一種來源于耐高溫菌的重金屬結(jié)合蛋白基因及其抗重金屬應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明將一種來源于耐高溫菌的重金屬結(jié)合蛋白轉(zhuǎn)入植物并使得這種轉(zhuǎn)基因植物能夠具備增加植物抗重金屬的作用。所述重金屬結(jié)合蛋白基因按植物偏愛密碼合成含213個堿基，編碼的氨基酸68個；所述基因的核苷酸序列如SEQID?NO1所示，其編碼的氨基酸序列如SEQID?NO2所示。本發(fā)明中來源于耐高溫菌的重簡化結(jié)合采用人工方法合成，轉(zhuǎn)基因植物具備較高的抗重金屬性。
【專利說明】一種來源于耐高溫菌的重金屬結(jié)合蛋白基因及其抗重金屬 應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于遺傳育種領(lǐng)域，具體涉及一種來源于耐高溫菌的重金屬結(jié)合蛋白基因 的序列，利用農(nóng)桿菌將該基因轉(zhuǎn)化到植物中，使植物抗金屬能力得到提高。

【背景技術(shù)】
[0002] 隨著現(xiàn)代工農(nóng)業(yè)的迅速發(fā)展、城市的急劇擴(kuò)大，自然環(huán)境中的重金屬污染日益嚴(yán) 重。每年因重金屬污染帶來的糧食減產(chǎn)達(dá)1000多萬噸，被重金屬污染的糧食每年達(dá)1200 萬噸，年經(jīng)濟(jì)損失在200億以上。傳統(tǒng)的土壤重金屬污染修復(fù)技術(shù)有排土填埋法、稀釋法、 淋洗法、物理分離法和化學(xué)法等因成本高、效率低，而且會破壞土壤結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致/二次污染 等原因，難以大面積應(yīng)用。
[0003] 與傳統(tǒng)的處理方式相比，植物修復(fù)的主要優(yōu)點(diǎn)是成本低，處理設(shè)施簡單，適合大規(guī) 模的應(yīng)用，利于土壤生態(tài)系統(tǒng)的保持，對環(huán)境擾動小，具有美學(xué)價值等特點(diǎn)。植物修復(fù)是生 物修復(fù)（bioremediation)的一種方式，又稱綠色修復(fù)（green remediation)，是以植物忍 耐、分解或超量積累某種或某些化學(xué)元素的生理功能為基礎(chǔ)，利用植物及其共存微生物體 系來吸收、降解、揮發(fā)和富集環(huán)境中污染物的一項(xiàng)環(huán)境污染治理技術(shù)。
[0004] 然而，植物修復(fù)的關(guān)鍵核心問題在于修復(fù)的效率問題，本發(fā)明通過基因工程技術(shù) 提高植物修復(fù)的效率，從而希望能引領(lǐng)植物修復(fù)技術(shù)的新一輪發(fā)展。
[0005] 本項(xiàng)發(fā)明利用PTDS法合成了來源于耐高溫菌的重金屬結(jié)合蛋白基因，將該基因 轉(zhuǎn)化擬南芥，進(jìn)而提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐重金屬能力，該基因?qū)τ谂嘤参锟怪亟饘俚?植物品種非常重要，具有重要的理論意義和現(xiàn)實(shí)意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于將一種來源于耐高溫菌的重金屬結(jié)合蛋白基因 轉(zhuǎn)入植物體內(nèi)，并對該轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行功能驗(yàn)證，以證明它具有提高植物的抗重金屬的功 能。
[0007] -種來源于耐高溫菌的重金屬結(jié)合蛋白TtHMBP，其核苷酸序列如SEQ ID N01所 示，其氨基酸序列如SEQ ID N02所示。
[0008] 所述來源于耐高溫菌的根據(jù)植物偏愛人工合成的重金屬結(jié)合蛋白TtHMBP長 234bp，編碼的氨基酸73個。
[0009] 所述來源于耐高溫菌的重金屬結(jié)合蛋白TtHMBP通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)入擬南芥，應(yīng) 用于植物抗重金屬性。
[0010] 所述來源于耐高溫菌的重金屬結(jié)合蛋白TtHMBP基因采用人工方法合成，具體包 括以下步驟：
