專利名稱：一種人工dna分子及檢測目標(biāo)基因表達(dá)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及遺傳工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種人工DNA分子，及利用該人工DNA分子檢測目標(biāo)基因表達(dá)的方法。
背景技術(shù)：
哺乳動物β -酪蛋白基因在乳腺中高表達(dá)，皮膚和有毒T淋巴細(xì)胞(cytotoxic Tlymphocytes)中也能表達(dá)。酪蛋白是哺乳動物乳中主要的蛋白組份，根據(jù)結(jié)構(gòu)劃分為4類:a sl、a s2、β和K。乳腺組織中，4種酪蛋白基因mRNA翻譯效率不同，a sl和β的mRNA翻譯效率是Cis2和K的3至4倍。綜上所述，β_酪蛋白基因位點是制備乳腺生物反應(yīng)器的合適靶點。為證實β -酪蛋白基因啟動子驅(qū)動的表達(dá)框是否有效，Kolb等(1999)采用乳腺上皮細(xì)胞。國內(nèi)乳腺生物反應(yīng)器研究方面，也采用乳腺上皮細(xì)胞驗證表達(dá)框的有效性。如果能夠在成纖維細(xì)胞中激活β_酪蛋白基因啟動子，檢測重組表達(dá)框的表達(dá)結(jié)果，將為乳腺生物反應(yīng)器的構(gòu)建提供直接方便的檢測技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種人工DNA分子，還提供一種利用該DNA分子檢測目標(biāo)基因在成纖維細(xì)胞中表達(dá)的方法。本發(fā)明中術(shù)語“TALE”是指轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)子。本發(fā)明中術(shù)語“TALE-TFs” 是指 TALE 轉(zhuǎn)錄因子，即 TALEtranscription factors。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案:一種DNA分子，所述DNA分子的堿基序列為SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.2所示，其能夠編碼一種TALE-TFs，所述TALE-TFs能夠識別SEQ ID N05中的11-29位；所述DNA分子的堿基序列也可以為SEQ ID N0.3或SEQ ID N0.4所示，其能夠編碼一種TALE-TFs，所述TALE-TFs能夠識別SEQ ID N05中的23-41位。一種表達(dá)載體，所述表達(dá)載體包含上述的DNA分子，其能夠表達(dá)一種TALE-TFs?！N重組細(xì)胞,所述重組細(xì)胞是用上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。一種檢測目標(biāo)基因表達(dá)的方法，包括以下步驟，步驟A、將目標(biāo)基因轉(zhuǎn)入哺乳動物β -酪蛋白基因，構(gòu)建含目標(biāo)基因的哺乳動物β_酪蛋白基因表達(dá)載體；步驟B、根據(jù)哺乳動物β -酪蛋白基因啟動子靶序列TFml和TFm2分別設(shè)計TALE排列，并構(gòu)建表達(dá)TALE-TFs的表達(dá)載體；其中所述哺乳動物β -酪蛋白基因啟動子靶序列TFml 為 SEQ ID NOl 中的 11-29 位，靶序列 TFm2 為 SEQ ID NOl 中的 23-41 位；步驟C、用所述含目標(biāo)基因的哺乳動物酪蛋白基因表達(dá)載體和所述表達(dá)TALE-TFs的表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞；

步驟D、在成纖維細(xì)胞中檢測目標(biāo)基因的表達(dá)。
進(jìn)一步，上述檢測目標(biāo)基因表達(dá)的方法，其中，步驟A所述酪蛋白基因是小鼠β_釀蛋白基因。進(jìn)一步，上述檢測目標(biāo)基因表達(dá)的方法，其中，步驟B所述表達(dá)TALE-TFs的表達(dá)載體包含上述的DNA分子。進(jìn)一步，上述檢測目標(biāo)基因表達(dá)的方法，其中，步驟C所述的成纖維細(xì)胞為小鼠成纖維細(xì)胞。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于:為證實重組的表達(dá)框是否有效，國內(nèi)外均采用在乳腺上皮細(xì)胞中進(jìn)行檢測。而利用TALE-TFs技術(shù)使不表達(dá)β -酪蛋白基因的哺乳動物成纖維細(xì)胞能夠表達(dá)β -酪蛋白基因，也就能夠?qū)崿F(xiàn)用TALE-TFs在成纖維細(xì)胞中激活重組的β -酪蛋白基因一外源整合基因表達(dá)框，能夠為體外 檢測重組的β-酪蛋白啟動子驅(qū)動的表達(dá)框提供一種更加方便的檢測途徑，無需培養(yǎng)乳腺上皮細(xì)胞。


圖1為小鼠β -酪蛋白基因第I外顯子靶向載體結(jié)構(gòu)示意圖；圖2為中間載體pEGFP-Nl-BsmBI結(jié)構(gòu)示意圖；圖3為小鼠成纖維細(xì)胞中TALE-TFs激活β -酪蛋白基因啟動子質(zhì)粒表達(dá)結(jié)果圖片。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述，但不作為對本發(fā)明的限定。實施例1小鼠β -酪蛋白基因-紅色熒光蛋白報告基因表達(dá)載體構(gòu)建實施例1中將紅色熒光蛋白報告基因作為目的基因，轉(zhuǎn)入小鼠β_酪蛋白基因，并構(gòu)建成小鼠β-酪蛋白基因-紅色熒光蛋白報告基因表達(dá)載體。如圖1所示，小鼠β_酪蛋白基因-紅色熒光蛋白報告基因表達(dá)載體包含左右同源臂、mRNA5’非翻譯區(qū)、信號肽序列、Red基因和poly A，形成一個完整的表達(dá)框，并包含啟動子調(diào)控序列和TATA box。因此，該載體能夠用于TALE-TFs激活β-酪蛋白基因啟動子的檢測。1.1引物設(shè)計引物并加入BsmBI酶切位點(小寫斜體字母)和其他所需要的酶切位點(下劃線部分)，引物由Invitrogen公司合成(見表I)。表I引物名稱及序列名稱set|uencc(5# )
