專利名稱：棗樹2-半胱氨酸氧化還原酶基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種棗樹2-半胱氨酸氧化還原酶基因。
背景技術(shù)：
植物生長在大自然時(shí)常遭受著各種非生物脅迫，隨著世界環(huán)境的急劇變化這種非生物脅迫越來越嚴(yán)重?？寡趸甘侵参锓巧锩{迫中重要的防御系統(tǒng)，它們可通過降解的方法去除活性氧來抵抗非生物脅迫誘導(dǎo)產(chǎn)生的氧化傷害，從而減少對(duì)植物造成的傷害。但我們對(duì)抗氧化酶的功能及結(jié)構(gòu)特性的認(rèn)識(shí)仍很有限，還需要大量的工作。因此，克隆和鑒定植物中的具有抗氧化功能的基因，研究抗逆機(jī)制以及逆境相關(guān)基因的分子結(jié)構(gòu)、表達(dá)、功能及調(diào)控，可為充分利用這些優(yōu)良抗性基因提高植物的抗逆性提供一定的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和奠定理論基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種具有抗氧化功能的基因——棗樹2-半胱氨酸氧化還原酶基因，其可作為目的基因?qū)胫参?，提高植物抗逆性，進(jìn)行植物品種改良。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:一種棗樹2-半胱氨酸氧化還原酶基因，該基因的核苷酸序列是如SEQ ID NO:1所示的序列。一種棗樹2-半胱氨酸氧化還原酶基因編碼的氨基酸，該氨基酸的序列是如SEQ IDNO:2所示的序列。

一種棗樹2-半胱氨酸氧化還原酶基因編碼的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)的氨基酸序列是如SEQ ID N0:2所示的序列。一種棗樹2-半胱氨酸氧化還原酶基因在提高植物抗旱性、耐鹽性中的應(yīng)用。本發(fā)明從已經(jīng)構(gòu)建的壺瓶率jujuba Mill hupingzao)結(jié)果枝(即率吊)cDNA文庫中篩選到棗樹2-半胱氨酸氧化還原酶基因的全序列，將其命名為Zj2-CP{Ziziphus Jpjube 2rcys ^eroxiredoxin)0 生物信息學(xué)分析表明 Zj2_CP 基因的 cDNA序列全長為834bp，編碼277個(gè)氨基酸，分子量為30.65KD,理論等電點(diǎn)為8.95，CG含量為45.68%，不穩(wěn)定系數(shù)為41.56，脂溶指數(shù)為87.29，疏水性平均值為-0.12。通過分析得出該基因編碼的蛋白為膜外非分泌性蛋白，該基因編碼的蛋白與已知物種2-半胱氨酸氧化還原酶基因編碼蛋白的同源性為82% — 99%。根據(jù)棗樹2-半胱氨酸氧化還原酶基因的cDNA編碼的序列，設(shè)計(jì)帶有限制性內(nèi)切酶Sma I和Sal I酶切位點(diǎn)的特異性引物，Zj2_CP基因的上游引物W2的序列為:5，-ATAGTCGACAATGGCTTGCTCTG-3，，含有Sal I限制性酶切位點(diǎn)；Zj2_CP基因的下游引物W3的序列為:5’ -ATCCCGGGTTATTGCTGCAAAG-3’，含有Sma I限制性酶切位點(diǎn)。設(shè)計(jì)的引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。經(jīng)限制性內(nèi)切酶Sma I和Sal I修飾后連接于植物表達(dá)載體PEZR(K)-LNY上，經(jīng)過熱激法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)卡那霉素抗性篩選獲得陽性菌落，用堿裂解法提取陽性菌落質(zhì)粒，經(jīng)酶切，測(cè)序表明植物表達(dá)載體PEZR(K) -LNY-Zj2-CP構(gòu)建成功。