專利名稱：一種通過構建短肽串聯(lián)體酵母表達質粒制備活性小肽的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物工程技術領域，具體涉及一種通過構建短肽串聯(lián)體酵母表達質粒來制備活性小肽的方法。
背景技術：
許多短肽分子量很小，由十幾或幾十個氨基酸殘基組成，卻是功能性完整的分子，有重要的無法替代的活性。短肽氨基酸數(shù)目少，利用化學方法合成具有一定優(yōu)勢，但是在多肽化學合成中，尤其是在活化步驟中，存在著氨基酸消旋化的可能，而且有些分子中含有較多修飾氨基酸殘基，給化學合成帶來很多麻煩。隨著分子生物學和基因工程技術的快速進展，人們嘗試利用基因工程法制備許多有重要實用價值的生物制品；而且，基因工程方法具有周期短、操作簡單、成本低廉和蛋白質產(chǎn)量高的優(yōu)點，在許多短肽的生產(chǎn)中仍具有重要應用價值。由于這些短肽的相對分子質量較小，在表達時易被宿主蛋白酶降解，利用融合蛋白表達技術有利于蛋白質性質的改良和后期純化，但由于在融合蛋白中短肽所占的比例不高，產(chǎn)量仍然較低。如果將短肽基因串聯(lián)起來，適當增加拷貝數(shù)，可以提高表達量，這在一些短肽如抗菌肽、線性表位、心鈉素、血管緊張素酶抑制劑等的生產(chǎn)方面具有很好的應用前景。

發(fā)明內容
本發(fā)明旨在提高上述短肽表達量，提出一種通過構建短肽串聯(lián)體酵母表達質粒制備活性小肽的方法:(I)為使短肽能夠相互連接形成短肽串聯(lián)體，短肽序列需要進行一定的修飾。經(jīng)過修飾的短肽5’端含有限制性同尾酶的酶切位點Tl，短肽3’端含有限制性同尾酶的酶切位點T2，其中Tl、T2為一對限制性同尾酶的酶切位點，如XhoI和Sail、XbaI和Nhel、BamHI和BglII等酶切位點。同時，為使最后表達出的短肽串聯(lián)體大分子蛋白能夠被分割成單個短肽蛋白，短肽兩端的酶切位點的內側應各含有一個蛋白切割位點，分別稱之為G1、G2，G1、G2為兩個不同的蛋白切割位點，均可被各自對應的蛋白酶或化學試劑切割。常見的蛋白切割位點如甲硫氨酸(Met)可被溴化氰(CNBr)切割；天冬酰胺(Asn)-甘氨酸(Gly)可被羥胺(NH2OH)切割；C端的Lys或Arg可被羧肽酶B切割等等。為得到上述能夠用于構建短肽串聯(lián)體經(jīng)過修飾的的單個短肽序列，我們采用SOE-PCR的方法，其具體操作步驟如下:首先，我們根據(jù)SOE-PCR方法設計上、下游引物的基本原則，將短肽序列D(氨基酸數(shù)目一般不大于100)的前半部分(短肽堿基數(shù)目的一半即可)命名為Dl，結合前面所述在其5’端依次加入修飾基因Tl、G1，我們就可以得到用于SOE-PCR的上游引物(5’-3’ ):T1及其保護堿基一Gl一Dl ;然后，將Dl序列后端的5_10個堿基和短肽序列D的后半部分合起來命名為D2，其互補序列為D2’(這樣Dl序列后端的5-10個堿基與D2’序列前端的5-10個堿基互為互補序列，在進行SOE-PCR反應時就能使上下游引物結合在一起)，結合前面所述在3’端依次加入修飾基因G2、T2的互補序列G2’、T2’，我們就可以得到用于3(^40 的下游引物(3’-5’):02’一62’一了2’及其保護堿基互補序列。得到上述引物之后，用SOE-PCR的方法就能得到經(jīng)過修飾的單個短肽序列，其序列構成如下:Tl及其保護堿基一Gl一D一G2一Τ2及其保護堿基其中，T1、Τ2為限制性內切酶的酶切位點，并且T1、Τ2互為同尾酶；T1、Τ2的保護堿基(在分子克隆實驗中，有時我們會在待擴增的目的基因片段兩端加上特定的酶切位點，用于后續(xù)的酶切和連接反應，由于直接暴露在末端的酶切位點不容易直接被限制性核酸內切酶切開，因此在設計PCR引物時，人為的在酶切位點序列的外側添加額外的堿基序列，即保護堿基，用來提高將來酶切時的活性。加入的保護堿基序列會在隨后的酶切反應中被切除，因此在設計上下游引物時加入保護堿基并不會影響最后的短肽串聯(lián)體序列的蛋白表達)；GU G2為蛋白切割位點，D為短肽序列(由于對短肽的修飾都是在短肽的兩端進行，并不會改變短肽自身序列，因此該方案能夠適用于所有短肽)。