[0011] 1) TtHMBP的人工合成
[0012] 依照PTDS(PCR_based two-step DNA synthesis，PTDS)方法進(jìn)行源自耐高溫菌的 重金屬結(jié)合蛋白基因進(jìn)行化學(xué)合成，在保持TtHMBP基因的氨基酸序列不變的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì) 引物合成了 TtHMBP基因。
[0013] 2) TtHMBP農(nóng)桿菌雙元載體的構(gòu)建
[0014] TtHMBP基因植物雙元載體在pcAMBIA-1301載體的基礎(chǔ)上構(gòu)建而成，在 pCAMBIA-1301載體的多克隆位點(diǎn)處插入兩端附加了煙草的染色質(zhì)附著SAR序列的外源基 因的表達(dá)單兀，這有利于轉(zhuǎn)基因的穩(wěn)定遺傳；在外源基因的表達(dá)單兀內(nèi)，我們在目的基因的 兩側(cè)導(dǎo)入了 BamHI和Sacl酶切位點(diǎn)，便于外源基因的插入，外源基因的表達(dá)由雙CAMV355 啟動子 +TMV omega leader sequence 控制
[0015] 3)電擊法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
[0016] 參照MicroPulser? Electroporation Apparatus Operating Instructions and Application Guide(BI〇-RAD公司）制備農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài).并且將構(gòu)建好的農(nóng)桿菌雙 元載體經(jīng)電擊法轉(zhuǎn)入到農(nóng)桿菌中。
[0017] 4)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化擬南芥
[0018] 利用蘸花法將構(gòu)建好的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)入擬南芥體內(nèi).首先將擬南芥的花苔浸入滲透 液中，輕輕攪動約3?5秒后取出，全部轉(zhuǎn)化完畢后，托盤中加入PNS營養(yǎng)液，以黑色塑料袋 套盆封口，保持濕潤環(huán)境，置于22°C培養(yǎng)室，低光強(qiáng)度下生長24小時，即可正常培養(yǎng)。生長 約兩個月后，收集種子，4 °C冰箱貯存待用。
[0019] 5)擬南芥轉(zhuǎn)化植株種子的篩選
[0020] 將得到的種子進(jìn)行篩選，包括⑶S組織化學(xué)染色分析和轉(zhuǎn)基因陽性植株的PCR檢 測得到轉(zhuǎn)入TtHMBP基因的擬南芥。
[0021] 6)轉(zhuǎn)基因擬南芥抗重金屬性驗(yàn)證
[0022] 將轉(zhuǎn)化植物自交純合3代，獲得純合轉(zhuǎn)化株，收取種子。播種后，在22°C生長兩個 星期。然后將野生型和轉(zhuǎn)基因培養(yǎng)皿小苗用于抗重金屬實(shí)驗(yàn)。用500 μ Μ濃度的氯化鉻溶 液處理野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥株系。處理一周，結(jié)果顯示在500 μ Μ氯化鉻處理下野生型生 長明顯受抑制，根系不生長，葉片稀少，而轉(zhuǎn)基因株系抑制較小。結(jié)果說明TtHMBP基因明顯 提高了擬南芥的抗重金屬能力。
[0023] 本發(fā)明實(shí)現(xiàn)的有益效果
[0024] 本發(fā)明采用PTDS法合成了來源于耐高溫菌的重金屬結(jié)合蛋白TtHMBP基因，為了 進(jìn)一步分析該基因在重金屬逆境中的作用與功能，我們比較了轉(zhuǎn)TtHMBP基因的擬南芥植 株和野生型擬南芥植株的抗重金屬性。結(jié)果表明，野生型和轉(zhuǎn)TtHMBP基因擬南芥植株在表 型上有很大的差異。結(jié)果顯示在500 μ Μ濃度的氯化鉻濃度培養(yǎng)基處理下野生型生長明顯 受抑制，根系不生長，葉片稀少，而轉(zhuǎn)基因株系抑制較小。結(jié)果說明ΕΝΗΧ2基因明顯提高了 擬南芥的抗重金屬能力。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0025] 圖1是用于擬南芥轉(zhuǎn)化的植物表達(dá)載體示意圖。