通過凍融法將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒PEZR(K) -LNY-Zj2-CP轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404的感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)卡那霉素抗性篩選獲得陽性菌落，經(jīng)含卡納霉素的LB平板篩選轉(zhuǎn)化子、PCR鑒定、酶切鑒定、測(cè)序證明工程菌PEZR(K)-LNY-Zj2-CP構(gòu)建成功。農(nóng)桿菌介導(dǎo)Zj2_CP基因轉(zhuǎn)化擬南芥，經(jīng)卡那霉素抗性篩選獲得含有目的基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株，通過激光共聚焦觀察分析表明棗樹2-半胱氨酸氧化還原酶基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥的不同組織部位，根、莖、葉中均有不同程度的表達(dá)。將轉(zhuǎn)Zj2_CP基因擬南芥純合 株系的種子和野生型擬南芥種子均播種在加不同濃度NaCl的1/2MS培養(yǎng)基上，對(duì)轉(zhuǎn)Zj2-CP基因擬南芥純合株系的種子進(jìn)行耐鹽性評(píng)價(jià)，觀察其生長狀況，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)Zj2-CP基因擬南芥植株在鹽脅迫處理下長勢(shì)和根系明顯好于野生型擬南芥植株。將轉(zhuǎn)Zj2-CP基因擬南芥植株和野生型(WT)擬南芥植株進(jìn)行耐鹽、耐旱脅迫處理，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)Zj2-CP基因擬南芥植株耐鹽、耐旱性明顯提高。本發(fā)明為了進(jìn)一步研究逆境因素對(duì)Zj2_CP基因表達(dá)的影響，對(duì)轉(zhuǎn)Zj2_CP基因擬南芥植株和野生型植株進(jìn)行干旱脅迫和鹽脅迫后提取其RNA，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR表明，轉(zhuǎn)Zj2-CP基因株系在經(jīng)過干旱和鹽脅迫后，其體內(nèi)Zj2-CP基因的表達(dá)量高于野生型植株的表達(dá)量。同時(shí)，對(duì)轉(zhuǎn)Zj2-CP基因擬南芥植株和野生型植株的生理特性P0D、CAT測(cè)定后表明，轉(zhuǎn)Z j2-CP基因擬南芥中相應(yīng)的酶活性均高于野生型擬南芥中的酶活性，可見Z j2-CP基因提高了植株的抗旱性和耐鹽性。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明首次從棗樹中分離出棗樹2-半胱氨酸氧化還原酶基因(Zj2-CP)，該基因作為目的基因?qū)胫参?，提高植物抗逆性，?duì)于植物品種改良具有重要的現(xiàn)實(shí)意義，對(duì)于具有優(yōu)良抗性植物的抗逆機(jī)制的深入研究，有助于明確逆境相關(guān)基因的分子結(jié)構(gòu)、表達(dá)、功能及調(diào)控，為進(jìn)一步充分利用這些優(yōu)良抗性基因來提高植物的抗逆性提供一定的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和奠定理論基礎(chǔ)。


圖1為用Swiss Model程序進(jìn)行基因三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果示意圖。圖2為PCR目的基因產(chǎn)物圖譜。圖3為PEZR(K)-LNY及目的基因的酶切圖譜。圖4為連接產(chǎn)物的PCR鑒定圖譜。圖5為重組質(zhì)粒的酶切鑒定圖譜。圖6 為工程菌 PEZR (K)-LNY-Z j2_CP 的 PCR 鑒定圖。圖7為工程菌PEZR(K)-LNY-Zj2_CP的酶切鑒定圖譜。圖8為轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型擬南芥的RNA凝膠成像分析圖譜。圖9為轉(zhuǎn)基因擬南芥株系中Zj2_CP基因的表達(dá)量結(jié)果示意圖。圖10為野生型擬南芥株系中Zj2_CP基因的表達(dá)量結(jié)果示意圖。圖11為轉(zhuǎn)基因擬南芥株系中POD活性的表達(dá)量結(jié)果示意圖。圖12為野生型擬南芥株系中POD活性的表達(dá)量結(jié)果示意圖。圖13為轉(zhuǎn)基因擬南芥株系中CAT活性的表達(dá)量結(jié)果示意圖。
