載體可通過使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介 導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細胞或組織。
[0036] 轉(zhuǎn)入本發(fā)明基因的植物，可以在該物種中繁殖該基因，也可用常規(guī)育種技術(shù)將該 基因轉(zhuǎn)移進入相同物種的其它品種，特別包括商業(yè)品種中。
[0037] 本發(fā)明的基因可以在序列1的基礎(chǔ)上進行以下修飾，再導(dǎo)入宿主中，以達到更好 的表達效果：
[0038] 1)為了在轉(zhuǎn)基因植物中表達本發(fā)明核苷酸序列，本發(fā)明核苷酸序列可根據(jù)實際需 要進行修飾和優(yōu)化。如可根據(jù)受體植物所偏愛的密碼子，在保持本發(fā)明所述核苷酸序列編 碼的氨基酸的同時改變其密碼子以符合植物偏愛性。而且，優(yōu)化過程中，最好能使優(yōu)化后的 編碼序列中保持一定的GC含量，以最好地實現(xiàn)植物中導(dǎo)入基因的高水平表達，其中GC含量 可為35 %，優(yōu)選為多于45 %，更優(yōu)選為多于50 %，最優(yōu)選多于約60 %。
[0039] 2)為了翻譯的有效起始，可以修飾鄰近起始甲硫氨酸的基因序列。例如，利用在植 物中已知的有效的序列進行修飾。
[0040] 3)將本發(fā)明基因與各種植物表達的啟動子連接，以利于其在植物中的表達。所述 啟動子可包括組成型、誘導(dǎo)型、時序調(diào)節(jié)、發(fā)育調(diào)節(jié)、化學(xué)調(diào)節(jié)、組織優(yōu)選和組織特異性啟動 子。啟動子的選擇將隨著表達時間和空間需要而變化，而且也取決于靶物種。例如組織或 器官的特異性表達啟動子，根據(jù)需要受體在發(fā)育的什么時期而定。盡管證明了來源于雙子 葉植物的許多啟動子在單子葉植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，選擇雙子葉植 物啟動子用于雙子葉植物中的表達，單子葉植物的啟動子用于單子葉植物中的表達。
[0041] 優(yōu)選的組成型啟動子包括CaMV35S和19S啟動子。所述啟動子還可為來源于在大 多數(shù)細胞類型中表達的幾種肌動蛋白基因中的啟動子。另一個優(yōu)選的組成型啟動子為泛素 啟動子。上述啟動子還可為在根、木髓、葉或花粉中引導(dǎo)表達的啟動子，即組織特異性啟動 子。棉花核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶啟動子(美國專利US6, 040, 504)、水稻蔗糖合酶啟動 子(美國專利US5, 604, 121)、夜香樹黃化葉卷曲病毒啟動子（W001/73087)。
[0042] 化學(xué)誘導(dǎo)型啟動子可為Rab29A啟動子(美國專利US5, 614, 395)。
[0043] 4)將本發(fā)明基因與適合的轉(zhuǎn)錄終止子連接，也可以提高本發(fā)明基因的表達效率。 例如來源于CaMV的tml，來源于rbcS的E9。任何已知在植物中起作用的可得到的終止子 都可以與本發(fā)明基因進行連接。
[0044] 5)可向本發(fā)明基因中引入增強子序列，如內(nèi)含子序列（例如來源于Adhl和 bronzel)和病毒前導(dǎo)序列(例如來源于TMV, MCMV和AMV)。
[0045] 在實際操作中，也可以將本發(fā)明基因進行細胞靶向定位?？衫帽绢I(lǐng)域現(xiàn)有的技 術(shù)實現(xiàn)。例如，將來源于靶向細胞器的靶基因序列與本發(fā)明基因序列融合，再導(dǎo)入植物細胞 中，就可定位了。
[0046] 上述重組載體中的出發(fā)載體可根據(jù)所使用的轉(zhuǎn)化技術(shù)及靶植物物種的特性進行 選擇。上述選擇可體現(xiàn)在載體中的抗性標記的選擇上。對于一些靶物種，可以優(yōu)選不同的 抗生素或除草劑選擇性標記。通常用在轉(zhuǎn)化中的選擇性標記包括賦予對卡那霉素和相關(guān)抗 生素抗性的nptll基因，賦予對除草劑膦絲菌素抗性的bar基因，，賦予對抗生素潮霉素抗 性的hph基因，和賦予對methatrexate抗性的dhfr基因，賦予對草甘磷抗性的EPSPS基因， 和提供代謝甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶基因。
[0047] 在優(yōu)選的實施方式中，將本發(fā)明的核苷酸序列直接轉(zhuǎn)化到質(zhì)體基因組中。質(zhì)體轉(zhuǎn) 化的主要優(yōu)點是質(zhì)體通常不需要實質(zhì)修飾就能表達細菌基因，并且質(zhì)體能表達單啟動子控 制下的多個開放讀框。通過同源重組將基因插入每個植物細胞中存在的所有幾千個環(huán)形質(zhì) 體基因組拷貝中的質(zhì)體表達利用了拷貝數(shù)大大高于核表達基因的優(yōu)勢，使得表達水平可以 容易地超過總可溶植物蛋白質(zhì)的10%。將本發(fā)明基因插入到質(zhì)體靶向載體中，并且轉(zhuǎn)化進 入期望的植物宿主質(zhì)體基因組中。獲得了對于含有本發(fā)明核苷酸序列的質(zhì)體基因組而言屬 同質(zhì)的植物，該植物具有高水平地表達核苷酸序列的能力。
