納豆激酶的提純方法及制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及納豆激酶的提純方法及制備方法，其中，納豆激酶的提純方法包括以下步驟：1）提取，2）超過濾，3）葡聚糖凝膠G-50柱層析，4）Amberlite?IRC-50陽離子交換柱層析，5）DEAE-CelluloseDE-52陰離子交換柱層析，6）納豆激酶酶蛋白結晶。納豆激酶的提純方法具有純化度高及回收率高的優(yōu)點。
【專利說明】納豆激酶的提純方法及制備方法
【【技術領域】】
[0001]本發(fā)明涉及納豆激酶的提純方法、納豆激酶的制備方法。
【【背景技術】】
[0002]納豆(Natto)是日本傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品，由納豆菌(Bacillus natto)以大豆為主要培養(yǎng)基成分發(fā)酵而成。主要用于心腦血管疾病的預防與控制。1987年，日本學者Sumi等人從納豆中發(fā)現(xiàn)了一種絲氨酸蛋白酶，定名為納豆激酶(Nattokinase, NK, PhaseolusVulgaris L.)[1]0大量研究表明，納豆激酶經(jīng)小腸吸收進入血漿[2]，能顯著降低血漿優(yōu)球蛋白的溶解時間，降低血漿纖維蛋白原的含量，同等劑量的納豆激酶與尿激酶(Urokinase;UK)相比，前者纖溶性大于后者[3]，而且對血漿纖維蛋白的專一性比UK高，臨床上不引起出血?？梢姡{豆激酶安全性好，易被人體吸收，溶栓效率高，藥效持久，有望開發(fā)成新型口服溶栓劑，各地競相生產(chǎn)，大多采用從固體發(fā)酵產(chǎn)物納豆中制備。
【
【發(fā)明內容】
】
[0003]本發(fā)明要解決的第一個技術問題是提供一種納豆激酶的提純方法，其純化度高及回收率高。
[0004]本發(fā)明要解決的第二個技術問題是提供一種納豆激酶的制備方法，其獲得純度較高的納豆激酶。
[0005]上述第一個技術問題由以下方案解決:
[0006]一種納豆激酶的提純方法，包括以下步驟:
[0007]I)提取:將納豆菌發(fā)酵液或粗納豆激酶溶液進行2000r/min離心，收集上清液，得粗酶液；
[0008]2)超過濾:將所述粗酶液進行超過濾，收集排阻相對分子質量為10000以上的物質，得超濾濃縮液；
[0009]3)葡聚糖凝膠G-50柱層析:
[0010]用pH值為7.5、濃度為0.lmol/L的磷酸鈉緩沖液平衡并裝柱，取所述過超濾濃縮液上樣，用PH值為7.5、濃度為0.lmol/L的磷酸鈉緩沖液洗脫；收集洗脫液，合并含酶的洗脫液，并濃縮至原體積的1/3，得第一濃縮液；
[0011]4) Amberlite IRC-50陽離子交換柱層析:
[0012]裝柱，取所述第一濃縮液上樣，用pH值為6.0、濃度為l/15mol/L的磷酸鈉緩沖液與PH值為8.0、濃度為0.2mol/L的磷酸鈉緩沖液進行線性梯度洗脫；收集洗脫液，合并含酶的洗脫液，用PH值為7.5、濃度為0.lmol/L的磷酸鈉緩沖液透析，并濃縮至原體積的1/3，得第二濃縮液；
[0013]5) DEAE-CelluloseDE-52 陰離子交換柱層析:
[0014]裝柱， 取所述第二濃縮液上樣，用pH值為6.0、濃度為l/15mol/L的磷酸鈉緩沖液與PH值為pH8.0、濃度為0.2mol/L的磷酸鈉緩沖液進行線性梯度洗脫；收集洗脫液，合并含酶的洗脫液，用pH值為7.5、濃度為0.lmol/L磷酸鈉緩沖液透析，并濃縮至原體積的1/3，得第二濃縮液；
[0015]6)將所述第三濃縮液裝在無蓋培養(yǎng)皿中，放置在4°C下，直至出現(xiàn)結晶，取結晶在干燥器中進行干燥，收集結晶粉末，得納豆激酶酶蛋白結晶。