圖14為野生型擬南芥株系中CAT活性的表達(dá)量結(jié)果示意圖。圖15為棗苗干旱脅迫后葉中POD的活性測(cè)定示意圖。圖16為棗苗干旱脅迫后莖中POD的活性測(cè)定示意圖。圖17為棗苗干旱脅迫后根中POD的活性測(cè)定示意圖。圖18為棗苗干旱脅迫后莖中CAT的活性測(cè)定示意圖。圖19為棗苗干旱脅迫后根中CAT的活性測(cè)定示意圖。圖20為棗苗干旱脅迫后葉中CAT的活性測(cè)定示意圖。圖21為棗苗鹽脅迫后葉中POD的活性測(cè)定示意圖。圖22為棗苗鹽脅迫后莖中POD的活性測(cè)定示意圖。圖23為棗苗鹽脅迫后根中POD的活性測(cè)定示意圖。圖24為棗苗鹽脅迫后葉中CAT的活性測(cè)定示意圖。圖25為棗苗 鹽脅迫后莖中CAT的活性測(cè)定示意圖。圖26為棗苗鹽脅迫后根中CAT的活性測(cè)定示意圖。圖27為轉(zhuǎn)基因擬南芥株系和野生型擬南芥受鹽脅迫后的形態(tài)學(xué)觀察示意圖。圖28為轉(zhuǎn)基因擬南芥株系和野生型擬南芥受干旱脅迫后的形態(tài)學(xué)觀察示意圖。圖29為棗苗干旱脅迫后Zj2_CP基因的熒光定量分析結(jié)果示意圖。圖30為棗苗鹽脅迫后Zj2_CP基因的熒光定量分析結(jié)果示意圖。圖31為轉(zhuǎn)基因擬南芥植株葉的細(xì)胞學(xué)觀察圖譜。圖32為轉(zhuǎn)基因擬南芥植株莖的細(xì)胞學(xué)觀察圖譜。圖33為轉(zhuǎn)基因擬南芥植株根的細(xì)胞學(xué)觀察圖譜。圖34為圖33的放大圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1棗樹2-半胱氨酸氧化還原酶基因Zj2_CP的生物信息學(xué)分析
本發(fā)明從已經(jīng)構(gòu)建壺瓶率jujuba Mill hupingzao)結(jié)果枝cDNA文庫中篩選到棗樹2-半胱氨酸氧化還原酶基因Zj2-CP的全序列。1.1分析方法
將獲得的序列通過搜索NCBI數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行氨基酸和核苷酸的相似性分析；用DNASTAR翻譯核苷酸序列、計(jì)算蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量和理論等電點(diǎn)；在NCBI Blast X中進(jìn)行序列的同源性分析；用 TMHMM2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)進(jìn)行蛋白質(zhì)序列的跨膜分析；用SignalP3.0Server分析氨基酸序列的信號(hào)肽；用ProtScale Server進(jìn)行序列疏水性/親水性的預(yù)測(cè)；用DNAMAN軟件對(duì)棗樹2-半胱氨酸氧化還原酶(簡(jiǎn)稱基因編碼的蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)；用Swiss Model程序(http://au.expasy.0rg/tools/)進(jìn)行目的基因的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。1.2 Zj2_CP基因的同源性分析
通過在NCBI Blast X進(jìn)行序列同源性分析表明，該序列編碼的蛋白與已知物種中2-半胱氨酸氧化還原酶具有極高的相似性，與楊樹2-半胱氨酸氧化還原酶的同源性為82%，與煙草的同源性為87%，與豇豆的同源性為90%，與豌豆的同源性為99%，因此將該基因編碼的蛋白命名為棗樹2-半胱氨酸氧化還原酶。
1.3 ZJ2-CP基因的氨基酸序列跨膜分析 用TMHMM2.0進(jìn)行蛋白質(zhì)序列的跨膜區(qū)進(jìn)行分析(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)，結(jié)果表明跨膜區(qū)域?yàn)?，Zj2-CP基因編碼的蛋白是一個(gè)膜外蛋白，沒有跨膜結(jié)構(gòu)。