[0048] 本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明從野生大豆中克隆了一個HSF家族的轉(zhuǎn)錄因子基因 GsHSFB2b (Glymallg02800.1)，研究發(fā)現(xiàn)，GsHSFB2b基因的過量表達提高了轉(zhuǎn)基因植株的 耐逆性，干擾該基因表達，降低轉(zhuǎn)基因植株的耐逆性，因此該基因?qū)ε嘤湍嬷参锲贩N，特 別是培育耐非生物脅迫(耐鹽/耐低溫/耐旱）作物、林草等新品種具有重要的理論及實際 意義，可用于農(nóng)牧業(yè)和生態(tài)環(huán)境治理所需的耐逆性植物品種的培育和鑒定。
[0049] 下面結(jié)合附圖及具體實施例對本發(fā)明做進一步說明。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0050] 圖1為GsHSFB2b在耐鹽野生大豆Y20和Y55中的表達
[0051] 圖2為GsHSFB2b在耐鹽野生大豆中受鹽脅迫誘導(dǎo)
[0052] 圖3為過表達重組表達載體和RNA干擾重組表達載體的部分結(jié)構(gòu)示意圖
[0053] 圖4為轉(zhuǎn)pBin438-GsHSFB2b毛狀根和轉(zhuǎn)GsHSFB2b-RNAi毛狀根的分子鑒定
[0054] 圖 5 為轉(zhuǎn) pBin438-GsHSFB2b 毛狀根和轉(zhuǎn) GsHSFB2b-RNAi 毛狀根在 NaCl、PEG 和 4° C處理時的生長
[0055] 圖6為轉(zhuǎn)pBin438-GsHSFB2b毛狀根和轉(zhuǎn)GsHSFB2b-RNAi毛狀根在正常、鹽、旱和 4° C脅迫下的相對增長率

【具體實施方式】
[0056] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0057] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0058] 下述實施例中的％，如無特殊說明，均為質(zhì)量百分含量。以下實施例中的定量試驗， 均設(shè)置三次重復(fù)實驗，數(shù)據(jù)為三次重復(fù)實驗的平均值或平均值土標準差。
[0059] 所有植物材料均生長于25° C每天的光照為16h/8h (光照/黑暗）。
[0060] 大?科豐 1 號（Glycine max L. Merr. Kefengl)記載在 W. Κ. Zhang, Υ. J. Wang, G. Z. Luo, J. S. Zhang, C. Y. He, X. L. Wu, J. Y. Gai, S. Y. Chen, QTL mapping of ten agronomic traits on the soybean (Glycine max L Merr.) genetic map and their association with EST markers，Theor. Appl. Genet，2004, 108:1131-1139 中，公眾可以從中國科學(xué)院遺 傳與發(fā)育生物學(xué)研究所和黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院耕作栽培研究所獲得；
[0061] 植物雙元表達載體pBin438記載在李太元，田穎川，秦曉峰，等.高效抗蟲轉(zhuǎn)基 因煙草的研究[J].中國科學(xué)（B輯），1994, 24 (3) : 276-282中，有中科院微生物研究所方榮 祥院士提供。公眾可從中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所和黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院耕作栽 培研究所獲得。
[0062] 發(fā)根農(nóng)桿菌 K599 記載在 Attila Kereszt, et al.，Agrobacterium rhizogenes-mediaded transformation of soybean to study of root biology, Nature Protocols，2007, 2(4)，549-552)中，公眾可從Peter M Gressnon教授，The University of Queensland，St Lucia，Queensland4072, Australia，獲得，或經(jīng) Peter M Gressnon 教授同 意(書面同意書）后由中科院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所和黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院耕作栽培研 究所獲得。
[0063] 載體 pZHOl 記載在 Han Xiao, et al· Functional analysis of the rice AP3homologue 0sMADS16by RNA interference,Plant Molecular Biology，2003, 52, 957-966,公眾可從中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所和黑龍江省農(nóng) 業(yè)科學(xué)院耕作栽培研究所獲得。
[0064] 實施例1、大豆轉(zhuǎn)錄因子GsHSFB2b基因的發(fā)現(xiàn)及其表達受非生物脅迫誘導(dǎo)
[0065] 一、大豆轉(zhuǎn)錄因子GsHSFB2b基因的發(fā)現(xiàn)