(2)在構建含有短肽串聯(lián)體的酵母表達質粒時，由于酵母表達質粒(如酵母表達質粒pPICZa系列等)中通常不同時含有一對互為同尾酶的兩個限制性內切酶的酶切位點(如酵母表達質粒PPICZa只有XhoI酶切位點而沒有SalI酶切位點，只有XbaI酶切位點而沒有NheI酶切位點)，因此直接構建含有短肽串聯(lián)體的酵母表達質粒操作性不強。我們的解決方法是:在酵母表達質粒上只有兩個同尾酶之一 Tl的前提下，我們在酵母表達質粒上選擇位置在Tl之后的任何一個其他酶切位點，我們稱之為R。然后我們在短肽串聯(lián)體T2之后引入酶切位點R (這樣整個短肽串聯(lián)體序列就能被包含在酶切位點Tl和R之間)，即酵母表達質粒上有酶切位點Tl和R，而短肽串聯(lián)體上也有酶切位點Tl、R，這樣我們就能將短肽串聯(lián)體通過雙酶切的方法轉化進酵母表達質粒。因此在構建含有短肽串聯(lián)體的酵母表達質粒之前，我們需要先為短肽串聯(lián)體引入酶切位點R。在短肽串聯(lián)體中引入酶切位點R，具體步驟如下:選擇一種質 粒X，其含有一對同尾酶Tl、T2酶切位點且同時含有酵母表達質粒中也有的酶切位點R (如pBluescriptIISK+質粒中不僅同時含有一對同尾酶Xho I和Sail，而且還含有pPICZa酵母表達質粒中也有的Xba1、Sac I1、NotI)，將質粒X用T1、T2進行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳并回收目的條帶(被兩種酶切開的線性化質粒X的長片段)。將上述回收的經(jīng)過雙酶切的質粒X的長片段和步驟I得到的經(jīng)過修飾的單個短肽序列及限制性內切酶Tl、限制性內切酶Τ2及Τ4連接酶組成混合體系(質粒X的長片段、經(jīng)過修飾的單個短肽序列、Tl、Τ2和Τ4連接酶的物質的量之比依次為1:6:1:1:1，混合于IOX反應緩沖液，其余體積由水補齊；10Χ反應緩沖液組成為(10 X表示使用反應緩沖液時要將其濃度稀釋10倍)，Tris-HCl (pH7.6) 660mmol/L，MgCl266mmol/L，DTT100mmol/L，ATPlmmol/L，NaCllmol/L)。先在37°C溫度條件下(雙酶切反應適宜的溫度)雙酶切一定時間(Ih 2h)，接著將混合體系在16°C溫度條件下(連接酶適宜的溫度)連接一定時間(Ih 2h)。循環(huán)該過程數(shù)次(10次 20次)后，65°C終止反應，醇沉，重懸得到含有不同倍數(shù)短肽串聯(lián)體的重組質粒X(由于短肽與短肽之間、形成串聯(lián)體的短肽與質粒之間是隨機連接，因此不同的重組質粒含有的短肽串聯(lián)體倍數(shù)不同)。得到的重組質粒上不僅有短肽串聯(lián)體，而且串聯(lián)體序列之后有酶切位點R，這樣我們就為短肽串聯(lián)體引入了酶切位點R。由于在短肽基因兩端引入了一對同尾酶的酶切位點，所以在雙酶切后進行連接時，如果兩個短肽基因正向順次串聯(lián)，則在下一輪酶切時兩短肽間的連接處將不被切開；而如果兩短肽對向連接，則在下一輪酶切時兩短肽間的連接處將被切開。這樣，經(jīng)過若干輪的切連反應后，將會只有正確構建的順次串聯(lián)短肽的重組質粒產(chǎn)生。步驟(2)的意義在于:構建重組質粒X的目的在于引入能夠把串聯(lián)體轉化進酵母表達質粒所必須的其他酶切位點。(3)將構建好的重組質粒X轉化到質粒克隆菌株中(常用的克隆菌株有E.coliDH5a、BL21、JM109等)，小量提取質粒，雙酶切并測序鑒定，保存含有所需串聯(lián)體個數(shù)的菌種，并提取含所需倍數(shù)的短肽串聯(lián)體的質粒以進行表達質粒的構建。(4)將步驟3得到的含所需串聯(lián)體個數(shù)的重組質粒和酵母表達質粒分別用限制性內切酶Tl、限制性內切酶R進行雙酶切反應，瓊脂糖電泳，分別回收重組質粒經(jīng)過雙酶切得到的串聯(lián)體片段及空酵母表達質粒經(jīng)過雙酶切得到的長片段。