專利名稱：針對免疫球蛋白Fc段的單域重鏈抗體T10的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及單域重鏈抗體技術(shù)(又稱為納米抗體技術(shù))，以及基因工程抗體技術(shù)，特別是涉及針對免疫球蛋白 G (immunoglobulin G, IgG ) Fe 段(fragment crystalline,Fe)的單域重鏈抗體或多肽。
背景技術(shù)：
重鏈抗體(Heavy-chain antibody)是一種天然缺失輕鏈,僅由重鏈組成的抗體，存在于駱騎、S魚等動物中。單域重鏈抗體(又稱為納米抗體，VHH抗體，variable domainof heavy chain of heavy-chain antibody)是指僅由重鏈抗體可變區(qū)(Variable region)組成的基因工程抗體。與普通抗體相比，單域重鏈抗體具有分子量小，穩(wěn)定性高，水溶性好等優(yōu)點，目前已廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究、醫(yī)學(xué)診斷和檢測、藥物研發(fā)等領(lǐng)域。免疫球蛋白G (immunoglobulin G, IgG)由兩條相同的輕鏈和兩條相同的重鏈組成。每條鏈都含有可變區(qū)(variable region, V區(qū))和恒定區(qū)(constant region, C區(qū)),其中可變區(qū)提供抗原結(jié)合位點和特異性，恒定區(qū)構(gòu)成免疫球蛋白的框架，具有生物效應(yīng)功能。用木瓜蛋白酶消化IgG,可將其分成3個功能區(qū)，即2個相同的抗原結(jié)合片段(fragmentantigen binding, Fab)和一個可結(jié)晶片段(fragment crystalline, Fe)。Fe 段位于恒定區(qū)，由兩條重鏈羧基端的一半組成。由于Fe段遠(yuǎn)離抗原結(jié)合部位，因此提供了一個與抗體結(jié)合而不影響抗原抗體反應(yīng)的區(qū)域，是最有效的二抗試劑結(jié)合的表位區(qū)。目前，已有針對IgGFe段的多克隆抗體、單克隆抗體的公開報道。與單域重鏈抗體相比，這些抗體存在生產(chǎn)成本較高，制備過程繁瑣等缺點。單域抗體具備分子量小、穩(wěn)定性高、易于表達(dá)等性質(zhì)，具有廣闊的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明之目的是提供針對免疫球蛋白G的Fe段的單域重鏈抗體(包括含有所述單域重鏈抗體全部或部分功能區(qū)域的蛋白質(zhì)或多肽)及其氨基酸序列，可被用于制備檢測或純化、富集IgG的試劑和工具。一種針對免疫球蛋白Fe段的單域重鏈抗體，其特征如(a)或(b)所述:
(a)具有SEQID N0.:1所示的氨基酸序列；或
(b)將(a)中的氨基酸序列經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有針對免疫蛋白Fe段單域重鏈抗體結(jié)合活性的由(a)衍生的與(a)具有90%以上同源性的氨基酸序列。這些改造的序列可以通過常規(guī)的易錯PCR法對(a)序列進(jìn)行改造，并通過固相淘選和鑒定獲得，優(yōu)選(b)所述氨基酸序列為SEQ ID N0.:3或SEQ ID N0.:3或SEQ ID N0.:4序列。本發(fā)明還涉及編碼(a)或(b)所述針對免疫球蛋白Fe段的單域重鏈抗體的核苷酸序列；編碼(a)氨基酸序列的核苷酸序列優(yōu)選為SEQ ID N0:5所示的核苷酸序列。
本發(fā)明所提供的核苷酸序列或部分序列可以通過合適的表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)以得到相應(yīng)的蛋白質(zhì)或多肽。這些表達(dá)系統(tǒng)包括細(xì)菌，酵母菌，絲狀真菌，動物細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞，植物細(xì)胞，或無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。本發(fā)明還提供一種載體，包含所述核酸序列。由于遺傳密碼子具有簡并性，該核酸序列可以根據(jù)不同的應(yīng)用目的而不同。本發(fā)明涉及包含前述核苷酸序列的載體。以及包括所述載體的宿主細(xì)胞。前述針對免疫球蛋白Fe段單域重鏈抗體在建立純化或檢測免疫球蛋白方法中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了一種純化或檢測免疫球蛋白G的方法，其特征是含有上述蛋白質(zhì)或多肽?