[0016]本方法采用凝膠過濾、陽、陰離子交換柱層析等純化方法，首次分別獲得層析純、電泳純度的酶制劑，為該酶制劑的深度開發(fā)利用奠定了廣闊基礎；本方法具有純化度高及回收率高的優(yōu)點。
[0017]上述第二技術問題由以下方案解決:
[0018]ー種納豆激酶的制備方法，包括以下步驟:
[0019]1)種子菌制備:
[0020]101)菌種活化:將納豆菌轉移至斜面培養(yǎng)基,35°C培養(yǎng)24h ；
[0021]102)種子液制備:取ー環(huán)活化菌種，接入裝有500mL種子培養(yǎng)基的1000mL錐形瓶，在溫度為35°C和搖床轉速為140r/min的條件下培養(yǎng)24h，得種子液；
[0022]103)種子擴大培養(yǎng):在IOL種子罐中裝入5L種子培養(yǎng)基，滅菌并冷卻后接入750mL種子液，并加入2-3mL豆油，通入無菌空氣，控制溫度在35°C，培養(yǎng)24h，得二級種子菌；
[0023]2)納豆菌液體發(fā)酵:
[0024]在100L發(fā)酵罐中裝入40L發(fā)酵培養(yǎng)基，滅菌冷卻后接入6L 二級種子菌，并加入20mL豆油，通入無菌空氣，控制溫度在35°C,培養(yǎng)24h，得納豆菌發(fā)酵液；
[0025]其中，所述斜面培養(yǎng)基為營養(yǎng)瓊脂；種子培養(yǎng)基的組分為:蛋白胨1.5%、葡萄糖1.5%、氯化鈉0.5%，種子培養(yǎng)基的pH值為7.5 ;發(fā)酵培養(yǎng)基的組分為:蛋白胨1.5%、葡萄糖2%、磷酸氫二鉀0.4%、磷酸二氫鉀0.2%、硫酸鎂0.05%、大豆1%、玉米0.2%、蠶蛹粉0.2%，發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值為7.5 ;
[0026]3)提取:將納豆菌發(fā)酵液進行2000r/min離心，收集上清液，得粗酶液；
[0027]4)超過濾:將所述粗酶液進行超過濾，收集排阻相對分子質量為10000以上的物質，得超濾濃縮液；
[0028]5)葡聚糖凝膠G-50柱層析:
[0029]用pH值為7.5、濃度為0.lmol/L的磷酸鈉緩沖液平衡并裝柱，取所述超濾濃縮液上樣，用PH值為7.5、濃度為0.lmol/L的磷酸鈉緩沖液洗脫；收集洗脫液，合并含酶的洗脫液，并濃縮至原體積的1/3，得第一濃縮液；
[0030]6) Amberlite IRC-50陽離子交換柱層析:
[0031]裝柱，取所述第一濃縮液上樣，用pH值為6.0、濃度為l/15mol/L的磷酸鈉緩沖液與PH值為8.0、濃度為0.2mol/L的磷酸鈉緩沖液進行線性梯度洗脫；收集洗脫液，合并含酶的洗脫液，用PH值為7.5、濃度為0.lmol/L的磷酸鈉緩沖液透析，并濃縮至原體積的1/3，得第二濃縮液；
[0032]7) DEAE-CelluloseDE-52 陰離子交換柱層析:
[0033]裝柱，取所述第二濃縮液上 樣，用pH值為6.0、濃度為l/15mol/L的磷酸鈉緩沖液與PH值為pH8.0、濃度為0.2mol/L的磷酸鈉緩沖液進行線性梯度洗脫；收集洗脫液，合并含酶的洗脫液，用PH值為7.5、濃度為0.lmol/L磷酸鈉緩沖液透析，并濃縮至原體積的1/3，得第二濃縮液；
[0034]8)將所述第三濃縮液裝在無蓋培養(yǎng)皿中，放置在4°C下，直至出現(xiàn)結晶，取結晶在干燥器中進行干燥，收集結晶粉末，得納豆激酶酶蛋白結晶。
[0035]本發(fā)明結合從選用納豆菌進行高效地發(fā)酵產(chǎn)酶及對納豆菌發(fā)酵液進行質量地提純，得出純度較高的納豆激酶，為該酶制劑的深度開發(fā)利用奠定了廣闊基礎。
【【專利附圖】

【附圖說明】】