(5)將回收的串聯(lián)體片段和酵母表達質粒長片段加入到含有T4連接酶的連接體系(串聯(lián)體片段:酵母表達質粒:T4連接酶的物質的量之比依次為6:1:1，混合于IOX反應緩沖液，其余體積由雙蒸水補齊)，在Τ4連接酶適宜的溫度條件連接一定時間(12h 16h)，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、膠回收得到含有所需倍數(shù)(由于質粒載體的最大插入片段約為10kb，因此根據(jù)短肽的大小便可確定所能夠建的短肽最大串聯(lián)倍數(shù)，然后根據(jù)表達的需要選擇合適的倍數(shù)，如一短肽大小為lOObp，那么理論上在質粒載體上所能夠建的最大串聯(lián)倍數(shù)為100倍，然后根據(jù)表達的需要，一般可以為I 100倍，進一步優(yōu)選為I 50倍，再進一步優(yōu)選為I 16倍)短肽串聯(lián)體的表達質粒。(6)將得到的酵母表達質粒轉化到質?？寺【曛校×刻崛≠|粒，雙酶切鑒定。(7)將經(jīng)過鑒定、構建好的酵母表達質粒轉化進酵母菌GS115中，用濃度為100%的甲醇進行誘導表達。(8)取誘導表達 后的菌液，12000rpm離心2 3min，分別收集上清液和沉淀，根據(jù)所表達的短肽分泌方式初步確定串聯(lián) 短肽存在于上清液還是沉淀，之后將含有串聯(lián)短肽的上清液或沉淀選擇合適的方法進行純化，最后用Gl和G2蛋白切割位點所對應的蛋白酶或化學試劑切割將串聯(lián)短肽切割為目的短肽。本發(fā)明的特點是可以通過該方法用酵母菌高效表達多種小分子短肽，這些短肽有重要應用價值；此外，利用串聯(lián)短肽質粒的高效表達，產(chǎn)品開發(fā)成本極低。


圖1:實施例所述的抗菌肽凝膠電泳圖:其中M:核酸maker, I:SOE-PCR得到的抗菌肽。圖2:實施例1所述的表達質粒pPICZa-T經(jīng)過雙酶切的凝膠電泳圖；其中M:核酸maker, 1:單倍體抗菌肽(makerlOO對應位置)。圖3:實施例2、3、4所述的表達質粒pPICZa-4T、pPICZa-8T、pPICZa_16T經(jīng)過雙酶切的凝膠電泳圖；其中Ml:核酸maker，I:4倍抗菌肽串聯(lián)體(maker400對應位置)，2:8倍抗菌肽串聯(lián)體(maker750對應位置)，3:16倍抗菌肽串聯(lián)體(maker2000與1000中間對應位置)，M2:核酸 maker。圖4:實施例1所述的表達質粒pPICZa-T的基因測序圖譜。圖5:實施例2所述的表達質粒pPICZa_4T的基因測序圖譜。
圖6:實施例3所述的表達質粒pPICZa_8T的基因測序圖譜，由于本測序圖譜中序列較長，因此將該圖譜分為圖6a、圖6b兩個圖譜。
具體實施例方式本發(fā)明結合以下抗菌肽為實例作進一步說明，該實例不應解釋為對本發(fā)明的限制。實施例1(I)為使抗菌肽兩端各含有一個同尾酶和一個蛋白切割位點，因此，在設計抗菌肽上、下游引物時分別引入了 Xho I和Sal I兩種同尾酶的酶切位點。同時，分別在酶切位點內側于氨基端引入了溴化氰(CNBr)蛋白切割位點甲硫氨酸(Met)的密碼子(ATG);于羧基端引入了羥胺(NH20H)的蛋白切割位點(天冬酰胺(Asn) -甘氨酸(Gly))的密碼子AATGGA。抗菌肽的基因編碼序列為(其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；其氨基酸序列如SEQ ID NO:2 所示):aagtggaagtccttcctgaagaccttcaagtccgctgctaagactgttctgcatactgctctgaaggctatttcctcc ；上游引物(5，-3’):tcgactcgagatgaagtggaagtccttcctgaagaccttcaagtccgctgctaagactgttctg ；下游引物(3’-5’):ctgacttctagagtcgactccattaggaggaaatagccttcagagcagtatgcagaacagtcttag ；

