專利名稱：一種堿性果膠酶PelN及其編碼基因與應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種堿性果膠酶PelN及其編碼基因與應用。
背景技術：
果膠是植物細胞壁的重要組成成分，包括原果膠，果膠酸和果膠酯酸。果膠物質的存在可以增加植物細胞壁的堅硬度，有利于維持植物的特定外形結構，但增加了對植物進行深加工的工業(yè)操作的難度。果膠酶是指能夠分解果膠質的一類酶，普遍存在于自然界的高等植物和微生物中，是重要的工業(yè)酶制劑。堿性果膠酶(EC:4.2.2.2)是一類在堿性條件下，以反式消去作用斷開果膠質主鏈，產生不飽和的寡聚半乳糖醛酸的酶，在紡織工業(yè)的麻類脫膠、棉織品精煉等領域內有著廣泛的應用。相比于傳統(tǒng)的高堿、高溫處理手段，使用堿性果膠酶不僅對果膠質有較好的去除作用，對天然纖維素纖維損傷較小，而且可以減少材料消耗和環(huán)境負擔，為紡織工業(yè)開辟了一條綠色清潔之路。目前，堿性果膠酶的廣泛應用已受到生產成本和酶穩(wěn)定性等因素的制約。國內篩選得到的堿性果膠酶野生產酶菌株的生產水平參差不齊，且野生菌的生產能力距離工業(yè)應用的需求還很遠。因此，篩選穩(wěn)定性高的堿性果膠酶，并構建生產工藝簡單、產量高的工程菌是提高堿性果膠酶工業(yè)化水平的重點。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種堿性果膠酶PelN及其編碼基因與應用。本發(fā)明所提供的蛋白質PelN來自類芽孢桿菌(Paenibacillus sp.PL0602)，具有堿性果膠酶的功能，為如下(a)或(b)的蛋白質:(a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列I的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有堿性果膠酶功能的由序列表序列I衍生的蛋白質。為了使(a)或(b)中的蛋白質PelN便于純化，可在由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質的氨基末端或羧基末端連接上如表I所示的標簽。表I標簽的序列
標簽殘基數(shù)序列
Poly-Arg5-6 (通常為 5 個)RRRRR
Poly-His2-10 (通常為 6 個)HHHHHH
權利要求
1.一種蛋白質，是如下(a)或(b)的蛋白質: (a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質； (b)將序列表中序列I的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有堿性果膠酶功能的由序列表序列I衍生的蛋白質。
2.權利要求1所述蛋白質的編碼基因； 所述基因可為如下I)或2)或3)的DNA分子: 1)序列表中序 列2的第7位至第1434位所示的DNA分子； 2)在嚴格條件下與I)限定的DNA序列雜交且編碼具有堿性果膠酶活性蛋白的DNA分子; 3)與I)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼具有堿性果膠酶活性蛋白的DNA分子。
3.含有權利要求2所述基因的重組表達載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌。
4.根據(jù)權利要求3所述的重組表達載體或重組菌，其特征在于: 所述重組表達載體是將所述基因插入載體pET22b的NcoI和XhoI位點間得到的；所述重組菌是將所述重組表達載體導入大腸埃希氏菌(Escherichia coli)得到的；具體可為大腸埃希氏菌(Escherichia coli)BL21 (DE3)PelN，在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏號為CGMCC N0.7166。
5.權利要求1所述蛋白質在降解果膠或制備具堿性果膠酶活性的產品中的應用。
6.根據(jù)權利要求5所述的應用，其特征在于:所述果膠為多聚半乳糖醛酸。
7.根據(jù)權利要求5或6所述的應用，其特征在于:所述降解的pH值為7.1— 11.0，或7.6—10.4，或 8.1—10.4，或 8.6—10.4，或 9.0—10.4，或 9.4—10.4 ;具體可為 7.6,8.1、8.6,9.0,9.4,9.8 或 10.4 ; 所述降解的溫度為 35°C — 75°C，或 40°C — 70°C，或 50°C — 70°C，或 55°C — 70°C，或600C-700C ;具體可為 35°C、4(TC、45t:、5(rC、55t:、6(rC、65t:、7(rC*75t:。
8.—種生產堿性果膠酶的方法，包括如下步驟:將權利要求4所述大腸埃希氏菌BL21(DE3)PelN接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，35-37°C振蕩培養(yǎng)至OD6citlnm=0.4-0.6，然后加入IPTG至終濃度為100-200 μ Μ，28-32°C繼續(xù)振蕩培養(yǎng)40-45小時，得到堿性果膠酶。
9.根據(jù)權利要求8所述的方法，其特征在于:所述發(fā)酵培養(yǎng)基的溶劑為水，溶質及其在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的終濃度分別為:胰蛋白胨10_15g/L，酵母提取物15-24g/L，甘油8_12g/L,憐酸二氧鐘 10-17mmol/L,憐酸氧二鐘 65_75mmol/L。
10.根據(jù)權利要求8或9所述的方法，其特征在于:所述大腸埃希氏菌BL21(DE3)PelN以種子液的方式接種至所述發(fā)酵培養(yǎng)基；接種量為1%_5% ； 所述種子液的制備方法如下:將所述大腸埃希氏菌BL21(DE3)PelN接種至種子培養(yǎng)基，35-37°C振蕩培養(yǎng)至( _μ=6.0-8.0,即為所述種子液； 所述種子培養(yǎng)基的溶劑為水，溶質及其在所述種子培養(yǎng)基中的終濃度分別為:胰蛋白胨10-15g/L，酵母提取物5-8g/L，氯化鈉4-6g/L ;所述種子培養(yǎng)基的pH值為7.0-7.2。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種堿性果膠酶PelN及其編碼基因與應用。所述PelN為序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質，具有堿性果膠酶活性，含有該蛋白編碼基因的重組菌大腸埃希氏菌(Escherichia coli)BL21(DE3)PelN，在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏號為CGMCC No.7166。實驗證明，本發(fā)明所提供的蛋白質PelN，降解多聚半乳糖醛酸的酶活為4590—4950U/mg；熱穩(wěn)定性較好，在45℃保溫120min的相對酶活仍在90%以上；作為堿性果膠酶的最適pH為9.8，最適溫度為65℃。本發(fā)明所提供的蛋白質PelN、重組菌及堿性果膠酶生產方法為工業(yè)化大規(guī)模生產堿性果膠酶提供了有效途徑。
文檔編號C12N1/21GK103215244SQ201310155628
公開日2013年7月24日 申請日期2013年4月28日 優(yōu)先權日2013年4月28日
發(fā)明者李小曼, 王輝林, 宋江寧, 馬延和 申請人:中國科學院天津工業(yè)生物技術研究所