1.4 ZJ2-CP基因的蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè) 用SignalP3.0Server分析氨基酸序列的信號(hào)肽，結(jié)果表明Zj2_CP基因編碼的蛋白沒有信號(hào)肽存在，是非分泌性蛋白。
1.5 Zj2_CP基因的疏水性 將率樹2-半胱氨酸氧化還原酶基因編碼的氨基酸序列提交到ProtScale Server進(jìn)行疏水性/親水性預(yù)測(cè)，負(fù)值越小親水性越強(qiáng)，正值越大疏水性越強(qiáng)，介于-0.5到+0.5之間的為兩性氨基酸，該基因編碼的蛋白質(zhì)為疏水性蛋白。
1.6 ZJ2-CP基因的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 用Swiss Model程序(http://au.expasy.0rg/tools/)進(jìn)行率樹2_半胱氨酸氧化還原酶基因的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，推測(cè)目的基因編碼蛋白的三維結(jié)構(gòu)如圖1所示。
生物信息學(xué)分析表明:棗樹2-半胱氨酸氧化還原酶基因Zj2_CP的序列全長為834bp，編碼277個(gè)氨基酸，分子量為30.65KD,理論等電點(diǎn)為8.95，CG含量為45.68%，不穩(wěn)定系數(shù)為41.56，脂溶指數(shù)為87.29，疏水性平均值為-0.12。通過分析得出該基因編碼的蛋白為膜外非分泌性蛋白，該基因編碼的蛋白與已知物種2-半胱氨酸氧化還原酶基因編碼蛋白的同源性為82% — 99%。
實(shí)施例2棗樹Zj2_CP轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建 2.1材料、試劑及儀器 2.1.1材料 大腸桿菌感受態(tài)DH5a、重組質(zhì)粒pSPORT-Z j2-CP、植物表達(dá)載體PEZR (K) -LNY等均由發(fā)明人研究室保存。
2.1.2試劑及培養(yǎng)基 IOxPCR buffer>dNTP Mixture、Taq酶、限制性內(nèi)切酶Sma 1、Sal I等購于太原遐邇商貿(mào)有限公司、TaKaRa DNA Fragment Purification Kit Ver.2.0純化試劑盒等購于大連寶生物工程有限公司。
LB培養(yǎng)基:蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化鈉10g/L (固體培養(yǎng)基加終濃度為1.5%的瓊脂粉) 2.1.3儀器 分光光度計(jì)(eppendorf BioPhotometer)、電子天平(Sarorius BS200s_WEl )、隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海市躍進(jìn)醫(yī)療器械一廠PYX-DHS)、JY-DF系列電泳槽(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司)、高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(Beck man J-25)、PCR擴(kuò)增儀(Eppendorf AG)、高速冷凍離心機(jī)(Thero HP-62)、真空干燥箱(ΗΕΤ0 VR-1 )、高壓滅菌鍋(TOMY SS-325)、水浴恒溫振蕩器(國華企業(yè)SHZ-82A)、DYY-6B型電泳儀(北京市六一儀器廠)、超凈工作臺(tái)(上海迅博醫(yī)療設(shè)備廠Vs-840-2)、電熱恒溫水浴鍋(天津市華北實(shí)驗(yàn)儀器有限公司) 2.2實(shí)驗(yàn)方法 2.2.1大腸桿菌DH5a 感受態(tài)制作參照精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南用CaCl2法制備大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞。