使用上述引物通過SOE-PCR的方法得到經(jīng)過修飾的抗菌肽全長基因如下:tcgactcgagatgaagtggaagtccttcctgaagaccttcaagtccgctgctaagactgttctgcatactgctctgaaggctatttcctccaatgga^tcgactctagaagtcag ；其中5’端有下劃線的CtCRaR是限制性內切酶Xho I識別位點，粗體顯示的atg是溴化氰(CNBr)蛋白切割位點；3’端有下劃線的Rtcgac是限制性內切酶SalI識別位點，粗體顯示的aatgga是羥胺(NH20H)的蛋白切割位點，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。(2)將 pBluescriptIISK+ 空質粒用 Xho I 和 Sal I 在 50 μ L 體系、37°C條件下進行雙酶切，瓊脂糖電泳并回收用于構建短肽串聯(lián)體重組質粒的目的條帶(被兩種酶切開的線性化pBluescriptIISK+質粒長片段)。根據(jù)各自的濃度將雙酶切后的pBluescriptIISK+空質粒、步驟⑴得到的SOE-PCR產(chǎn)物、Xho 1、Sal I和T4連接酶按適當?shù)谋壤?pBluescriptIISK+空質粒、SOE-PCR產(chǎn)物、Xho 1、Sal I和T4連接酶物質的量之比依次為
I:6:1:1:1)混合在特制的 IOX 反應緩沖液(Tris-HCl (pH7.6) 660mmol/L,MgCl266mmol/L，DTT100mmol/L，ATPlmmol/L，NaCllmol/L)中，其余體積由雙蒸水補齊?；旌象w系先在37°C酶切l(wèi)h，接著將混合體系在22°C接lh。循環(huán)該過程10次后，65°C止反應，醇沉，重懸分別含有不同倍數(shù)抗菌肽串聯(lián)體的pBluescriptIISK+重組質粒,濃度為100mg/mL。(3)將得到的pBluescriptIISK+重組質粒轉化進大腸桿菌DH5 α中，在氨節(jié)青霉素濃度為100mg/L的平板上挑單菌落，小量提取質粒、雙酶切并測序鑒定。保存所需菌種(其質粒中含有單倍體抗菌肽，即I倍體抗菌肽)，并從中提取質粒以進行表達質粒的構建。(4)將pBluescriptIISK+重組質粒和空酵母表達質粒pPICZa分別用Xho I和XbaI兩種限制性內切酶進行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳，分別回收重組質粒經(jīng)過雙酶切得到的單倍體抗菌肽片段(其核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示)及空酵母表達質粒pPICZa經(jīng)過雙酶切得到的長片段。(5)根據(jù)各自的濃度將回收的單倍體抗菌肽串聯(lián)體片段和雙酶切后的空表達質粒長片段加入含有T4連接酶的連接體系(串聯(lián)體片段:質粒:T4連接酶的物質的量之比依次為6:1:1，混合于IOX反應緩沖液，其余體積由雙蒸水補齊)，在連接酶適宜的溫度條件下(37°C)連接一定時間(12h 16h)，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、膠回收得到含有單倍體抗菌肽的表達質粒pPICZa-T,濃度為110mg/mL。(6)將得到的表達質粒pPICZa-T轉化進Ε.coli DH5a中，在zeocin濃度為50mg/L的平板上挑單菌落，小量提取質粒、雙酶切鑒定。(7)將構建好的含有單倍體抗菌肽的表達質粒pPICZa-T電轉化到酵母菌GS115中，用濃度為100%的甲醇進行誘導表達。(8)取誘導表達后的菌液，12000rpm離心2 3min，分別收集上清液和沉淀，因抗菌肽為分泌表達，因此目的蛋白存在于上清液，取上清液經(jīng)鎳柱純化抗菌肽，再先后用CNBr和NH2OH將抗菌肽切割為目的短肽，凝膠層析純化后凍干保存。經(jīng)質譜分析得到的抗菌肽分子量為2892，薄層掃描得其純度為94%，產(chǎn)率為6mg/L發(fā)酵液。

