專利名稱：快速評(píng)價(jià)雌激素與抗雌激素復(fù)合效應(yīng)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及雌激素與抗雌激素聯(lián)合毒性效應(yīng)研究技術(shù)領(lǐng)域，具體是涉及一種快速評(píng)價(jià)雌激素與抗雌激素復(fù)合效應(yīng)的方法。
背景技術(shù)：
環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(EDCs )在環(huán)境中普遍存在，對(duì)生態(tài)環(huán)境和人類健康造成了極大的威脅。毒理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)多種EDCs同時(shí)存在時(shí)所表現(xiàn)出的復(fù)合效應(yīng)并不是單獨(dú)效應(yīng)的簡(jiǎn)單疊加，而是各EDCs相互作用的結(jié)果。而現(xiàn)實(shí)環(huán)境中往往是多種EDCs同時(shí)存在，故尤其有必要研究EDCs間的復(fù)合效應(yīng)。目前的復(fù)合效應(yīng)研究中，較多的是同類EDCs間的復(fù)合效應(yīng)，不同種類EDCs間復(fù)合效應(yīng)研究比較缺乏，亟需加強(qiáng)。環(huán)境雌激素與抗雌激素能對(duì)暴露于其中的人和野生動(dòng)物的內(nèi)分泌系統(tǒng)造成極大的損害，它們之間的復(fù)合效應(yīng)研究鮮有報(bào)道。毒理學(xué)中一般采用體內(nèi)(動(dòng)物)和體外(細(xì)胞、分子等)實(shí)驗(yàn)來評(píng)價(jià)有毒物毒性。體外毒性方法簡(jiǎn)單，適用于藥物毒性的快速評(píng)價(jià)，但試驗(yàn)結(jié)果常出現(xiàn)假象。體內(nèi)毒性試驗(yàn)雖能較準(zhǔn)確地反映藥物的安全性，但試驗(yàn)周期長(zhǎng)，用藥量大。有些慢性毒性試驗(yàn)往往需要幾個(gè)月甚至更長(zhǎng)，不利于少量藥物的快速毒性評(píng)價(jià)。斑馬魚作為一種模式生物，具有體型小，易于管理的優(yōu)點(diǎn)，已被包括國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織ISO、USEPA、OECD以及中國(guó)環(huán)保部和農(nóng)業(yè)部等各國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)組織以及權(quán)威機(jī)構(gòu)列為生態(tài)毒性測(cè)試主要魚種之一。但是傳統(tǒng)魚類慢性毒性試驗(yàn)耗時(shí)長(zhǎng)、費(fèi)用高，無法實(shí)現(xiàn)反映長(zhǎng)期效應(yīng)的快速檢驗(yàn)要求。 為此，開發(fā)出一種能夠反映污染物長(zhǎng)期效應(yīng)的快速評(píng)價(jià)方法顯得尤為必要。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺點(diǎn)，本發(fā)明提供了一種快速評(píng)價(jià)雌激素與抗雌激素復(fù)合效應(yīng)的方法，該方法簡(jiǎn)單、快速、客觀，僅需96h即可完成。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，一種快速評(píng)價(jià)雌激素與抗雌激素復(fù)合效應(yīng)的方法，包括以下步驟:步驟一、斑馬魚胚胎的獲取；步驟二、將雌激素與不同濃度的抗雌激素進(jìn)行混合形成不同配比的暴露液，再將所述斑馬魚胚胎放入所述暴露液中，持續(xù)暴露96h，水溫維持在26±1°C，光周期為白天16h和夜間8h，暴露液每24h換80%，并記錄斑馬魚胚胎的孵化率、畸形率及孵化時(shí)間，暴露結(jié)束后，收集幼魚保存；步驟三、在胚胎發(fā)育形態(tài)學(xué)水平和/或基因轉(zhuǎn)錄水平上評(píng)價(jià)復(fù)合效應(yīng)。