[0066] 將耐鹽野生大豆（Glycine soja Sieb. Et Zucc. )Y20和Y55種子播種于裝滿蛭石 的盆中，生長于25±2°C，連續(xù)光照，兩周后取出大豆苗，操作時注意避免傷根，進行鹽處理。 處理過程為：鹽處理，將根浸入200mM NaCl水溶液中，分別在0、1、3、12小時收集新鮮葉片 和根各lg。將收集的葉片和根分別混合，在液氮中研碎，懸于4mol/L硫氫酸胍中，混合物 用酸性苯酚、氯仿抽提，上清液中加入無水乙醇沉淀得到葉片和根的總RNA。進行轉(zhuǎn)錄組分 析。
[0067] 通過未經(jīng)鹽處理和鹽處理的轉(zhuǎn)錄組分析，獲得一批鹽脅迫誘導(dǎo)的基因，篩選20 個，鑒定他們在野生大豆葉片和根中的表達水平。結(jié)果表明，其中一個基因的表達在野生 大豆Y20和Y55的根中表達量均比葉中高（圖1)，將該基因命名為GsHSFB2b，其核苷酸序 列為序列表中的序列1，該基因編碼的蛋白命名為GsHSFB2b，該蛋白的氨基酸序列為序列 表中的序列2。
[0068] 二、大豆轉(zhuǎn)錄因子GsHSFB2b基因的表達受非生物脅迫誘導(dǎo)
[0069] 分析了鹽脅迫下GsHSFB2b的表達特征。材料和處理同上，兩周齡的Y20和Y55 苗經(jīng)200mM NaCl處理0、1、3、12小時，分別收集葉片和根各lg，提取總RNA。對GsHSFB2b 基因在上述處理時的表達特征進行Real Time PCR分析，引物為Primer-F(BamHI)和 Primer-R(Kpnl)。大豆 GmTubulin 基因為內(nèi)標，所用引物為 Primer-TF 和 Primer-TR。
[0070] Primer-F (BamHI) : 5，-cgGGATCCATGGCGCCGTTACCGGCG-3'（序列 3)
[0071] Primer-R(Kpnl) :5, -ggGGTACCCTATAGCTCCAACCAATGAGG-3，（序列 4)
[0072] Primer-TF :5' -AACTCCATTTCGTCCATTCCTTC-3'
[0073] Primer-TR :5, -TTGAGTGGATTCCCAACAACG-3'
[0074] Q-PCR得到的值是基因相對于GmTubulin的表達量。實驗重復(fù)三次，結(jié)果取平均值 土標準差。
[0075] 結(jié)果如圖2所示，GsHSFB2b基因在200mM NaCl處理時其轉(zhuǎn)錄水平均有不同程度 升高，在Y20和Y55葉中，處理1小時時即達到峰值，在Y20中隨處理時間增加，表達量略 有波動，Y55中，至3小時時有較大下降，但是仍明顯高于未處理水平。而在兩個野生大豆 根中GsHSFB2b的表達趨勢基本相同，在鹽脅迫下1小時轉(zhuǎn)錄水平即升高，至6小時達到峰 值，12小時略有下降。總體上，GsHSFB2b無論在兩個耐鹽野生大豆Y20和Y55的葉還是根 中均受到鹽脅迫的誘導(dǎo)表達。
[0076] 實施例2、轉(zhuǎn)錄因子GsHSFB2b基因在調(diào)控植物耐逆性中的應(yīng)用
[0077] 一、轉(zhuǎn)錄因子GsHSFB2b基因的獲得
[0078] 將野生大豆Y20的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA為模板(也可以以人工合成的序列1所示 的DNA分子為模板)，用如下帶BamH I酶切位點的上游引物和帶ΚρηΙ酶切位點的下游引物 進行PCR擴增，得到約1068bp的PCR產(chǎn)物。
[0079] 帶BamH I酶切位點的上游引物：
[0080] Primer-F(BamHI) :F-5, -cgGGATCCATGGCGCCGTTACCGGCG-3'
[0081] 帶Κρη I酶切位點的下游引物：
[0082] Primer-R(ΚρηI) ： ggGGTACCCTATAGCTCCAACCAATGAGG
[0083] 經(jīng)過測序，該PCR產(chǎn)物大小約1068bp，具有序列表中的序列1所示的核苷酸，即為 GsHSFB2b，其編碼的蛋白為GsHSFB2b，其氨基酸序列為序列表中的序列2。
[0084] 二、過表達重組表達載體和RNA干擾重組表達載體的獲得
[0085] 1、過表達重組表達載體pBin438-GsHSFB2b的構(gòu)建
[0086] 用限制性內(nèi)切酶BamH I和Κρη I雙酶切由上述一得到的1068bp的PCR產(chǎn)物，回 收酶切產(chǎn)物，將該酶切產(chǎn)物與經(jīng)過同樣酶切載體pGEM-T Easy (Promega)連接，將連接產(chǎn)物 轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞，根據(jù)pGEM-T Easy載體上的羧卞青霉素抗性標記篩選陽 性克隆，得到含有回收片段的重組質(zhì)粒pGEM-T Easy-GsHSFB2b。以該重組質(zhì)粒上的T7和 SP6啟動子序列為引物對其進行核苷酸序列測定，測序結(jié)果表明該PCR產(chǎn)物具有序列表中 序列1所示的核苷酸，為GsHSFB2b，由1068bp組成，該重組質(zhì)粒pGEM-T Easy-GsHSFB2b為 將序列表中序列1所示的核苷酸插入pGEM-T Easy中得到。