實施例2(I)如實施例1步驟(I)。(2)如實施例1步驟⑵。(3)將得到的pBluescriptIISK+重組質粒轉化進大腸桿菌DH5 α中，在氨節(jié)青霉素濃度為100mg/L的平板上挑單菌落，小量提取質粒、雙酶切并測序鑒定。保存所需菌種(其質粒中含有正確串聯(lián)的4倍抗菌肽串聯(lián)體)，并從中提取含4倍抗菌肽串聯(lián)體的質粒以進行表達質粒的構建。(4)將pBluescriptIISK+重組質粒和空酵母表達質粒pPICZa分別用Xho I和XbaI兩種限制性內切酶進行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳，分別回收重組質粒經(jīng)過雙酶切得到的4倍抗菌肽串聯(lián)體片段(其核苷酸序列如SEQ ID NO: 5所示)及空酵母表達質粒pPICZa經(jīng)過雙酶切得到的長片段。(5)根據(jù)各自的濃度將回收的4倍抗菌肽串聯(lián)體片段和雙酶切后的空表達質粒長片段加入含有T4連接酶的連接體系(串聯(lián)體片段:質粒:T4連接酶的物質的量之比依次為6:1:1，混合于10Χ反應緩沖液，其余體積由雙蒸水補齊)，在連接酶適宜的溫度條件下(37°C)連接一定時間(12h 16h)，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、膠回收得到含有4倍串聯(lián)體抗菌肽串聯(lián)體的表達質粒pPICZa-4T，濃度為135mg/mL。(6)將得到的表達質粒pPICZa_4T轉化進Ε.coli DH5a中，在zeocin濃度為50mg/L的平板上挑單菌落，小量提取質粒、雙酶切鑒定。(7)將構建好的含有4倍串聯(lián)體抗菌肽串聯(lián)體表達質粒pPICZa_4T電轉化到酵母菌GSl 15中，用濃度為100%的甲醇進行誘導表達。(8)取誘導表達后的菌液，12000rpm離心2 3min，分別收集上清液和沉淀，因抗菌肽為分泌表達，因此目的蛋白存在于上清液，取上清液經(jīng)鎳柱純化串聯(lián)抗菌肽，再先后用CNBr和NH2OH將串聯(lián)抗菌肽切割為目的短肽，凝膠層析純化后凍干保存。經(jīng)質譜分析得到的抗菌肽分子量為2892，薄層掃描得其純度為93%，產(chǎn)率為19mg/L發(fā)酵液。
實施例3(I)如實施例1步驟(I)0(2)如實施例1步驟⑵。(3)將得到的pBluescriptIISK+重組質粒轉化進大腸桿菌DH5 α中，在氨節(jié)青霉素濃度為100mg/L的平板上挑單菌落，小量提取質粒、雙酶切并測序鑒定。保存所需菌種(其質粒中含有正確串聯(lián)的8倍抗菌肽串聯(lián)體)，并從中提取含8倍抗菌肽串聯(lián)體的質粒以進行表達質粒的構建。(4)將pBluescriptIISK+重組質粒和空酵母表達質粒pPICZa分別用Xho I和XbaI兩種限制性內切酶進行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳，分別回收重組質粒經(jīng)過雙酶切得到的8倍抗菌肽串聯(lián)體片段(其核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示)及空酵母表達質粒pPICZa經(jīng)過雙酶切得到的長片段。(5)根據(jù)各自的濃度將回收的8倍抗菌肽串聯(lián)體片段和雙酶切后的空表達質粒長片段加入含有T4連接酶的連接體系(串聯(lián)體片段:質粒:T4連接酶的物質的量之比依次為6:1:1，混合于IOX反應緩沖液，其余體積由雙蒸水補齊)，在連接酶適宜的溫度條件下(37°C)連接一定時間(12h 16h)，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、膠回收得到含有8倍串聯(lián)體抗菌肽串聯(lián)體的表達質粒pPICZa-8T，濃度為115mg/mL。