優(yōu)選的，在所述步驟一中，斑馬魚胚胎的獲取的具體步驟為:將雌雄魚以1:1或1:2比例配對(duì)，放入斑馬魚專用孵化盒，用隔板將所述雌雄魚隔開，12小時(shí)后將親魚置于光照下產(chǎn)卵，產(chǎn)卵結(jié)束用吸管吸出魚卵，鏡檢是否受精，2 5ppm亞甲基藍(lán)溶液消毒30min。優(yōu)選的，在所述步驟二中，所述雌激素為17β-雌二醇或o，p’ -DDT，進(jìn)一步優(yōu)選的，所述17 β -雌二醇的濃度為0.25 μ g/L，所述ο，p’ -DDT的濃度為100 μ g/L。優(yōu)選的，在所述步驟二中，所述抗雌激素為它莫西芬，進(jìn)一步優(yōu)選的，所述它莫西芬的濃度分別為10 μ g/L、50 μ g/L和250 μ g/L。優(yōu)選的，在所述步驟二中，還設(shè)置有稀釋水對(duì)照組。優(yōu)選的，在所述步驟二中，所述胚胎用超純水沖洗后放入所述暴露液。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果如下:利用斑馬魚胚胎研究有毒物對(duì)有機(jī)體毒性效應(yīng)的試驗(yàn)方法具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，其主要特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)有:在實(shí)驗(yàn)室條件下，斑馬魚可實(shí)現(xiàn)全年產(chǎn)卵，且一次產(chǎn)卵量大，可提供樣品多；斑馬魚胚胎透明，易于觀察和操作；斑馬魚胚胎階段對(duì)有毒物敏感；斑馬魚胚胎試驗(yàn)可順應(yīng)倫理要求。特別是在環(huán)境中內(nèi)分泌干擾物研究方面，由于環(huán)境中內(nèi)分泌干擾物常以低濃度形式存在，不能產(chǎn)生明顯的致死效應(yīng)，因此斑馬魚胚胎具有的優(yōu)勢(shì)更加明顯，因此，利用斑馬魚胚胎評(píng)價(jià)雌激素與抗雌激素的復(fù)合效應(yīng)，具有簡(jiǎn)單、快速、客觀的優(yōu)點(diǎn)。


通過閱讀參照以下附圖對(duì)非限制性實(shí)施例所作的詳細(xì)描述，本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點(diǎn)將會(huì)變得更明顯:圖1是17 β_雌二醇和它莫西芬共暴露的斑馬魚胚胎孵化率的結(jié)果圖。圖2是17 β -雌二醇和它莫西芬共暴露的斑馬魚胚胎孵化時(shí)間的結(jié)果圖。圖3是17 β -雌二醇和它莫西芬共暴露的斑馬魚胚胎總畸形率的結(jié)果圖。圖4是17 β -雌二醇和它莫西芬共暴露對(duì)斑馬魚胚胎雌激素相關(guān)基因表達(dá)影響結(jié)果圖·圖5是O，p’ -DDT和它莫西芬共暴露的斑馬魚胚胎孵化率的結(jié)果圖。圖6是O，p’ -DDT和它莫西芬共暴露的斑馬魚胚胎孵化時(shí)間的結(jié)果圖。圖7是O，p’ -DDT和它莫西芬共暴露的斑馬魚胚胎總畸形率的結(jié)果圖。圖8是O，p’ -DDT和它莫西芬共暴露對(duì)斑馬魚胚胎雌激素相關(guān)基因表達(dá)影響結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。以下實(shí)施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)。這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例1、應(yīng)用斑馬魚胚胎評(píng)價(jià)17 β -雌二醇與它莫西芬的復(fù)合效應(yīng)受試藥物:17β -雌二醇(Ε2)、它莫西芬,均購自美國(guó)sigma公司。配制方法:標(biāo)準(zhǔn)品溶于0.1%丙酮配制成lg/L母液并于4°C保存，實(shí)驗(yàn)室用超純水稀釋至所需濃度。動(dòng)物:斑馬魚。試劑:RT-PCR試劑盒，購于寶生物工程(大連)有限公司。試驗(yàn)方法的具體步驟如下:
一、斑馬魚胚胎的獲取:將10對(duì)雌雄魚以1:1或1:2比例配對(duì)，放入斑馬魚專用孵化盒，用隔板將雌雄魚隔開，12小時(shí)后將親魚置于光照下，半小時(shí)內(nèi)開始產(chǎn)卵，產(chǎn)卵結(jié)束用吸管吸出魚卵，鏡檢是否受精，2 5ppm亞甲基藍(lán)溶液消毒30min ；二、暴露實(shí)驗(yàn):選取的雌激素與抗雌激素混合配比為=E2為0.25 μ g/L,它莫西芬分別為10 μ g/L,50 μ g/L和250 μ g/L,同時(shí)設(shè)置稀釋水對(duì)照組，每個(gè)燒杯里加入暴露液IOOmL,每濃度設(shè)三個(gè)重復(fù)，即用三個(gè)燒杯，把用超純水沖洗過后的胚胎小心放入暴露液，每個(gè)燒杯20顆胚胎，暴露時(shí)間持續(xù)96h。水溫維持在26±1°C，光周期為16:8h(晝:夜)，暴露液每24h換80%，期間及時(shí)清除死卵，并記錄其孵化率、畸形率及孵化時(shí)間，暴露結(jié)束，每個(gè)樣品收集8 15尾幼魚至ImL EP管里并放入_80°C冰箱保存?zhèn)溆?；三、?fù)合效應(yīng)的評(píng)價(jià):1、形態(tài)學(xué)水平的評(píng)價(jià):將胚胎置于顯微鏡下進(jìn)行觀察，并記錄現(xiàn)象，觀察的時(shí)間點(diǎn)選擇在72h 96h，在觀察過程中，發(fā)現(xiàn)死卵要及時(shí)的挑出，48h后可以觀察到黑色素沉著、畸形情況，72h后可以觀察到孵化情況等，終點(diǎn)可觀察的指標(biāo)有:孵化率，心包囊腫、尾巴彎曲、脊柱彎曲等畸形情況；·數(shù)據(jù)以孵化率、孵化時(shí)間、畸形率表示；(I)孵化率=孵化的斑馬魚胚胎數(shù)量/總的斑馬魚胚胎數(shù)量X 100%(2)孵化時(shí)間以72h之后，每?jī)蓚€(gè)小時(shí)記一次孵化出殼的情況(3)畸形率=畸形斑馬魚胚胎的數(shù)量/總的斑馬魚胚胎數(shù)量X 100%將三次平行組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行ANOVA統(tǒng)計(jì)分析，表示為平均值+SD，與相應(yīng)的對(duì)照組相比，P〈0.05為有顯著性差異，P〈0.01時(shí)為極顯著差異，a, b代表兩組之間差異顯著；2、基因轉(zhuǎn)錄水平的評(píng)價(jià):(I)RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄:用超聲波處理器對(duì)幼魚樣品進(jìn)行粉碎處理，然后用RNA提取試劑盒抽提斑馬幼魚總RNA，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA樣品的濃度和純度，0D260/280 一般要求在1.8 2.2之間；反轉(zhuǎn)錄反應(yīng):取500ng總RNA、0.5 μ L的50 μ Moligo_dT、0.5 μ L 的 50 μ M random6mers、2 μ L 緩沖液和 0.5 μ L 反轉(zhuǎn)錄酶，用 RNaseFreedH20稀釋成10 μ L體系，混勻，37°C反應(yīng)15min，再85°C 5s使反轉(zhuǎn)錄酶失活，然后I μ L的RT反應(yīng)液將直接用于下一步的PCR反應(yīng)；(2)基因表達(dá)分析:實(shí)時(shí)定量PCR用的是ABI St印one熒光定量PCR儀，雌激素響應(yīng)基因和管家基因β-actin的引物參照本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)手段?