[0087] 以上述重組質(zhì)粒pGEM-T Easy_GsHSFB2b為模板，用上述一的帶BamH I酶切位點 的上游引物和帶ΚρηΙ酶切位點的下游引物進行PCR擴增，得到的1068bp的PCR產(chǎn)物，回收 酶切產(chǎn)物，將該酶切產(chǎn)物與經(jīng)過同樣酶切植物雙元表達載體pBin438的12. 9Kb載體骨架連 接,得到重組質(zhì)粒。經(jīng)過測序，該重組質(zhì)粒為將序列表中的序列1插入pBin438的BamH I和 Κρη I酶切位點之間得到的載體，將該質(zhì)粒命名為PBin438-GsHSFB2b，且序列表中的序列1 位于CaMV35S啟動子之后，即為重組表達載體。該重組表達載體pBin438-GsHSFB2b部分結(jié) 構(gòu)示意圖如圖3A。
[0088] 2、RNA干擾重組表達載體GsHSFB2b-RNAi載體構(gòu)建
[0089] GsHSF2b基因3'端356bp長的基因片段以正反兩個方向插入雙向表達載體pZHOl 中，從而構(gòu)建RNAi載體，具體如下：
[0090] 以上述重組質(zhì)粒pGEM-T Easy-GsHSFB2b為模板，用下列引物RNAi-F和RNAi-R擴 增出356bp PCR產(chǎn)物，經(jīng)過測序，該PCR產(chǎn)物具有序列表中序列1自5'末端第441-800位 核苷酸。
[0091] RNAi-F (Xbal 和 Seal) :GCTCTAGAGAGCTC CAACGACTTCCGGCGACG
[0092] RNAi-R (Sail 和 Kpnl) :ACGCGTCGACGGTACC ACCGACATGCAGGGCGTC 將 PCR 產(chǎn)物 與RNAi雙向表達載體pZHOl的鏈接，具體如下：第一鏈用Sac I和Κρη I雙酶切鏈接， 然后使用Sal I和Xba I雙酶切將反鏈連接到第一鏈陽性克隆上，獲得植物表達載體 pZH01-GsHSFB2b-RNAi。
[0093] 經(jīng)過測序，pZH01-GsHSFB2b-RNAi (部分結(jié)構(gòu)示意圖如圖3B)為將序列1的自5' 末端第441-800位核苷酸（DNA分子1的編碼序列)插入pZHOl載體的SacI和Kpnl酶切位 點，且將序列1的自5'末端第441-800位核苷酸的反向互補序列（DNA分子2的編碼序列） 插入pZHOl載體的Sail和Xbal位點間，得到的載體，為RNA干擾載體。
[0094] 三、過表達GsHSFB2b毛狀根和RNA干擾GsHSFB2b毛狀根的獲得
[0095] 1、轉(zhuǎn)化
[0096] 1)將上述二獲得的重組表達載體 pBin438-GsHSFB2b 和 pZH01-GsHSFB2b-RNAi，分 別通過電擊法導(dǎo)入轉(zhuǎn)化發(fā)根農(nóng)桿菌K599,得到重組農(nóng)桿菌K599/pBin438-GsHSFB2b和重組 農(nóng)桿菌 K599/GsHSFB2b-RNAi。
[0097] 提取重組農(nóng)桿菌K599/pBin438-GsHSFB2b的質(zhì)粒，送去測序，結(jié)果為該質(zhì)粒為 pBin438-GsHSFB2b，說明重組菌構(gòu)建正確。
[0098] 提取重組農(nóng)桿菌K599/GsHSFB2b-RNAi的質(zhì)粒，送去測序，結(jié)果為該質(zhì)粒為 pZHOl-GsHSFB2b-RNAi，說明重組菌構(gòu)建正確。
[0099] 2)用注射器將重組農(nóng)桿菌 K599/pBin438-GsHSFB2b 和 K599/GsHSFB2b-RNAi 分 別接種生長6天含兩片真葉的大豆科豐1號（以下也稱為野生型大豆）幼苗，保濕生長： 光照16小時，溫度25°C，濕度50%。2周后，長出毛狀根即為轉(zhuǎn)化的毛狀根。分別獲得 60 個轉(zhuǎn) pBin438-GsHSFB2b 毛狀根根系（K599/pBin438-GsHSFB2b 注射獲得）和 60 個轉(zhuǎn) GsHSFB2b-RNAi毛狀根根系（K599/GsHSFB2b-RNAi注射獲得)，分別標記為0E和RNAi，可進 一步作轉(zhuǎn)基因鑒定和耐逆性檢測。
[0100] 以相同的方法將空載體pBin438轉(zhuǎn)入大豆科豐1號幼苗，得到60個轉(zhuǎn)pBin438毛 狀根根系，以作為實驗對照。
[0101] 以相同的方法將空載體PZH01轉(zhuǎn)入大豆科豐1號幼苗，得到60個轉(zhuǎn)pZHOl毛狀根 根系。
[0102] 2、轉(zhuǎn)基因毛狀根分子鑒定
[0103] 分別提取轉(zhuǎn) pBin438-GsHSFB2b 毛狀根、轉(zhuǎn) GsHSFB2b-RNAi 毛狀根、轉(zhuǎn) pBin438 毛狀根和轉(zhuǎn)pZHOl毛狀根的總RNA，將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，用Primer-F和 Primer-R作為引物進行GsHSFB2b基因表達量分析。Real-Time PCR反應(yīng)使用Τ0Υ0Β0公司 的RealTime PCR Master Mix試劑盒，并按照說明進行操作。GsHSFB2b基因表達量檢測所 用引物為同上；大豆GmTubulin基因為內(nèi)標，所用引物為Primer-TF和Primer-TR。實驗重 復(fù)三次，結(jié)果取平均值土標準差。
[0104] Primer-F(BamHI) :5, -cgGGATCCATGGCGCCGTTACCGGCG-3'（序列 3)
[0105] Primer-R(ΚρηΙ) :5, -ggGGTACCCTATAGCTCCAACCAATGAGG-3'（序列 4)
[0106] Primer-TF :5' -AACTCCATTTCGTCCATTCCTTC-3'
[0107] Primer-TR :5' -TTGAGTGGATTCCCAACAACG-3'