(6)將得到的表達質粒pPICZa_8T轉化進Ε.coli DH5a中，在zeocin濃度為50mg/L的平板上挑單菌落，小量提取質粒、雙酶切鑒定。(7)將構建好的含有8倍串聯(lián)體抗菌肽串聯(lián)體表達質粒pPICZa_8T電轉化到酵母菌GSl 15中，用濃度為100%的甲醇進行誘導表達。(8)取誘導 表達后的菌液，12000rpm離心2 3min，分別收集上清液和沉淀，因抗菌肽為分泌表達，因此目的蛋白存在于上清液，取上清液經(jīng)鎳柱純化串聯(lián)抗菌肽，再先后用CNBr和NH2OH將串聯(lián)抗菌肽切割為目的短肽，凝膠層析純化后凍干保存。經(jīng)質譜分析得到的抗菌肽分子量為2892，薄層掃描得其純度為96%，產(chǎn)率為39mg/L發(fā)酵液。實施例4(I)如實施例1步驟(I)0(2)如實施例1步驟⑵。(3)將得到的pBluescriptIISK+重組質粒轉化進大腸桿菌DH5 α中，在氨節(jié)青霉素濃度為100mg/L的平板上挑單菌落，小量提取質粒、雙酶切并測序鑒定。保存所需菌種(其質粒中含有正確串聯(lián)的16倍抗菌肽串聯(lián)體)，并從中提取含16倍抗菌肽串聯(lián)體的質粒以進行表達質粒的構建。(4)將pBluescriptIISK+重組質粒和空酵母表達質粒pPICZa分別用Xho I和Xba I兩種限制性內切酶進行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳，分別回收重組質粒經(jīng)過雙酶切得到的16倍抗菌肽串聯(lián)體片段(其核苷酸序列如SEQ ID NO: 7所示)及空酵母表達質粒pPICZa經(jīng)過雙酶切得到的長片段。(5)根據(jù)各自的濃度將回收的16倍抗菌肽串聯(lián)體片段和雙酶切后的空表達質粒長片段加入含有T4連接酶的連接體系(串聯(lián)體片段:質粒:T4連接酶的物質的量之比依次為6:1:1，混合于10Χ反應緩沖液，其余體積由雙蒸水補齊)，在連接酶適宜的溫度條件下(37°C)連接一定時間(12h 16h)，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、膠回收得到含有16倍串聯(lián)體抗菌肽串聯(lián)體的表達質粒pPICZa-16T，濃度為120mg/mL。(6)將得到的表達質粒pPICZa_16T轉化進E.coli DH5a中，在zeocin濃度為50mg/L的平板上挑單菌落，小量提取質粒、雙酶切鑒定。(7)將構建好的含有16倍串聯(lián)體抗菌肽串聯(lián)體表達質粒電轉化到酵母菌GS115中，用濃度為100%的甲醇進行誘導表達。(8)取誘導表達后的菌液，12000rpm離心2 3min，分別收集上清液和沉淀，因抗菌肽為分泌表達，因此目的蛋白存在于上清液，取上清液經(jīng)鎳柱純化串聯(lián)抗菌肽，再先后用CNBr和NH2OH將串聯(lián)抗菌肽切割為目的短肽，凝膠層析純化后凍干保存。經(jīng)質譜分析得到的抗菌肽分子量為2892，薄層掃描得其純度為94%，產(chǎn)率為67mg/L發(fā)酵液。無需進一步詳細闡述，相信采用前面所公開的內容，本領域技術工作人員可最大限度的應用本發(fā)明。因此， 前面的優(yōu)選具體實施方案應理解為僅是舉例說明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
權利要求
1.一種通過構建短肽串聯(lián)體酵母表達質粒制備活性小肽的方法，其步驟如下: (1)將短肽序列D的前半部分命名為D1，在其5’端依次加入修飾基因Tl、Gl，得到上游引物:T1及其保護堿基一Gl一Dl ;然后，將Dl序列后端的5 10個堿基和短肽序列D的后半部分合起來命名為D2，其互補序列為D2’，在3’端依次加入修飾基因G2、T2的互補序列G2’、T2’，得到下游引物:D2’一G2’一Τ2’及其保護堿基互補序列； 用SOE-PCR的方法得到經(jīng)過修飾的單個短肽序列，其序列構成如下: Tl及其保護堿基一Gl一D一G2一T2及其保護堿基 