；诒景l(fā)明提供的蛋白質(zhì)或多肽與免疫球蛋白G特異性結(jié)合的能力，建立免疫球蛋白G的純化或檢測方法。其中，優(yōu)選的方法包括酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-linkedimmunosorbent assay, ELISA),突光免疫法(Fluoroimmunoassay, FIA),免疫芯片法和親和層析法。本發(fā)明所提供的 氨基酸序列可以作為前體，通過隨機(jī)或定點突變技術(shù)進(jìn)行改造，能夠獲得性質(zhì)(水溶性、穩(wěn)定性、親和力以及特異性等)更好的突變體，用來發(fā)展進(jìn)一步用于醫(yī)藥、工業(yè)、農(nóng)業(yè)的蛋白質(zhì)或多肽。本發(fā)明提供一種針對免疫球蛋白G的Fe段的單域重鏈抗體，具有SEQ ID N0.:1所示的氨基酸序列，其氨基酸序列的IMGT編號和結(jié)構(gòu)域的劃分如圖1所示。圖1所提供的單域重鏈抗體包括4個框架區(qū)(Framework region, FR)和三個互補(bǔ)決定區(qū)(Complementarity-determining region, CDR)。其中，框架區(qū)(FR1-FR4),互補(bǔ)決定區(qū)(CDR1-CDR3)?；パa(bǔ)決定區(qū)主要負(fù)責(zé)抗原的識別，框架區(qū)結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定，主要起著維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用。本發(fā)明中所敘述的一些術(shù)語具有如下含義:
同源性:描述兩個或更多氨基酸序列的相似程度，第一個氨基酸序列和第二個氨基酸序列之間同源性的百分比可以通過第一氨基酸序列中與第二氨基酸序列中相應(yīng)位置處的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的數(shù)量除以第一個氨基酸序列中氨基酸總數(shù)再乘以100%來計算，其中第二氨基酸序列中的某個氨基酸的缺失、插入、替換或添加(與第一氨基酸相比)被認(rèn)為是有差別。備選地，同源性百分比也可以利用已知的用于序列匹配的計算機(jī)運算程序如NCBI Blast獲得。結(jié)構(gòu)域:蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的基本結(jié)構(gòu)單位，通常具有一定的功能。IMGT 編號:IMGT 數(shù)據(jù)庫(The International ImMunoGeneTics Database)中的一種已經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化的抗體氨基酸序列編號方法。具體編號方法可以參考文獻(xiàn)(Ehrenmann，F(xiàn).，Q.Kaas, et al.(2010)."IMGT/3Dstructure_DB and IMGT/DomainGapAlign: adatabase and a tool for immunoglobulins or antibodies, T cell receptors, MHC,IgSF and MhcSF." Nucleic Acids Res 38 (Database issue): D301-307.Lefranc, M.P., C.Pommie, et al.(2003).〃IMGT unique numbering for immunoglobulin and Tcell receptor variable domains and Ig superfamily V-1ike domains.〃 Dev CompImmunol 27(1): 55-77.)中的描述。密碼子(codon):又稱為三聯(lián)體密碼(triplet code),指對應(yīng)于某種氨基酸的核苷酸三聯(lián)體。在轉(zhuǎn)譯過程中決定該種氨基酸插入生長中多肽鏈的位置。
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction, PCR):是一種常用的分子生物學(xué)實驗技術(shù)，可用于擴(kuò)增特定的DNA片段。