[0108] 結(jié)果如圖4所示，圖4A為轉(zhuǎn)GsHSFB2b-RNAi毛狀根（記作GsHSFB2b-RNAi)和轉(zhuǎn) pZHOl毛狀根(記作K599)中GsHSFB2b表達的RT-PCR檢測結(jié)果，表明，在K599中檢測到內(nèi) 源GsHSFB2b的表達，而轉(zhuǎn)GsHSFB2b-RNAi毛狀根中沒有檢測到GsHSFB2b的表達；
[0109] 圖 4B 顯示了 Real Time PCR 檢測轉(zhuǎn) pBin438-GsHSFB2b 毛狀根（記作 0E20)和轉(zhuǎn) pBin438毛狀根(記作K599)中GsHSFB2b表達的結(jié)果，從圖中看出，以大豆GmTubulin基因 為內(nèi)標，轉(zhuǎn)pBin438-GsHSFB2b毛狀根中GsHSFB2b的相對表達量約為88% ;轉(zhuǎn)pBin438毛狀 根中檢測出的GsHSFB2b的相對表達量是大豆原有的GsHSFB2b的表達，約為3%。
[0110] 從上述結(jié)果可以看出，轉(zhuǎn)pBin438-GsHSFB2b毛狀根中，GsHSFB2b的表達量遠 高于轉(zhuǎn)空載體根系中GsHSFB2b的表達量；而轉(zhuǎn)GsHSFB2b-RNAi毛狀根中，幾乎檢測不到 GsHSFB2b的表達。
[0111] 因此，轉(zhuǎn) pBin438-GsHSFB2b 毛狀根為過表達 GsHSFB2b 毛狀根；轉(zhuǎn) GsHSFB2b-RNAi 毛狀根為RNA干擾GsHSFB2b毛狀根。
[0112] 四、過表達GsHSFB2b毛狀根和RNA干擾GsHSFB2b毛狀根耐逆性鑒定
[0113] 實驗樣本為轉(zhuǎn)pZHOl毛狀根、轉(zhuǎn)pBin438毛狀根、轉(zhuǎn)pBin438-GsHSFB2b毛狀根和 轉(zhuǎn) GsHSFB2b-RNAi 毛狀根。
[0114] 1、耐鹽性鑒定
[0115] 轉(zhuǎn) pBin438 毛狀根（記作 K599)、轉(zhuǎn) pBin438-GsHSFB2b 毛狀根（記作 GsHSFB2b-0E) 和轉(zhuǎn)GsHSFB2b-RNAi毛狀根（記作GsHSFB2b-RNAi)各取6個經(jīng)浸入80mM NaCl水溶液中， 25° C處理3天。以在水中25° C生長3天為對照。實驗重復(fù)三次，結(jié)果取平均值土標準 差。
[0116] 拍照觀察，結(jié)果如圖5的前兩行所示，對照組各株系物顯著差異；而經(jīng)80mM NaCl處理3天的轉(zhuǎn)pBin438毛狀根（記作K599)和轉(zhuǎn)pBin438-GsHSFB2b毛狀根（記作 GsHSFB2b-0E)和轉(zhuǎn)GsHSFB2b-RNAi毛狀根（記作GsHSFB2b-RNAi)的三者表型有顯著差異。 毛狀根相對增長率測量具體如下：
[0117] 具體測量各組根系(統(tǒng)計毛狀根長度)，
[0118] 在水中25 ° C生長3天各株系的根長如圖6A所不，轉(zhuǎn)pBin438毛狀根(記作 K599)、轉(zhuǎn) pBin438-GsHSFB2b 毛狀根（記作 GsHSFB2b-0E)和轉(zhuǎn) GsHSFB2b-RNAi 毛狀根（記作 GsHSFB2b-RNAi)的根長分別為2. 5±0. 1、2. 4±0. 2、2. 4±0. 2厘米；因此K599和轉(zhuǎn)基因毛 狀根在未處理條件下的長勢無明顯差異。
[0119] 80mM NaCl水溶液處理組毛狀根長結(jié)果如下：
[0120] 轉(zhuǎn)pBin438毛狀根(記作K599)為處理前和處理后根長平均值分別約為2. 5±0. 1 和2. 9±0. 2厘米；
[0121] 轉(zhuǎn)pBin438-GsHSFB2b毛狀根（記作GsHSFB2b-0E)處理前和處理后根長分別為平 均值分別約為2. 4±0. 2和3. 4±0. 3厘米；
[0122] 轉(zhuǎn)GsHSFB2b-RNAi毛狀根(記作GsHSFB2b-RNAi)處理前和處理后根長分別為平均 值分別約為2. 5±0. 2和2. 7±0. 4厘米。
[0123] 再計算每一根毛狀根的增長率=(處理后根長-處理前根長）/處理前根長，然后 取平均值土標準差；
[0124] 將增長率作圖如圖6B所示，經(jīng)80mM NaCl水溶液處理3天后，過量表達毛狀根 GsHSF2b-0E的相對增長率為61±2%，轉(zhuǎn)pBin438毛狀根K599的相對增長率為16±3%， GsHSF2b-RNAi毛狀根的相對增長率為6±4%，三者間有顯著差異。統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，GsHSF2b 的過量表達顯著增加了毛狀根對鹽脅迫的耐性，而GsHSF2b基因表達的受阻，明顯降低了 毛狀根的耐鹽性，它們的差異為極顯著。
[0125] 采用同樣的方法處理、檢測轉(zhuǎn)pZHOl毛狀根，結(jié)果與轉(zhuǎn)pBin438毛狀根無顯著差 異。
[0126] 2)耐旱性鑒定
[0127] 以聚乙二醇6000 (PEG)處理模擬干旱脅迫。轉(zhuǎn)pBin438毛狀根(記作K599)、 轉(zhuǎn) pBin438-GsHSFB2b 毛狀根（記作 GsHSFB2b-0E)和轉(zhuǎn) GsHSFB2b-RNAi 毛狀根（記作 GsHSFB2b-RNAi)分別浸入4% (體積百分含量)PEG在25° C處理3天。每個根系各為6個。
[0128] 實驗重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。