[0036]圖1為實施例二的菌種生長曲線圖；
[0037]圖2為實施例二的酶活力隨溫度的變化曲線圖；
[0038]圖3為實施例二的酶活力隨轉速的變化曲線圖；
[0039]圖4為實施例三的S印hadex G-50柱層析洗脫曲線圖；
[0040]圖5為實施例三的Amberlite柱層析洗脫曲線圖；
[0041]圖6為實施例三的DEAE-纖維素DE-52柱層析洗脫曲線圖；
[0042]圖7為實施例二的納激酶的蛋白結晶圖；
[0043]圖8為實施例四的納豆激酶的SDS-PAGE電泳的實驗結果圖；
[0044]圖9為實施例四的蛋白質相對分子質量的標準曲線圖；
·[0045]圖10為實施例五的納豆激酶溶血效果圖。
【【具體實施方式】】
[0046]實施例一
[0047]本實施例提供的一種納豆激酶的液體發(fā)酵方法，包括以下步驟:
[0048]I)種子菌制備:
[0049]101)菌種活化:將納豆菌轉移至斜面培養(yǎng)基,35°C培養(yǎng)24h ;納豆菌,英文名稱為Bacillus natto,由中科院廣東分院微生物研究所提供；
[0050]102)種子液制備:取ー環(huán)活化菌種，接入裝有500mL種子培養(yǎng)基的1000mL錐形瓶，在溫度為35°C和搖床轉速為140r/min的條件下培養(yǎng)24h，得種子液；
[0051]103)種子擴大培養(yǎng):在IOL種子罐中裝入5L種子培養(yǎng)基，滅菌并冷卻后接入750mL種子液，并加入2.5mL豆油以防止冒泡，通入無菌空氣，控制溫度在35°C，培養(yǎng)24h，即得二級種子菌；
[0052]2)納豆菌液體發(fā)酵:
[0053]在100L發(fā)酵罐中裝入40L發(fā)酵培養(yǎng)基，滅菌冷卻后接入6L 二級種子菌，并加入20mL豆油防止冒泡，通入無菌空氣，控制溫度在35°C,培養(yǎng)24h，得納豆菌發(fā)酵液。
[0054]其中，所述斜面培養(yǎng)基為市售營養(yǎng)瓊脂；種子培養(yǎng)基的組分為:蛋白胨1.5%、葡萄糖1.5%、氯化鈉0.5%，即種子培養(yǎng)基包括以下比例組分:水100ML、蛋白胨1.5g、葡萄糖
1.5g、氯化鈉0.5g，種子培養(yǎng)基的pH值為7.5 ;發(fā)酵培養(yǎng)基的組分為:蛋白胨1.5%、葡萄糖2%、磷酸氫二鉀0.4%、磷酸二氫鉀0.2%、硫酸鎂0.05%、大豆1%、玉米0.2%、蠶蛹粉0.2%，即發(fā)酵培養(yǎng)基包括以下比例組分:水100ML、蛋白胨1.5g、葡萄糖2g、磷酸氫二鉀0.4g、磷酸二氫鉀0.2g、硫酸鎂0.05g、大豆lg、玉米0.2g、蠶蛹粉0.2g，發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值為7.5。
[0055]經(jīng)檢測，上述納豆菌液體發(fā)酵液進行2000r/min離心，上清液的酶活力達1320U/mL0
[0056]酶活力的測定方法參見由中國農(nóng)業(yè)出版社出版、徐鳳彩為主編、姜涌明為副主編的《酶工程》;酶活力単位定義為:在酶活力測定條件下，于275nm波長下光吸收值每分鐘增加0.001個單位的酶量為I個酶活力單位(U)。
[0057]實施例二
[0058]在本實施例中，進行陳述探討實施例一中的納豆菌發(fā)酵產(chǎn)酶エ藝條件。在本實施例中，酶活力的測定方法參見由中國農(nóng)業(yè)出版社出版、徐鳳彩為主編、姜涌明為副主編的《酶工程》；酶活力単位定義為:在酶活力測定條件下，于275nm波長下光吸收值每分鐘增加
0.001個單位的酶量為I個酶活力單位(U)。