2.2.2質(zhì)粒提取方法 參照精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南，用堿裂解法提取質(zhì)粒。
2.2.3 PCR引物設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)棗樹2-半胱氨酸氧化還原酶基因的cDNA編碼的序列，設(shè)計(jì)帶有限制性內(nèi)切酶Sma I和Sal I酶切位點(diǎn)的特異性引物，Zj2_CP基因的上游引物W2的序列為:5’ -ATAGTCGACAATGGCTTGCTCTG-3，，含有Sal I限制性酶切位點(diǎn)；Zj2_CP基因的下游引物W3的序列為:5’ -ATCCCGGGTTATTGCTGCAAAG-3’.含有Sma I限制性酶切位點(diǎn)。設(shè)計(jì)的引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。
2.2.3 PCR引物溫度梯度的設(shè)置 利用梯度PCR技術(shù)設(shè)置6個(gè)不同的退火溫度，其中中心溫度為56°C，將重組質(zhì)粒pSPORTl-2-CP作為模板，用特異性引物W2、W3進(jìn)行PCR擴(kuò)增，找出最佳的退火溫度為54°C。PCR擴(kuò)增體系20μ1:10XPCR buffer 2μ1, ΝΤΡ 0.2μ1，上下游引物各0.5μ1(引物終濃度為20pmol/L), rTaq 聚合酶 0.2μ1，模板 μ ，S.D.W15.6μ1。擴(kuò)增條件為:95°C預(yù)變性 5 min，94°C變性I min，56°C退火I min，72°C延伸2 min，共25個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸5 min。
2.2.4 載體 PEZR(K) -LNY, pSPORTl- Zj2_CP 的制備 將含有PEZR(K) -LNY、pSP0RTl- ZJ2-CP質(zhì)粒的DH5a菌液接菌于2mL的LB液體培養(yǎng)基含I μ I卡那霉素(100 mg/mL)中，37°C過夜培養(yǎng)。用裂堿法提取質(zhì)粒，將質(zhì)粒溶于20 μ ITE中，-20°C保存?zhèn)溆谩?br> 2.2.5目的基因Z j2_CP和載體PEZR (K) -LNY的酶切 將克隆載體pSP0RTl-Zj2-CP作為模板，用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得含有完整開放閱讀框的棗樹2-半胱氨酸氧化還原酶基因。用酒精沉淀獲得的PCR產(chǎn)物，將沉淀物溶于20μ1 TE 中，-20°C保存。
PCR擴(kuò)增目的基因的反應(yīng)體系:10 X PCR buffer 5μ1 (含Mg離子)，dNTP μ ，上下游引物各2μ1 (20pmol/L), rTaq聚合酶0.5μ1，模板DNA μ ，滅菌超純水38.5μ1，總體積50μ1。擴(kuò)增條件為:95°C預(yù)變性5 min，94°C變性I min，54°C退火I min，72°C延伸2 min,共40個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸5 min。
用Sal 1、Sma I限制性內(nèi)切酶分別酶切2_半胱氨酸氧化還原酶基因的PCR產(chǎn)物和載體PEZR(K)-LNY,酶切的反應(yīng)體系為50μ1，兩者在酶切時(shí)都相應(yīng)的加入IOXTbuffer5μ1,0.1%BSA 5μ1，Sal I 2μ1，Sma I 2μ1，不同的是前者加入PCR產(chǎn)物10μ1，后者加入載體PEZR(K) -LNY質(zhì)粒 μ ，加S.D.W到50μ1。37°C酶切過夜。酶切后去2μ1酶切產(chǎn)物，用瓊脂糖凝膠電泳分析與預(yù)期片段大小是否符合。
2.2.6酶切產(chǎn)物純化與連接 用純化試劑盒DNA Fragment Purification對(duì)目的基因2-半胱氨酸氧化還原酶和載體PEZR(K) -LNY的雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行純化。