[0129] 拍照觀察，結(jié)果如圖5的第三行，可以看出，經(jīng)4% (體積百分含量）PEG處理3天 的轉(zhuǎn)pBin438毛狀根（記作K599)和轉(zhuǎn)pBin438-GsHSFB2b毛狀根（記作GsHSFB2b-0E)和轉(zhuǎn) GsHSFB2b-RNAi毛狀根(記作GsHSFB2b-RNAi)的三者表型有顯著差異。
[0130] 毛狀根測量具體如下：
[0131] 轉(zhuǎn)pBin438毛狀根(記作K599)處理前和處理后根長分別為平均值分別約為 2. 5±0· 2 和 3. 0±0· 4 厘米；
[0132] 轉(zhuǎn)pBin438-GsHSFB2b毛狀根（記作GsHSFB2b-0E)處理前和處理后根長分別為平 均值分別約為2. 3±0. 1和4. 5±0. 5厘米；
[0133] 轉(zhuǎn)GsHSFB2b-RNAi毛狀根(記作GsHSFB2b-RNAi)處理前和處理后根長分別為平均 值分別約為2. 4±0. 2和2. 5±0. 3厘米。
[0134] 計算毛狀根的相對增長率。計算毛狀根長度增長率的公式同上。實驗重復(fù)三次， 結(jié)果取平均值。
[0135] 結(jié)果如圖 6C 所示，經(jīng) 4%PEG 處理后，轉(zhuǎn) pBin438-GsHSFB2b 毛狀根 GsHSFB2b-0E、 轉(zhuǎn)GsHSFB2b-RNAi毛狀根GsHSFB2b-RNAi與轉(zhuǎn)pBin438毛狀根K599間根的相對增長率有 顯著差別；具體如下：轉(zhuǎn)pBin438毛狀根K599增長率約為20±4%，轉(zhuǎn)GsHSFB2b-RNAi毛狀 根 GsHSFB2b-RNAi 的相對增長率為 4±3%，而轉(zhuǎn) pBin438-GsHSFB2b 毛狀根 GsHSFB2b-0E 的 增長率約為95±4%，轉(zhuǎn)pBin438-GsHSFB2b毛狀根GsHSFB2b-0E的增長率與轉(zhuǎn)pBin438毛 狀根的增長率有極顯著差異。
[0136] 采用同樣的方法處理、檢測轉(zhuǎn)pZHOl毛狀根，結(jié)果與轉(zhuǎn)pBin438毛狀根無顯著差 異。
[0137] 結(jié)果表明，GsHSFB2b的過量表達明顯提高了毛狀根的耐旱能力，而該基因的失活， 則降低了毛狀根的耐旱性，它們間的差異均達到極顯著水平。
[0138] 3、耐低溫鑒定
[0139] 將在水中生長的轉(zhuǎn)pBin438毛狀根(記作K599)、轉(zhuǎn)pBin438-GsHSFB2b毛狀根(記 作 GsHSFB2b-0E)和轉(zhuǎn) GsHSFB2b-RNAi 毛狀根（記作 GsHSFB2b-RNAi)置于 4° C 中處理 3 天 后。每個根系各為6個。
[0140] 實驗重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。
[0141] 拍照觀察，結(jié)果如圖5的第4行，可以看出，經(jīng)4° C低溫處理3天的轉(zhuǎn)pBin438毛 狀根（記作 K599)和轉(zhuǎn) pBin438-GsHSFB2b 毛狀根（記作 GsHSFB2b-0E)和轉(zhuǎn) GsHSFB2b-RNAi 毛狀根(記作GsHSFB2b-RNAi)的三者表型有顯著差異。
[0142] 毛狀根測量具體如下(統(tǒng)計主根長度）：
[0143] 轉(zhuǎn)pBin438毛狀根(記作K599)處理前和處理后根長分別為平均值分別約為 2. 3±0· 4 和 2. 5±0· 6 厘米；
[0144] 轉(zhuǎn)pBin438-GsHSFB2b毛狀根（記作GsHSFB2b-0E)處理前和處理后根長分別為平 均值分別約為2. 3±0. 4和2. 9±0. 6厘米；
[0145] 轉(zhuǎn)GsHSFB2b-RNAi毛狀根(記作GsHSFB2b-RNAi )處理前和處理后根長分別為平均 值分別約為2. 2±0. 2和2. 3±0. 2厘米。
[0146] 計算毛狀根的相對增長率。計算毛狀根長度增長率的公式同上。實驗重復(fù)三次， 結(jié)果取平均值。
[0147] 結(jié)果如圖6D所示，經(jīng)低溫處理后，轉(zhuǎn)pBin438毛狀根K599增長率約為7±6%，轉(zhuǎn) GsHSFB2b-RNAi 毛狀根 GsHSFB2b-RNAi 的相對增長率為 4±2%，而轉(zhuǎn) pBin438-GsHSFB2b 毛 狀根GsHSFB2b-0E的增長率約為24±5%，轉(zhuǎn)GsHSF2b毛狀根的增長率與轉(zhuǎn)空載體毛狀根的 增長率有極顯著差異。
[0148] 采用同樣的方法處理、檢測轉(zhuǎn)pZHOl毛狀根，結(jié)果與轉(zhuǎn)pBin438毛狀根無顯著差 異。
[0149] 結(jié)果表明，GsHSF2b的過量表達明顯提高了毛狀根的耐低溫能力，而該基因的失 活，則降低了毛狀根的耐低溫性，它們間的差異均達到極顯著水平。
[0150] 上述實施例說明，野生大豆轉(zhuǎn)錄因子NAC家族成員GsHSFB2b與植物的耐鹽、耐旱 和/或耐低溫性相關(guān)，其過量表達顯著增加植物的耐鹽、耐旱性和/或耐低溫。