[0059]菌種生長曲線:在裝有400mL種子培養(yǎng)基的1000mL錐形瓶中接入5%的種子液，在溫度為35°C、搖床轉速為140r/min的條件下培養(yǎng)；每隔2h取樣，直到28h，測菌濃度(0D_)與酶活力；以時間(h)為橫坐標，0D_值與酶活力為縱坐標，作圖為納豆菌生長曲線。菌濃度(OD6tltl)的概念見于《納豆激酶搖床發(fā)酵條件的優(yōu)化》，該文章發(fā)表于《藥物生物技木》，2005，12 (1):19~21。由圖1可見，在0~8h時，納豆菌生長處于調整期；10~22h后處于對數(shù)生長期，22~24h處于穩(wěn)定期，而后快速下降，進入衰退期。本研究采用發(fā)酵最佳時間為24h。
[0060]培養(yǎng)溫度對產(chǎn)酶的影響:在裝有400mL種子培養(yǎng)基的1000mL錐形瓶中接入5%的種子液，溫度分別為25°C、28°C、35°C、39°C，搖床轉速為140r/min，培養(yǎng)24h后測定酶活力；以溫度為橫坐標，酶活力為縱坐標，作圖為培養(yǎng)溫度對納豆菌產(chǎn)酶的影響曲線。由圖2可見,在35°C下酶活力最高,酶 活力為173.2U/mL。因此納豆菌發(fā)酵產(chǎn)酶的最適溫度為35°C。本研究采用35°C下發(fā)酵生產(chǎn)酶。
[0061]不同轉速對產(chǎn)酶的影響:在裝有400mL種子培養(yǎng)基的1000mL錐形瓶中接入5%的種子液，溫度為35°C，搖床轉速分別為100r/min、140r/min、170r/min、200r/min，培養(yǎng)24h后測定酶活力；以搖床轉速為橫坐標，酶活力為縱坐標，作圖為搖床轉速對納豆菌產(chǎn)酶的影響曲線。由圖3可見，搖床轉速為170r/min為納豆菌產(chǎn)酶的最適轉速。因此本研究采用搖床轉速170r/min發(fā)酵生產(chǎn)酶。
[0062]L9 (34)正交設計:在單因素確定的基礎上，采用L9 (34)正交實驗對pH、接種量、裝液量3個因素進行優(yōu)化，從而確定納豆菌產(chǎn)酶的最適條件；三因素分別是:A---pH:Al (pH6)，A2 (pH7)，A3 (pH8) ；B接種量:BI (5%)，B2 (10%)，B3 (15%) ；C裝液量:Cl (40%)，C2 (50%)，C3 (60%);培養(yǎng)條件具體為:采用1000mL錐形瓶裝液，搖床轉速為170r/min，溫度為35°C,培養(yǎng)時間為24h ;分別測定酶活力。結果如表1,從表1中看出，對納豆菌發(fā)酵的影響程度為A > B > C ;而最佳組合為A2B3C1,即:pH7，接種量15%，裝液量40%。
[0063]表1納豆菌液體發(fā)酵正交試驗分析表
[0064]
【權利要求】
1.一種納豆激酶的提純方法，包括以下步驟: 1)提取:將納豆菌發(fā)酵液或粗納豆激酶溶液進行2000r/min離心，收集上清液，得粗酶液； 2)超過濾:將所述粗酶液進行超過濾，收集排阻相對分子質量為10000以上的物質，得超濾濃縮液； 3)葡聚糖凝膠G-50柱層析: 用PH值為7.5、濃度為0.lmol/L的磷酸鈉緩沖液平衡并裝柱，取所述超濾濃縮液上樣，用PH值為7.5、濃度為0.lmol/L的磷酸鈉緩沖液洗脫；收集洗脫液，合并含酶的洗脫液，并濃縮至原體積的1/3，得第一濃縮液； 4)Amberlite IRC-50陽離子交換柱層析: 裝柱，取所述第一濃縮液上樣，用pH值為6.0、濃度為l/15mol/L的磷酸鈉緩沖液與pH值為8.0、濃度為0.2mol/L的磷酸鈉緩沖液進行線性梯度洗脫；收集洗脫液,合并含酶的洗脫液，用PH值為7.5、濃度為0.lmol/L的磷酸鈉緩沖液透析，濃縮至原體積的1/3，得第二濃縮液； 5)DEAE-CelluloseDE-52陰離子交換柱層析: 裝柱，取所述第二濃縮液上樣，用PH值為6.0、濃度為l/15mol/L的磷酸鈉緩沖液與pH值為pH8.0、濃度為0.2mol/L的磷酸鈉緩沖液進行線性梯度洗脫；收集洗脫液，合并含酶的洗脫液，用PH值為7.5、濃度為0.lmol/L磷酸鈉緩沖液透析，濃縮至原體積的1/3，得第三濃縮液； 6)將所述第三濃縮液裝在無蓋培養(yǎng)皿中，放置在4°C下，直至出現(xiàn)結晶，取結晶在干燥器中進行干燥，收集結晶粉末，得納豆激酶酶蛋白結晶。