；驍U(kuò)增的特異性由熔解曲線保證，目的基因mRNA通過它與β -actin mRNA的比率表示其表達(dá)水平，PCR反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性30s，PCR循環(huán)如下:95°C變性5s，60°C延伸34s, 40個(gè)循環(huán)，用2-ΛΛ Ct方法計(jì)算得到的Ct值來分析基因的相對(duì)表達(dá)量；(3)數(shù)據(jù)分析:將三次平行組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行ANOVA統(tǒng)計(jì)分析，表示為平均值+SD，與相應(yīng)的對(duì)照組相比，p〈0.05為有顯著性差異，P〈0.01時(shí)為極顯著差異，a，b代表兩組之間
差異顯著；結(jié)果表明:在形態(tài)學(xué)水平上，雌激素E2與抗雌激素它莫西芬暴露之后，對(duì)胚胎的發(fā)育毒性比二者單獨(dú)作用要強(qiáng)，如圖1、圖2和圖3所示；但在基因轉(zhuǎn)錄水平上雌激素E2與它莫西芬體現(xiàn)出相互拮抗的效應(yīng)，如圖4所示。實(shí)施例2、應(yīng)用斑馬魚胚胎評(píng)價(jià)O，p’ -DDT與它莫西芬的復(fù)合效應(yīng)
受試藥物:o, p’-DDT、它莫西芬,均購自美國(guó)sigma公司。配制方法:標(biāo)準(zhǔn)品溶于0.1%丙酮配制成lg/L母液并于4°C保存，實(shí)驗(yàn)室用超純水稀釋至所需濃度。動(dòng)物:斑馬魚。試劑:RT-PCR試劑盒，購于寶生物工程(大連)有限公司。試驗(yàn)方法:同實(shí)施例1的試驗(yàn)方法相比，區(qū)別在于選取的雌激素與抗雌激素混合配比為:o，p，-DDT 為 100 μ g/L，它莫西芬分別為 10 μ g/L、50 μ g/L 和 250 μ g/L。試驗(yàn)結(jié)果:在胚胎發(fā)育形態(tài)學(xué)水平上，O, p’ -DDT與它莫西芬沒有表現(xiàn)出任何中和或者平衡的效應(yīng)，而是出現(xiàn)一定程度上毒性加和效應(yīng)，如圖5、圖6和圖7所示；在基因轉(zhuǎn)錄水平上，ο, p’ -DDT與它莫西芬共暴露組中，它莫西芬很好地顯示了其選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)物的特性:濃度低時(shí)與O，p’ -DDT競(jìng)爭(zhēng)雌激素受體(ER)，起到拮抗作用；高濃度時(shí)還可以通過與ER的結(jié)合誘導(dǎo)相關(guān)基因的表達(dá)，起到弱雌激素的作用，并不完全拮抗O，P’ -DDT，如圖8所示。上述實(shí)施例的結(jié)果表明，用斑馬魚胚胎來評(píng)價(jià)雌激素與抗雌激素復(fù)合效應(yīng)的方法簡(jiǎn)單、快速、客觀，僅需96h，是一種快速評(píng)價(jià)雌激素與抗雌激素間復(fù)合效應(yīng)的新方法。以上對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了描述。需要理解的是，本發(fā)明并不局限于上述特定實(shí)施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在權(quán)利要求的范圍內(nèi)做出各種變形或修改，這并不影響本發(fā)明的 質(zhì)內(nèi)容。
權(quán)利要求
1.一種快速評(píng)價(jià)雌激素與抗雌激素復(fù)合效應(yīng)的方法，其特征在于，包括以下步驟: 步驟一、斑馬魚胚胎的獲??