[0001] 序列表 <αιο>中科院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所；黑龍江省農(nóng)、丨k科學(xué)院耕作栽培研究所 <120>GsHSFB2b蛋白在培育酎逆性轉(zhuǎn)基W植物中的應(yīng)用 <160>4 <210〉 1 <211> 1068 <212〉 DNA <213> 野大豆Sicb, Zucc·) <400> 1 atggcgccgt taccggcgga geaaaccggt gaatcagegc egacggagtt gcagagatcc 60 attccgacgc cgtttctgac caagacgtac cagctcgtcg atgatccctc cgcggatgac- 120 ctaatttcct ggaacgaaga cggcaccagc ttcattgtat ggcgacccgc ggaatttgca 180 agggatttgc ttcctaagta cttcaaacac aacaactttt ccagtttcgt ccgtcaactt 240 aacacctatg ggttccggaa ggttgtccct gaccgttggg aattcgccaa cgactgtttc dOO cggcgaggcg agagagctct tcttcgcgac atacagcgcc ggaaattact gccggttccg 360 cctgcagccg cggcaccggc agcagtcaca gccaatacgg tgacggtggc tgtggcagca 420 ccggcggtga gaactgtgtc tccaacgact tccggcgac.g aacaggtact atcttcgaac 480 tcatctccga ttgctgggaa taataataat aatacagtac accgcaccac aagttgcacc 540 actgcgcccg agctgttaga agagaatgaa aggcttagga aagagaacat acaactgagt 600 aacgagttga gtcaattgaa gggtttgtgt aataacatac tctctttgat gaccaattat 660 gcttctggtt ttagccgcca gcagttagaa tcctccacaa gcgctgtgag gaccgtgccg 720 gLgeeggacg ggaa^ggcgec gelggiigett ligcccgcga aacatgltlc atcggclgal 780 gacgccctgc at-gtcggtgg cgccgccggt gccgcggcgt gcgcgacggg gaacgcggcg 840 gaagcagagg ttccgaiigct gtttggggtt tcgattggfic tgaaacgfitg taggricagag 900 tgcgaggccg aaccagaagg agaagatcag aatcagatgc aaacgcgagc acaaacacaa 960
[0002] tcacaatcgt cgcaagaacc agatcacggt tcagatgtga aatctgaacc gcttgatggt 1020 gatgattcgg attatcagga tcatgaccct cattggttgg agctatag 1068 <210> 2 <211> 355 <212> PRT <213> Glycine soja Sieb. Et Zucc. <400> 2 Mel Ala Pro Leu Pro Ala Glu Gin Thr Gly Glu Ser Ala Pro Thr Glu 1 5 10 15 Leu Gin Arg Scr lie Pro Thr Pro Phc Leu Thr Lys Thr Tyr Gin Lou 20 25 30 Val Asp Asp Pro Ser Ala Asp Asp Leu Ile Ser I'rp Asn Glu Asp Gly 35 40 45 Thr Ser Phe lie Val Trp Arg Pro Ala Glu Phe Ala Arg Asp Leu Leu 50 55 60 Pro Lys Tyr Phc Lys His Asn Asn Phc Scr Scr Phc Val Arg Gin Leu 65 70 75 80 Asn Thr Tyr Gly Phe Arg Lys Val Val Pro Asp Arg I'rp Glu Phe Ala 85 90 95
[0003] Asn Asp Cys Phe Arg Arg Gly Glu Arg Ala Leu Leu Arg Asp He Gin 100 105 110 Arg Arg Lys Leu Leu Pro Val Pro Pro Ala Ala Ala Ala Pro Ala Ala 115 120 125 Val Thr Ala Asn Thr Val Thr Val Ala Val Ala Ala Pro Ala Val Arg 130 135 140 Thr Val Ser Pro Thr Thr Ser Gly Asp Glu Gin Val Leu Ser Ser Asn 145 150 155 160 Ser Ser Pro lie Ala Gly Asn Asn Asn Asn Asn Thr Val His Arg Thr 165 170 175 Thr Ser Cys Thr Thr Ala Pro Glu Leu Leu Glu Glu Asn Glu Arg Leu 180 185 190 Arg Lys Glu Asn lie Gin Leu Ser Asn Glu Leu Ser Gin Leu Lys Gly 195 200 205 Leu Cys Asn Asn lie Leu Ser Leu Met Thr Asn Tyr Ala Ser Gly Phe 210 215 220