[0026] 圖2是獲得的轉(zhuǎn)TtHMBP基因擬南芥的⑶S染色圖。
[0027] 圖3是轉(zhuǎn)TtHMBP基因擬南芥與野生型擬南芥的抗重金屬表型圖。

【具體實(shí)施方式】
[0028] 以下結(jié)合附圖詳細(xì)描述本發(fā)明的技術(shù)方案。應(yīng)當(dāng)說明的是，所述實(shí)施例僅用以說 明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的 普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明 技術(shù)方案的精神和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍中。
[0029] 本發(fā)明所用的試驗(yàn)材料及其來源包括：
[0030] 野生型擬南芥（Arabidopsis thaliana)生態(tài)型擬南芥Columbia, 23°C人工氣候 室培養(yǎng)，16h光照培養(yǎng)。
[0031] 克隆載體pMD-18-Simple T、各類限制性內(nèi)切酶、Taq聚合酶、連接酶、dNTP、 10XPCR buffer和DNA marker購自寶生物工程大連有限公司。所有的化學(xué)試劑都從美國 西格瑪化學(xué)公司和上海國藥化學(xué)試劑購買。ABI PRIAM Big-Dye Terminator DNA測序試劑 盒購自美國應(yīng)用系統(tǒng)公司。
[0032] 本發(fā)明所用的試劑若未明確指明，則均購自西格瑪-奧德里奇（Sigma-Aldrich)。
[0033] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，如沒有特別注明，均參考自《分子克隆》一書（J.薩 姆布魯克、E.F.弗里奇、T.曼尼阿蒂斯著，1994,科學(xué)出版社。）
[0034] 實(shí)施例1
[0035] 耐高溫菌的重金屬結(jié)合蛋白TtHMBP基因的人工合成
[0036] 根據(jù)Genbank登錄的耐高溫菌TtHMBP基因序列，用以基因合成方法【Nucleic Acids Research，2004, 32，e98】，在不改變基因編碼的氨基酸序列的前提下，按以下原則進(jìn) 行合成基因編碼區(qū)的設(shè)計(jì)：（一）優(yōu)化基因密碼子，提高基因翻譯效率。（二）消除基因內(nèi) 部的常用限制性內(nèi)切酶的識別位點(diǎn)，便于表達(dá)盒構(gòu)建。（三）消除逆向重復(fù)序列、莖環(huán)結(jié)構(gòu) 和轉(zhuǎn)錄終止信號，使基因內(nèi)部的GC/AT均衡，提高RNA的穩(wěn)定性。（四）使基因編碼蛋白符 合N端原則（Tobiasl991)，以提高翻譯蛋白的穩(wěn)定性。（五）設(shè)計(jì)提高基因5'端的自由能， 以提1?基因翻譯起始效率。
[0037] 擴(kuò)增條件為：941：預(yù)熱11^11;941：，3〇8,5〇1：，3〇8,721：，21^11，使用的了&9〇嫩聚 合酶為KOD FX taq酶（Toyobo公司，日本），共25個循環(huán)。
[0038] PCR結(jié)束后，1 %瓊脂糖膠回收，取10 μ 1直接與T/A克隆載體相連（大連寶生物公 司）。4°C連接過夜，高效轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)中。獲得陽性克隆。
[0039] 實(shí)施例2
[0040] TtHMBP農(nóng)桿菌雙元載體的構(gòu)建
[0041] 上述人工合成的TtHMBP基因的陽性克隆用引物經(jīng)PCR擴(kuò)增后頭尾分別加入BamHI 和Sac I切點(diǎn)，經(jīng)Bam ΗΙ+Sac I雙酶切，回收DNA片段與相應(yīng)酶切的載體相連，經(jīng)酶切鑒定 和測序后得到正確的雙元載體（見圖1)。
[0042] 實(shí)施例3
[0043] 電擊法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