將純化產(chǎn)物用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接，連接反應(yīng)體系為10μ1:載體質(zhì)粒和目的基因的DNA片段混合總體積為5μ1 (目的基因DNA片段和載體質(zhì)粒的摩爾數(shù)比為3:1)，DNA連接酶5μ1，充分混勻，16 °C連接過夜。
2.2.7連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化取在_70°C保存的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞放于冰上融化后，將連接產(chǎn)物加入感受態(tài)細(xì)胞中輕輕混勻，冰上放置30分鐘，加入420C的水浴中90秒，迅速放入冰上冷卻5分鐘。加入400 LB液體培養(yǎng)液，37°C搖40 min使細(xì)菌復(fù)蘇(轉(zhuǎn)速低于225轉(zhuǎn)/min)。之后去50μ1到含有卡那霉素LB平板上，涂勻，倒置，37°C靜置培養(yǎng)過夜。
2.2.8轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的鑒定 挑取LB平板上長出的菌落至5(^LS.D.W中，沸水裂解5分鐘。取 μ 作為PCR模板進(jìn)行鑒定，反應(yīng)體系及程序參照2.2.5，將鑒定為陽性的菌落劃線培養(yǎng)。
將鑒定為陽性的菌落用堿裂解法提取其質(zhì)粒，用BamH I和Hind III酶切質(zhì)粒經(jīng)行陽性鑒定。酶切反應(yīng)體系為10μ1:10XKbuffer ^l7BamH I和Hind III分別0.5μ1，質(zhì)μ , S.D.W 7μ1。37°C放置 2h 以上。
將酶切產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析，檢驗(yàn)片段大小是否與預(yù)期結(jié)果一致。將陽性菌株送與華大公司測(cè)序。
2.3結(jié)果與分析 2.3.1棗樹Zj2-CP的cDNA擴(kuò)增 如圖2所示，將重組質(zhì)粒pSP0RTl-Zj2-CP作為模板，設(shè)計(jì)的特異性W2和W3為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳分析表明有一條約為834bp的條帶，可見該條帶與預(yù)期結(jié)果一致。
2.3.2目的基因片段與載體片段的酶切 用Sma I和Sal I酶切目的基因片段的PCR產(chǎn)物和載體PEZR (K)-LNY質(zhì)粒后，用瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果如圖3所示，PCR產(chǎn)物大小為834bp，載體PEZR(K)-LNY片段約11.7Kb，可見與預(yù)期結(jié)果相同。
2.3.3連接產(chǎn)物的鑒定 將含有卡那霉素的LB平板上生長的單菌落隨即挑取24個(gè)進(jìn)行PCR鑒定，凝膠電泳后，如圖4所示，在24個(gè)單菌落中有14個(gè)菌落的條帶約為834bp，與預(yù)期結(jié)果相符。說明在轉(zhuǎn)化菌株中含有目的片段。
2.3.4重組質(zhì)粒的鑒定 將上述檢測(cè)為陽性菌落的14個(gè)單菌落重新劃線培養(yǎng)，提取其質(zhì)粒，將質(zhì)粒用BamH I和Hind III酶切反應(yīng)后,用瓊脂糖凝膠電泳分析,如圖5所示,在14個(gè)質(zhì)粒酶切條帶中均發(fā)現(xiàn)有兩條條帶，初步推斷棗樹2-半胱氨酸氧化還原酶基因植物`表達(dá)載體構(gòu)建成功。將14個(gè)陽性菌株隨機(jī)選取兩個(gè)菌株送去華大基因測(cè)序,測(cè)序結(jié)果表明,植物表達(dá)載體構(gòu)建成功。
實(shí)施例3農(nóng)桿菌介導(dǎo)棗樹Zj2_CP基因轉(zhuǎn)化擬南芥 3.1材料、試劑及儀器 3.1.1材料 野生型擬南芥 iArabidopsis thaliana Columbia)、根癌農(nóng)桿菌 iAgrobacteriumtumefaciens ) LBA4404、均由發(fā)明人研究室保存。已經(jīng)構(gòu)建成功的植物表達(dá)載體PEZR (K)-LNY-Zj2-CP。