[0004] Ser Arg Gin Gin Leu Glu Ser Ser Thr Ser Ala Val Arg Thr Val Pro 225 230 235 240 Val Pro Asp Gly Lys Ala Pro Leu Glu Leu Leu Pro Ala Lys His Val 245 250 255 Ser Ser Ala Asp Asp Ala Leu His Val Gly Gly Ala Ala Gly Ala Ala 260 265 270 Ala Cys Ala Thr Gly Asn Ala Ala Glu Ala Glu Val Pro Lys Leu Phe 275 280 285 Gly Val Scr lie Gly Leu Lys Arg Cys Arg Thr Glu Cys Glu Ala Glii 290 295 300 Pro Clu Gly Glu Asp Gin Asn Gin Met Gin Thr Arg Ala Gin Thr Gin 305 310 315 320 Ser Gin Ser Ser Gin Glu Pro Asp His Gly Ser Asp Val Lys Ser Glu 325 330 335 Pro Leu Asp Gly Asp Asp Ser Asp Tyr Gin Asp His Asp Pro His Trp 340 345 350 Leu Glu Leu
[0005] 355 <210〉 3 <211〉 26 <212> DM <213〉人:丄:合成 <220〉 <223〉 <400> 3 cgggatccat ggcgccgtta ccggcg 26 <210> 4 <211> 29 <212> DNA 〈213>人工合成 <220> <223〉 <400> 4 ggggtaccct atagctccaa ccaatgagg 29
【權(quán)利要求】
1. 如下1) -3)中任一種物質(zhì)在調(diào)控植物耐逆性或培育耐逆性植物中的應(yīng)用： 1) 蛋白 GsHSFB2b ; 2) 編碼蛋白GsHSFB2b的DNA分子； 3) 含有編碼蛋白GsHSFB2b的DNA分子的重組載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌； 所述蛋白GsHSFB2b的氨基酸序列為序列表中的序列2。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于：所述編碼蛋白GsHSFB2b的DNA分子的核 苷酸序列為序列表中的序列1 ; 所述含有編碼蛋白GsHSFB2b的DNA分子的重組載體為將所述編碼蛋白GsHSFB2b的 DNA分子插入表達載體中，得到表達蛋白GsHSFB2b的重組載體。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于：所述耐逆性為耐鹽性、耐干旱和/或 耐低溫。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于：所述低溫為4°C ;所述植物為單子葉植物 或雙子葉植物。
5. 沉默或抑制植物中蛋白GsHSFB2b表達的物質(zhì)在降低植物耐逆性中的應(yīng)用。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于：所述沉默或抑制植物中蛋白GsHSFB2b表 達的物質(zhì)為重組載體， 所述重組載體為將DNA分子1和DNA分子2均插入表達載體中，得到沉默或抑制植物 中蛋白GsHSFB2b表達的重組載體；所述DNA分子1的核苷酸序列為序列1的自5'末端第 441-800位核苷酸；所述DNA分子2的核苷酸序列為所述DNA分子1的反向互補序列。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的應(yīng)用，其特征在于：所述耐逆性為耐鹽性、耐干旱和/或 耐低溫。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于：所述低溫為4°C ;所述植物為單子葉植物 或雙子葉植物。
9. 重組載體，為將編碼蛋白GsHSFB2b的DNA分子插入表達載體中，得到表達蛋白 GsHSFB2b的重組載體；所述蛋白GsHSFB2b的氨基酸序列為序列表中的序列2 ;所述編碼蛋 白GsHSFB2b的DNA分子的核苷酸序列具體為序列表中的序列1。
10. 重組載體，為將DNA分子1和DNA分子2均插入表達載體中，得到沉默或抑制植物 中蛋白GsHSFB2b表達的重組載體；所述DNA分子1的核苷酸序列為序列1的自5'末端第 441-800位核苷酸；所述DNA分子2的核苷酸序列為所述DNA分子1的反向互補序列。
【文檔編號】C12N5/10GK104120134SQ201310147975
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2013年4月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年4月25日
【發(fā)明者】陳受宜, 來永才, 張勁松, 牛燦芳, 李煒, 張萬科, 畢影東, 卞瀟華, 肖佳雷, 林晴, 李琬, 馬彪 申請人:中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所, 黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院耕作栽培研究所