2.—種納豆激酶的制備方法，包括以下步驟: 1)種子菌制備: 101)菌種活化:將納豆菌轉移至斜面培養(yǎng)基，35°C培養(yǎng)24h； 102)種子液制備:取一環(huán)活化菌種，接入裝有500mL種子培養(yǎng)基的1000mL錐形瓶，在溫度為35°C和搖床轉速為140r/min的條件下培養(yǎng)24h，得種子液； 103)種子擴大培養(yǎng):在IOL種子罐中裝入5L種子培養(yǎng)基，滅菌并冷卻后接入750mL種子液，并加入2-3mL豆油，通入無菌空氣，控制溫度在35°C，培養(yǎng)24h，得二級種子菌； 2)納豆菌液體發(fā)酵: 在100L發(fā)酵罐中裝入40L發(fā)酵培養(yǎng)基，滅菌冷卻后接入6L 二級種子菌，并加入20mL豆油，通入無菌空氣，控制溫度在35°C,培養(yǎng)24h，得納豆菌發(fā)酵液； 其中，所述斜面培養(yǎng)基為營養(yǎng)瓊脂；種子培養(yǎng)基的組分為:蛋白胨1.5%、葡萄糖1.5%、氯化鈉0.5%，種子培養(yǎng)基的pH值為7.5 ;發(fā)酵培養(yǎng)基的組分為:蛋白胨1.5%、葡萄糖2%、磷酸氫二鉀0.4%、磷酸二氫鉀0.2%、硫酸鎂0.05%、大豆1%、玉米0.2%、蠶蛹粉0.2%，發(fā)酵培養(yǎng)基的PH值為7.5 ； 3)提取:將納豆菌發(fā)酵液進行2000r/min離心，收集上清液，得粗酶液； 4)超過濾:將所述粗酶液進行超過濾，收集排阻相對分子質量為10000以上的物質，得超濾濃縮液； 5)葡聚糖凝膠G-50柱層析:用pH值為7.5、濃度為0.lmol/L的磷酸鈉緩沖液平衡并裝柱，取所述超濾濃縮液上樣，用PH值為7.5、濃度為0.lmol/L的磷酸鈉緩沖液洗脫；收集洗脫液，合并含酶的洗脫液，并濃縮至原體積的1/3，得第一濃縮液； 6)Amberlite IRC-50陽離子交換柱層析: 裝柱，取所述第一濃縮液上樣，用pH值為6.0、濃度為l/15mol/L的磷酸鈉緩沖液與pH值為8.0、濃度為0.2mol/L的磷酸鈉緩沖液進行線性梯度洗脫；收集洗脫液,合并含酶的洗脫液，用PH值為7.5、濃度為0.lmol/L的磷酸鈉緩沖液透析，并濃縮至原體積的1/3，得第二濃縮液； 7)DEAE-CelluloseDE-52陰離子交換柱層析: 裝柱，取所述第二濃縮液上樣，用PH值為6.0、濃度為l/15mol/L的磷酸鈉緩沖液與pH值為pH8.0、濃度為0.2mol/L的磷酸鈉緩沖液進行線性梯度洗脫；收集洗脫液，合并含酶的洗脫液，用PH值為7.5、濃度為0.lmol/L磷酸鈉緩沖液透析，濃縮至原體積的1/3，得第三濃縮液； 8)將所述第三濃縮液裝在無蓋培養(yǎng)皿中，放置在4°C下，直至出現(xiàn)結晶，取結晶在干燥器中進行干燥，收集 結晶粉末，得納豆激酶酶蛋白結晶。
【文檔編號】C12R1/07GK103589706SQ201310149128
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年4月25日 優(yōu)先權日:2013年4月25日
【發(fā)明者】馬義福, 胡永剛, 徐鳳彩, 邵玉珠 申請人:珠海市御品堂生物科技有限公司