3.1.2試劑及儀器設(shè)備 卡那霉素(Kanamycin，Kan)購自上海生工生物工程服務(wù)有限公司；人工氣候培養(yǎng)箱(SANYO,MLR-350)；YEBU/2 MS培養(yǎng)基中所用試劑均購自天津天大化工；培養(yǎng)基質(zhì)購自于山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝作物研究所。
3.1.3培養(yǎng)基配方 YEB培養(yǎng)基: 蛋白胨5g/L，酵母提取物I g/L，蔗糖5g/L，硫酸鎂0.5g/L。(固體培養(yǎng)基需加終濃度為1.5%的瓊脂粉)。
1/2MS 培養(yǎng)基: 大量元素25ml/L、微量元素5ml/L、有機(jī)元素500μ1、鐵鹽5ml/L、鹿糖30g/L、瓊脂粉6g/L。
3.2實(shí)驗(yàn)方法 3.2.1擬南芥的培養(yǎng) 擬南芥種子用95%乙醇浸泡lmin, 5000rpm離心Imin ;轉(zhuǎn)入2.65%次氯酸鈉中，上下顛倒滅菌5min, 5000rpm離心2min ;滅菌水洗三次。然后將種子懸浮于0.1%的瓊脂粉溶膠中。播于1/2MS固體培養(yǎng)基上，封口。4°C春化2d后，在22°C，16 h / 8 h光周期條件下正常培養(yǎng)。當(dāng)擬南芥長出2片真葉時(shí)，移栽到營養(yǎng)基質(zhì)中繼續(xù)培養(yǎng)。
3.2.2 工程菌 PEZR (K)-LNY-Z j2_CP -L 的構(gòu)建及篩選 通過凍融法將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒PEZR(K)-LNY-Zj2-CP轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404，涂含有卡那霉素的LB平板上，28°C培養(yǎng)兩天后，挑選若干個(gè)陽性菌落，各取二分之一菌落至5(^LS.D.W中，沸水浴裂解5min，取 μ 作為模板進(jìn)行PCR鑒定，PCR反應(yīng)體系為15μ1:10XPCR buffer 1.5μ1，dNTPmix 0.2μ1，Ι2 0.5μ1, W30.5μ1, rTaq 酶 0.2μ1,8.D.W 11. μ ;反應(yīng)程序:95°C 5min, 94°C lmin, 54°C lmin, 72°C 2min, 72°C 5min, 25個(gè)循環(huán)。提取陽性菌落的質(zhì)粒DNA進(jìn)行酶切檢測(cè)重組質(zhì)粒是否轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌。將陽性菌落送去華大基因測(cè)序，將鑒定出的陽性工程菌重新劃線保存一份，備用。
3.2.3農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化擬南芥 將測(cè)序證明序列正確的農(nóng)桿菌陽性菌株接種到IOmLYEB液體培養(yǎng)基上(含終濃度為50μ g/mL的卡那霉素),28°C、190r/min振蕩過夜培養(yǎng),6000 rpm離心5min收集菌體,用5%蔗糖溶液懸浮菌體，調(diào)OD6c 值為0.8—1.0時(shí)加黏菌劑(終濃度為0.05% )，用于浸染擬南芥植株。
擬南芥植株形成花蕾時(shí)，即可被用于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化。將擬南芥植株的花蕾部分浸入轉(zhuǎn)化介質(zhì)，將浸染過的植株放到·塑料盤中，用薄膜覆蓋，暗處放置12h后，正常培養(yǎng)擬南芥植株。當(dāng)擬南芥的角果枯黃，欲開裂時(shí)，收獲Ttl種子。
3.2.4轉(zhuǎn)基因擬南芥的篩選 將Ttl代轉(zhuǎn)基因種子消毒后播種于1/2MS (含終濃度為50 μ g/mL的卡那抗生素)平板上篩選，將篩選出的轉(zhuǎn)基因植株分株系收獲種子，即為T1代。同樣，將T1代種子抗性篩選，分株系收獲T2代種子。將T2代種子消毒后播種在篩選培養(yǎng)基上不出現(xiàn)分離現(xiàn)象(即全為綠苗)時(shí)，說明此時(shí)的株系為純和株系。