圖1氨基酸編號及結(jié)構(gòu)域示意圖。圖2間接phage-ELISA法測定噬菌體結(jié)合活性?？v坐標(biāo)表示ELISA讀數(shù)計測定450nm處吸光度值,橫坐標(biāo)表不按照表I加樣,其中mlgG表不實驗組,包被抗原為小鼠IgG,2表示背景對照，3表示空白對照a，4表示空白對照b。圖3間接phage-ELISA鑒定結(jié)合特異性?？v坐標(biāo)表示ELISA讀數(shù)計測定450nm處吸光度值，橫坐標(biāo)從左至右分別為包被小鼠IgGl、小鼠IgG2a、小鼠IgG2b、小鼠血清、人IgG的Fe片段，空白對照a、空白對照b和背景對照。圖4噬菌粒pHEN-TIO結(jié)構(gòu)圖。圖5表達(dá)質(zhì)粒pRXS -TIO結(jié)構(gòu)圖。圖6融合表達(dá)質(zhì)粒pAP-TIO。
具體實施例方式下面通過單域中鏈抗體的制備、分析以及應(yīng)用，對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，這些具體實施例不應(yīng)以任何方式被解釋為限制本發(fā)明的應(yīng)用范圍。實施例1:
抗IgG Fe段單域重鏈抗體的淘選與鑒定。采用固相親和淘選的方法從駝源天然單域重鏈抗體噬菌體展示文庫RJR2中淘選針對IgG Fe段的單域重鏈抗體。采用親和層析法純化小鼠血清，得到mlgG溶液。用PBS稀釋mlgG溶液至5(Tl00 y g/mL，每孔加入100 uL,4 °C，包被過夜；吸出包被液，PBS洗板3次，每孔加入300 u L 3% BSA-PBS, 37 °C，封閉2 h ；PBS洗板6次，加入100 u L噬菌體抗體庫(約含2X IO11 CFU)，37 °〇，孵育1.5 h ;吸出未結(jié)合的噬菌體，用PBST (含0.5 %Tween-20)洗板5次(逐輪增加I次)，再用PBS洗板10次(洗板次數(shù)逐輪增加5次);以100U L洗脫液(甘氨酸-鹽酸，pH 2.2)洗脫吸附在酶標(biāo)孔中的噬菌體，用50 u L Tris-HCl (Imol/L,pH 8.0)中和洗脫物，取10 U L用于滴度測定，其余洗脫物擴(kuò)增后用于下一輪淘選。經(jīng)三輪淘選后，采用輔助噬菌體KM13對隨機(jī)挑取的單克隆進(jìn)行救援，分別得到展示抗體可變區(qū)的噬菌體顆粒，再用間接ELISA測定噬菌體顆粒的結(jié)合活性(圖2)，實驗設(shè)定陰性對照及背景對照，具體加樣步驟見表I。表I間接phage-ELISA加樣表
權(quán)利要求
1.一種針對免疫球蛋白Fe段的單域重鏈抗體，其特征如(a)或(b)所述:(a)、具有SEQ ID N0.:1所示的氨基酸序列；或(b)、將(a)中的氨基酸序列經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有針對免疫蛋白Fe段單域重鏈抗體結(jié)合活性的由(a)衍生的與Ca)具有90%以上同源性的氨基酸序列。
2.如權(quán)利要求1所述的針對免疫球蛋白Fe段的單域重鏈抗體，其特征在于(b)所述氨基酸序列優(yōu)選為SEQ ID N0.:2或SEQ ID N0.:3或SEQ ID N0.:4序列。
3.編碼權(quán)利要求1或2所述針對免疫球蛋白Fe段的單域重鏈抗體的核苷酸序列。
4.如權(quán)利要求2所述的核苷酸序列，其特征在于為SEQID NO:5所示的核苷酸序列。
5.包含權(quán)利要求2或3所述核苷酸序列的載體。
6.—種包含權(quán)利要求5所述的載體的宿主細(xì)胞。
7.權(quán)利要求1或2所述的針對免疫球蛋白Fe段單域重鏈抗體在建立純化或檢測免疫球蛋白方法中的應(yīng)用，優(yōu)選為 ELISA法、熒光免疫法、免疫芯片法或親和層析法中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，一種針對免疫球蛋白Fc段的單域重鏈抗體如(a)或(b)所述(a)具有SEQ ID NO.:1所示的氨基酸序列；或(b)、將(a)中的氨基酸序列經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有針對免疫蛋白Fc段單域重鏈抗體結(jié)合活性的由(a)衍生的與(a)具有90%以上同源性的氨基酸序列。本發(fā)明抗體可被用于制備檢測或純化、富集IgG的試劑和工具。
文檔編號C12N15/63GK103204937SQ20131015095
公開日2013年7月17日 申請日期2013年4月26日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月26日
發(fā)明者毋森雍, 陶勇, 許楊, 涂追, 付金衡 申請人:山西德豐信成生物科技有限公司