其中，Tl、T2為限制性內切酶的酶切位點，并且Tl、T2互為同尾酶；G1、G2為蛋白切割位點，D為短肽序列； (2)選擇質粒X，其含有一對同尾酶T1、T2酶切位點且同時含有酵母表達質粒中也有的酶切位點R，將質粒X用Tl、Τ2進行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳并回收目的條帶；將上述回收的經(jīng)過雙酶切的質粒X的長片段和步驟(I)得到的經(jīng)過修飾的單個短肽序列及限制性內切酶Tl、限制性內切酶Τ2、Τ4連接酶組成混合體系，先在37°C溫度條件下雙酶切Ih 2h，接著將混合體系在16°C溫度條件下連接Ih 2h ;循環(huán)該過程數(shù)次后，65°C終止反應，醇沉，重懸得到含有不同倍數(shù)短肽串聯(lián)體的重組質粒X ;得到的重組質粒上不僅有短肽串聯(lián)體，而且串聯(lián)體序列之后有酶切位點R，這樣我們就為短肽串聯(lián)體引入了酶切位點R ； (3)將構建好的重組質粒X轉化到質粒克隆菌株中，小量提取質粒，雙酶切并測序鑒定，保存含有所需串聯(lián)體個數(shù)的菌種，并提取含所需倍數(shù)的短肽串聯(lián)體的質粒以進行表達質粒的構建； (4)將步驟(3)得到的含所需串聯(lián)體個數(shù)的重組質粒和酵母表達質粒分別用限制性內切酶Tl、限制性內切酶R進行雙酶切反應，瓊脂糖電泳，分別回收重組質粒經(jīng)過雙酶切得到的串聯(lián)體片段及空酵 母表達質粒經(jīng)過雙酶切得到的長片段； (5)將回收的串聯(lián)體片段和酵母表達質粒長片段加入到含有T4連接酶的連接體系，在T4連接酶適宜的溫度條件連接12h 16h，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、膠回收得到含有所需倍數(shù)短妝串聯(lián)體的表達質粒； (6)將得到的酵母表達質粒轉化到質?？寺【曛?，小量提取質粒，雙酶切鑒定； (7)將經(jīng)過鑒定、構建好的酵母表達質粒轉化進酵母菌GS115中，進行100%甲醇誘導表達； (8)取誘導表達后的菌液，離心2 3min，分別收集上清液和沉淀，之后將含有串聯(lián)短肽的上清液或沉淀選擇合適的方法進行純化，最后用Gl和G2蛋白切割位點所對應的蛋白酶或化學試劑切割將串聯(lián)短肽切割為目的短肽，從而制備得到活性小肽。
2.如權利要求1所述的一種通過構建短肽串聯(lián)體酵母表達質粒制備活性小肽的方法，其特征在于:步驟(2)中質粒X的長片段、經(jīng)過修飾的單個短肽序列、T1、T2和Τ4連接酶的物質的量之比依次為1:6:1:1:1。
3.如權利要求1所述的一種通過構建短肽串聯(lián)體酵母表達質粒制備活性小肽的方法，其特征在于:步驟(3)中質?？寺【隇棣?coli DH5a、BL21或JM109。
4.如權利要求1所述的一種通過構建短肽串聯(lián)體酵母表達質粒制備活性小肽的方法，其特征在于:步驟⑶中短肽串聯(lián)體的倍數(shù)為I 16倍。
5.如權利要求1所述的一種通過構建短肽串聯(lián)體酵母表達質粒制備活性小肽的方法，其特征在于:步驟(5)中串聯(lián)體片段、酵母表達質粒、T4連接酶的物質的量之比依次為6:·1:1。
全文摘要
一種通過構建短肽串聯(lián)體酵母表達質粒制備活性小肽的方法，屬于生物工程技術領域。用SOE-PCR的方法擴增得到短肽的全長基因；將若干短肽的基因定向串聯(lián)起來；將得到的串聯(lián)基因構建到酵母菌的表達載體中，進而轉化酵母菌；誘導表達串聯(lián)多肽并切割成目的短肽。本發(fā)明的特點是可以通過該方法用酵母菌高效表達多種小分子短肽，這些短肽有重要應用價值；此外，利用串聯(lián)短肽質粒的高效表達，產(chǎn)品開發(fā)成本極低。
文檔編號C12N15/81GK103194483SQ20131015008
公開日2013年7月10日 申請日期2013年4月19日 優(yōu)先權日2013年4月19日
發(fā)明者施維, 趙昊, 張桂榮, 李全順, 于洋, 林雪貞 申請人:吉林大學