3.2.5轉(zhuǎn)基因擬南芥的細(xì)胞定位分析 激光共聚焦掃描顯微鏡是目前世界上最先進(jìn)的生物學(xué)分析儀器，它是用激光作掃描光源，從點(diǎn)、行、面快速掃描成像。將轉(zhuǎn)基因擬南芥的純和植株通過激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行熒光觀察分析其不同組織部位的細(xì)胞形態(tài)。
3.3結(jié)果與分析 3.3.1農(nóng)桿菌工程菌株的構(gòu)建 將構(gòu)建成功的植物表達(dá)載體PEZR (K) -LNY-Zj2-CP轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404中，挑選生長良好的陽性菌落進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果在12個(gè)陽性菌落中有5個(gè)菌落產(chǎn)生一條約為834bp的特異性條帶(如圖6所示)，隨機(jī)挑取兩個(gè)陽性菌落提取其質(zhì)粒，用BamH I和Hind III進(jìn)行酶切檢測(cè)(如圖7所示)，電泳圖譜中顯示有兩條條帶，與預(yù)期結(jié)果一致。兩個(gè)菌株測(cè)序結(jié)果表明，重組序列與原克隆序列完全相同，說明含PEZR (K) -LNY-Zj2-CP的農(nóng)桿菌工程菌構(gòu)建成功。
3.3.2轉(zhuǎn)基因植株的篩選 將Ttl代種子播種在抗性平板上篩選，轉(zhuǎn)基因植株能夠正常生長，非轉(zhuǎn)基因的植株逐漸出現(xiàn)白化苗，最后死亡。經(jīng)過卡那抗性篩選共獲得24個(gè)轉(zhuǎn)基因株系，其轉(zhuǎn)基因株系的生長狀況如下表所示。
權(quán)利要求
1.一種棗樹2-半胱氨酸氧化還原酶基因，其特征是該基因的核苷酸序列是如SEQ IDNO: I所示的序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種棗樹2-半胱氨酸氧化還原酶基因編碼的氨基酸，其特征是該氨基酸的序列是如SEQ ID N0:2所示的序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種棗樹2-半胱氨酸氧化還原酶基因編碼的蛋白質(zhì)，其特征是該蛋白質(zhì)的氨基酸序列是如SEQ ID N0:2所示的序列。
4.如權(quán)利要求I所述的一種棗樹2-半胱氨酸氧化還原酶基因在提高植物抗旱性、耐鹽性中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種棗樹2-半胱氨酸氧化還原酶基因，該基因的核苷酸序列是如SEQIDNO:1所示的序列。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明首次從棗樹中分離出棗樹2-半胱氨酸氧化還原酶基因Zj2-CP，該基因作為目的基因?qū)胫参?，提高植物抗逆性，?duì)于植物品種改良具有重要的現(xiàn)實(shí)意義，對(duì)于具有優(yōu)良抗性植物的抗逆機(jī)制的深入研究，有助于明確逆境相關(guān)基因的分子結(jié)構(gòu)、表達(dá)、功能及調(diào)控，為進(jìn)一步充分利用這些優(yōu)良抗性基因來提高植物的抗逆性提供一定的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和奠定理論基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N15/53GK103255153SQ20131015200
公開日2013年8月21日 申請(qǐng)日期2013年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月27日
發(fā)明者曹秋芬, 孟玉平, 郭慧娜, 李捷, 張春芬, 鄧舒 申請(qǐng)人:山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所