； 步驟二、將雌激素與不同濃度的抗雌激素進(jìn)行混合形成不同配比的暴露液，再將所述斑馬魚胚胎放入所述暴露液中，持續(xù)暴露96h，水溫維持在26± 1°C，光周期為白天16h和夜間8h，所述暴露液每24h換80%，并記錄所述斑馬魚胚胎的孵化率、畸形率及孵化時(shí)間，暴露結(jié)束后，收集幼魚保存； 步驟三、在胚胎發(fā)育形態(tài)學(xué)水平和/或基因轉(zhuǎn)錄水平上評(píng)價(jià)復(fù)合效應(yīng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速評(píng)價(jià)雌激素與抗雌激素復(fù)合效應(yīng)的方法，其特征在于，在所述步驟一中，斑馬魚胚胎的獲取的具體步驟為:將雌雄魚以1:1或1:2比例配對(duì)，并放入斑馬魚專用孵化盒，用隔板將所述雌雄魚隔開，12小時(shí)后將親魚置于光照下產(chǎn)卵，產(chǎn)卵結(jié)束用吸管吸出魚卵，鏡檢是否受精，2 5ppm亞甲基藍(lán)溶液消毒30min。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速評(píng)價(jià)雌激素與抗雌激素復(fù)合效應(yīng)的方法，其特征在于，在所述步驟二中，所述雌激素為17β-雌二醇或o，p’ -DDT。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的快速評(píng)價(jià)雌激素與抗雌激素復(fù)合效應(yīng)的方法，其特征在于，所述17 β -雌二醇的濃度為0.25 μ g/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的快速評(píng)價(jià)雌激素與抗雌激素復(fù)合效應(yīng)的方法，其特征在于，所述ο, p，-DDT的濃度為100 μ g/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速評(píng)價(jià)雌激素與抗雌激素復(fù)合效應(yīng)的方法，其特征在于，在所述步驟二中，所述抗雌激素為它莫西芬。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的快速評(píng)價(jià)雌激素與抗雌激素復(fù)合效應(yīng)的方法，其特征在于，所述它莫西芬的濃度分別為 ο μ g/L,50 μ g/L和250 μ g/L。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速評(píng)價(jià)雌激素與抗雌激素復(fù)合效應(yīng)的方法，其特征在于，在所述步驟二中，還設(shè)置有稀釋水對(duì)照組。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速評(píng)價(jià)雌激素與抗雌激素復(fù)合效應(yīng)的方法，其特征在于，在所述步驟二中，所述斑馬魚胚胎用超純水沖洗后放入所述暴露液。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種快速評(píng)價(jià)雌激素與抗雌激素復(fù)合效應(yīng)的方法，該方法包括以下步驟斑馬魚胚胎的獲??；將雌激素與不同濃度的抗雌激素進(jìn)行混合形成不同配比的暴露液，再將所述斑馬魚胚胎放入所述暴露液中，持續(xù)暴露96h，水溫維持在26±1℃，光周期為白天16h和夜間8h，暴露液每24h換80%，并記錄斑馬魚胚胎的孵化率、畸形率及孵化時(shí)間，暴露結(jié)束后，收集幼魚保存?zhèn)溆?；在胚胎發(fā)育形態(tài)學(xué)水平和/或基因轉(zhuǎn)錄水平上評(píng)價(jià)復(fù)合效應(yīng)。用斑馬魚胚胎來評(píng)價(jià)雌激素與抗雌激素復(fù)合效應(yīng)的方法簡(jiǎn)單、快速、客觀，僅需96h，是一種快速評(píng)價(jià)雌激素與抗雌激素間復(fù)合效應(yīng)的新方法。
文檔編號(hào)C12N5/073GK103243068SQ201310153409
公開日2013年8月14日 申請(qǐng)日期2013年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月27日
發(fā)明者王魯梅, 向霄, 鐘玲盈, 呂晶, 夏兵 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)