E IBFGGACCACGGAACITAGGCGGG
EI BRG€CACAAOGCAGGCGACjCiil:r
ZTFΜ—Π—X1M—MTCTGACAgagiicgaTrAACXXT(認(rèn)
ZTRACTCiGAATIlXlACVirgagacgCTCllirTGACGCrriiiirArACf
BI LI*TUCXiTCc^lcUrCTd/VCVVGCATTCIGAAUTCnWnTGAii
BI!i<1.ClXiAtcglclcCCKiCriirCAACiTCCrTTACil'CiCiACKiACAACiACiACiCiACKn'
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BI RlGCTGACegfctcCGAGTGCACTATGGAOCCTCACITCT菌株與載體:大腸桿菌(Escherichiacoli) DH5a、pDsRed2_l 載體、pEGFP-Nl 載體。酶類及主要生化試劑:BglI1、EcoR1、HindII1、NcoI購自寶生物工程(大連)有限公司；Taq DNA聚合酶、pfu DNA 聚合酶購自天根生化科技(北京)有限公司；Esp3I (BsmBI )、Rapid DNA Ligation Kit 購自 Fermentas ；T4DNA Ligase (HC)購自 Promega 公司；基因組抽提試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。1.2小鼠基因組抽提采用頸椎脫臼處死實驗小鼠，采取肌肉組織大約25mg左右，使用基因組抽提試劑盒抽提小鼠基因組，檢測備用。1.3小鼠β -酪蛋白基因第一外顯子兩端同源臂序列擴(kuò)增針對小鼠β_酪蛋白基因第一外顯子基因組序列(Χ13484.1)，設(shè)計同源臂特異性擴(kuò)增引物。第一外顯子:上游引物E1F，下游引物E1R，擴(kuò)增第一外顯子同源臂Ε1Β，目的片段長度3370bp。采用25 μ L反應(yīng)體系(表2):表2同源臂序列擴(kuò)增體系
ill+分UiL;+_:顏;裡1應(yīng)2
dNTP, IOmM權(quán)利要求
1.一種DNA分子，其特征在于，所述DNA分子的堿基序列為SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.2所示，其能夠編碼一種TALE-TFs，所述TALE-TFs能夠識別SEQ ID N05中的11-29位； 所述DNA分子的堿基序列也可以為SEQ ID N0.3或SEQ ID N0.4所示，其能夠編碼一種 TALE-TFs，所述 TALE-TFs 能夠識別 SEQ ID N05 中的 23-41 位。
2.—種表達(dá)載體,其特征在于,所述表達(dá)載體包含權(quán)利要求1所述的DNA分子,其能夠表達(dá)一種 TALE-TFs。
3.—種重組細(xì)胞，其特征在于，所述重組細(xì)胞是用權(quán)利要求2所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。
4.一種檢測目標(biāo)基因表達(dá)的方法，其特征在于， 步驟A、將目標(biāo)基因轉(zhuǎn)入哺乳動物β-酪蛋白基因，構(gòu)建含目標(biāo)基因的哺乳動物β-酪蛋白基因表達(dá)載體； 步驟B、根據(jù)哺乳動物β -酪蛋白基因啟動子靶序列TFml和TFm2分別設(shè)計TALE排列，并構(gòu)建表達(dá)TALE-TFs的表達(dá)載體；其中所述哺乳動物β -酪蛋白基因啟動子靶序列TFml為SEQ ID NOl中的11-29位，靶序列TFm2為SEQ ID NOl中的23-41位； 步驟C、用所述含目標(biāo)基因的哺乳動物β -酪蛋白基因表達(dá)載體和所述表達(dá)TALE-TFs的表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞； 步驟D、在成纖維細(xì)胞中檢測目標(biāo)基因的表達(dá)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測目標(biāo)基因表達(dá)的方法，其特征在于，步驟A所述β-酪蛋白基因是小鼠β_酪蛋白基因。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的檢測目標(biāo)基因表達(dá)的方法，其特征在于，步驟B所述表達(dá)TALE-TFs的表達(dá)載體包含權(quán)利要求1所述的DNA分子。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測目標(biāo)基因表達(dá)的方法，其特征在于，步驟C所述的成纖維細(xì)胞為小鼠成纖維 細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明提供一種DNA分子，所述DNA分子的堿基序列為SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示，其能夠編碼一種TALE-TFs，所述TALE-TFs能夠識別SEQ ID NO5中相應(yīng)位點。本發(fā)明利用TALE-TFs技術(shù)使不表達(dá)β-酪蛋白基因的哺乳動物成纖維細(xì)胞能夠表達(dá)β-酪蛋白基因，也就實現(xiàn)了用TALE-TFs在成纖維細(xì)胞中激活重組的β-酪蛋白基因——外源整合基因表達(dá)框，為體外檢測重組的β-酪蛋白啟動子驅(qū)動的表達(dá)框提供一種更加方便的檢測途徑，無需培養(yǎng)乳腺上皮細(xì)胞。
文檔編號C12N15/63GK103233004SQ20131015644
公開日2013年8月7日 申請日期2013年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月28日
發(fā)明者皮文輝, 周平, 唐紅, 張賓, 馬小寧, 張譯元, 劉文娟, 楊華, 楊永林, 王新華, 劉守仁 申請人:新疆農(nóng)墾科學(xué)院