[0044] 1)制備農(nóng)桿菌 GV3101 感受態(tài)，方法參照 MicroPulser? Electroporation Apparatus Operating Instructions and Application Guide (BIO-RAD 公司）（（Raineri et al. , Bio. Tech. ,1990,8 :33-38)。
[0045] 2)取50μ LGV3101感受態(tài)細(xì)胞，加入1μ LDNA，轉(zhuǎn)入0· 2cm電擊杯轉(zhuǎn)化（400Ω， 2. 5KV，25 μ f)。加入lmL含有1 %甘露醇的LB培養(yǎng)基恢復(fù)培養(yǎng)2小時（28°C，250rpm)。分 別取10 μ L、100 μ L涂LB平板（利福平50 μ g/mL，慶大霉素50 μ g/mL，氯霉素100 μ g/mL)。
[0046] 3)挑取幾個克隆，堿法抽提農(nóng)桿菌質(zhì)粒，酶切鑒定，PCR檢測。
[0047] 實(shí)施例4
[0048] 農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化擬南芥
[0049] A擬南芥的培養(yǎng)
[0050] 1)擬南芥種子在4°C進(jìn)行2-3天的春化處理，目的是有利于種子的一致萌發(fā)和花 期的提前。
[0051] 2)將蛭石、黑土、珍珠巖按9 : 3 : 0.5的比例拌勻，經(jīng)高溫滅菌后裝于10cm的塑 料小盆，以營養(yǎng)液PNS浸濕待用。
[0052] 3)以牙簽將擬南芥種子點(diǎn)播于濕潤的基質(zhì)上，保鮮膜封口。放置于22°C暗培養(yǎng) 2-3天，待種子萌發(fā)后，揭開保鮮膜，置于22°C培養(yǎng)室中進(jìn)行16小時光照培養(yǎng)。
[0053] 4)擬南芥抽苔后及抽苔后兩周以及轉(zhuǎn)化后需再以PNS營養(yǎng)液浸濕一次。中途可視 情況適當(dāng)澆水。首次抽苔后需剪去初生苔，利于次生苔的生長，當(dāng)次生苔長至2-lOcm(少數(shù) 已經(jīng)開花）可用于轉(zhuǎn)化（何玉科，鞏振輝，細(xì)跑生物學(xué)雜志，1991，13(3) :97-101)。
[0054] B農(nóng)桿菌的準(zhǔn)備
[0055] 1)挑取農(nóng)桿菌單菌接種于5mL LB液體培養(yǎng)基（利福平50 μ g/mL，氯霉素100 μ g/ mL)中，28°C，25〇rpm 培養(yǎng) 2〇 小時。（Rashid et al.，l"6)
[0056] 2)取lmL菌液轉(zhuǎn)接入20-30mL LB液體培養(yǎng)基（利福平50 μ g/mL，氯霉素100 μ g/ mL)中，28°C，250rpm 培養(yǎng)約 12 小時，測 0D600 ?1· 5。
[0057] 3)8000印111，41：，101^11離心收集菌體，重懸于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化滲透液（5%蔗糖， 0· 05% Silwet L-77)并稀釋至 0D600 ?0· 8。
[0058] C擬南芥蘸花法轉(zhuǎn)化
[0059] 1)將擬南芥的花苔浸入滲透液中，輕輕攪動約3?5秒后取出，全部轉(zhuǎn)化完畢后， 托盤中加入PNS營養(yǎng)液，以黑色塑料袋套盆封口，保持濕潤環(huán)境，置于22°C培養(yǎng)室低光強(qiáng)度 下生長24小時，即可正常培養(yǎng)。
[0060] 2)初次轉(zhuǎn)化四天后，可再進(jìn)行一次轉(zhuǎn)化，重復(fù)兩次，總共轉(zhuǎn)化三次，這樣可以在花 發(fā)育的不同時期進(jìn)行轉(zhuǎn)化，提高轉(zhuǎn)化效率。
[0061] 3)生長約兩個月后，收集種子，4°C冰箱貯存待用。
[0062] 實(shí)施例5
[0063] 擬南芥轉(zhuǎn)化植株種子的篩選
[0064] 1)稱25-30mg種子放入1. 5mL離心管。
[0065] 2) 1IHL751%乙醇消毒lmin (不停搖晃振蕩），8000rpm離心5秒，去上清。
[0066] 3)加入lmL過濾后的漂白粉消毒15min(不停搖晃振蕩，充分消毒），8000rpm離心 5秒，去上清。
[0067] 4)無菌水洗滌3-4次。
[0068] 5)將種子均勻的播撒到1/2MS平板（Hyg50y g/mL)上，Parafilm膜封口，4°C冰箱 放置兩天，22°C，16小時光照培養(yǎng)6天。
[0069] 6)將抗性植株移栽到盆中培養(yǎng)，苗稍大后，進(jìn)行GUS活性檢測，選出陽性植株（T1) 繼續(xù)培養(yǎng)，并收集種子進(jìn)行T2代和T3代篩選。
[0070] 實(shí)施例6
[0071] 轉(zhuǎn)基因陽性植株的檢測
[0072] 按Jefferson(1978)的方法，將待測擬南芥葉片樣品與X-Gluc染色反應(yīng)液（50m mol/L NaH2P04, pH7.0 ;0.5m mol/L K4[Fe(CN)6]，0. 1% Triton X-100,20% 甲醇，0.5mg/ mL X-Gluc[X-glucuronide])于37°C保溫2-4小時后，用75%乙醇脫色觀察（見圖2)。
[0073] 實(shí)施例7
[0074] 耐高溫菌的重金屬結(jié)合蛋白TtHMBP基因轉(zhuǎn)化植物后的抗重金屬分析
[0075] 將轉(zhuǎn)化植物自交純合3代，獲得純合轉(zhuǎn)化株，收取種子。播種后，在22°C生長兩個 星期。然后比較了轉(zhuǎn)TtHMBP基因的擬南芥植株和野生型擬南芥植株的抗重金屬性。結(jié)果 表明，野生型和轉(zhuǎn)TtHMBP基因擬南芥植株在表型上有很大的差異。結(jié)果顯示在500 μ Μ濃 度的氯化鉻濃度培養(yǎng)基處理下野生型生長明顯受抑制，根系不生長，葉片稀少，而轉(zhuǎn)基因株 系抑制較小。結(jié)果說明TtHMBP基因明顯提高了擬南芥的抗重金屬能力（圖3)。
[0001] 附：本申請中所涉及到的核苷酸序列表： <110〉上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 <120〉一種來源于耐高溫菌的重金屬結(jié)合蛋Π 基因及其抗重金屬應(yīng)用 <141〉 2013-3-18 <160> 2 <210> SEQ ID No 1 <211> 213 <212> DNA <213〉耐高溫菌 <220> <223〉n =a或g或c或t <400> ORIGIN 1 ggalccatgc tcaaactgaa. agttgaaggt atgacttgca atcattgcgt 51 catggctgtt accaaagctc tgaagaaggt tccaggtgtt gagaaggttg 101 aagtctctct tgagaaaggt gaagctcttg ttgaaggtac tgctgatcca 151 aaggctcttg ttcaagctgt tgaagaagaa ggttacaaag ctgaagttct 201 tgcctaagag etc // <210〉 SEQ ID No 2 <211〉 68 <212> PRT , <213〉耐高溫菌 <400> ORIGIN 1 GSMLKLKVEG MTCNHCVMAV TKALKKVPGV EKVEVSLEKG EALVEGTADP 51 KALVQAVEEE GYKAEVLA- //
【權(quán)利要求】
1. 一種來源于耐高溫菌的根據(jù)植物偏愛人工合成的重金屬結(jié)合蛋白基因，其特征在 于，其核苷酸序列如SEQ ID N01所示。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的來源于耐高溫菌的重金屬結(jié)合蛋白，其特征在于，其氨基酸 序列如SEQ ID N02所示。
3. 權(quán)利要求1或2所述的重金屬結(jié)合蛋白采用人工方法制備而成。
4. 權(quán)利要求1或2所述的重金屬結(jié)合蛋白采用農(nóng)桿菌蘸花法轉(zhuǎn)化擬南芥。
5. 權(quán)利要求1或2所述的重金屬結(jié)合蛋白轉(zhuǎn)基因植物在抗重金屬中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/82GK104099348SQ201310154301
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2013年4月15日 優(yōu)先權(quán)日:2013年4月15日
【發(fā)明者】薛永, 姚泉洪, 彭日荷, 朱波, 韓紅娟, 韓靜, 王波, 王紅娟, 趙偉 申請人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院