專利名稱：一種高通量全基因組dna甲基化檢測(cè)技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于DNA甲基化檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種高通量全基因組DNA甲基化檢測(cè)技術(shù)。
背景技術(shù)：
:DNA甲基化(DNA methylation)是真核生物基因組DNA的一種重要的表觀遺傳學(xué)修飾，即在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase, DNMT)的作用下,將S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的甲基集團(tuán)共價(jià)結(jié)合到DNA分子的胞嘧啶上形成5-甲基胞嘧啶(5-mC)的過程。DNA甲基化在維持高等生物正常細(xì)胞功能、遺傳印記、胚胎發(fā)育、衰老以及人類腫瘤的發(fā)生等生物學(xué)過程中起著重要作用。在無脊椎動(dòng)物中，基因組DNA甲基化通過調(diào)控基因的表達(dá)模式，參與調(diào)節(jié)機(jī)體對(duì)環(huán)境的適應(yīng)過程。因此，獲得全基因組范圍內(nèi)所有胞嘧啶位點(diǎn)的甲基化數(shù)據(jù)，對(duì)于表觀遺傳學(xué)的時(shí)空特異性研究具有重要意義。隨著甲基化研究的不斷深入，已經(jīng)有多種甲基化分析方法以滿足不同甲基化研究的需要。在針對(duì)全基因范圍DNA甲基化的研究中，檢測(cè)的手段主要是基于芯片平臺(tái)的全基因組甲基化位點(diǎn)的篩選和基于高通量測(cè)序平臺(tái)的甲基化圖譜分析。其中芯片技術(shù)在模式生物的甲基化研究中是相對(duì)完善成熟的檢測(cè)工具，具有高覆蓋度、方便快捷，性價(jià)比高等特點(diǎn)，如11 Iumina推出的人類全基因組甲基化芯片Human Methylation HD 450包含45萬個(gè)CpG位點(diǎn)，能夠覆蓋所有NCBI注釋的基因。操作流程簡(jiǎn)單，能夠進(jìn)行高通量甲基化位點(diǎn)的準(zhǔn)確檢測(cè)。但針對(duì)遺傳信息相對(duì)匱乏的非模式生物，其芯片造價(jià)昂貴，甲基化位點(diǎn)選擇的靈活性不高，因而難以利用現(xiàn)有芯片平臺(tái)對(duì)非模式生物進(jìn)行高通量全基因組甲基化的研究。隨著新一代測(cè)序技術(shù)通量不斷提高和成本的降低，目前有很多基于二代測(cè)序平臺(tái)的全基因組甲基化檢測(cè)方法以得到應(yīng)用，包括有全基因組重亞硫酸鹽測(cè)序(wholegenome bisulfite sequencing, BS-seq)和簡(jiǎn)化的表達(dá)重亞硫酸鹽測(cè)序(reducedrepresentation bisulfite sequencing, RRBS)、甲基化 DNA 免疫共沉淀測(cè)序(methylated DNA immunoprecipitation sequencing, MeDIP-seq)、甲基化 DNA 富集結(jié)合高通量測(cè)序(methylated DNA binding domain sequencing, MBD-Seq)和甲基化敏感性限制酶測(cè)序(methyIation-sensitive Restriction Enzyme sequencing, MRE-seq)等。這些技術(shù)都有其優(yōu)缺點(diǎn)和適用范圍，如基于亞硫氫酸鹽處理的DNA甲基化檢測(cè)方法，盡管作為DNA甲基化檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，但操作復(fù)雜(重亞硫氫酸鹽處理)，測(cè)序所需的成本較高，不適用于貝類等基因組較大的物種。MeDIP-Seq是對(duì)特異性抗體富集的基因組上的甲基化區(qū)域進(jìn)行高通量測(cè)序從而獲得全基因組范圍的甲基化位點(diǎn)。但該技術(shù)需要大量DNA，并且抗體的價(jià)格昂貴
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種高通量全基因組DNA甲基化檢測(cè)方法，即一種適用于非模式生物的，低成本、簡(jiǎn)單快速的高通量全基因組甲基化檢測(cè)方法，以彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足。本發(fā)明的全基因組DNA甲基化檢測(cè)方法，包括如下的步驟:I)將基因組DNA用內(nèi)切酶FspEI酶進(jìn)行酶切，獲得酶切片段；2)將酶切片段的兩端分別連接上接頭，作為擴(kuò)增引物的結(jié)合點(diǎn)；3)將連接上接頭的酶切片段用引物進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增，從而富集接頭連接正確的酶切片段；4 )將第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠純化后用弓I物進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，引入Barcode來構(gòu)建測(cè)序文庫；5)測(cè)序文庫進(jìn)行測(cè)序；將測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析得到全基因組甲基化信息。其中，步驟2)中的接頭，為接頭slxl和slx2，其中構(gòu)成slxl的兩個(gè)核苷酸片段，其序列分別為 5 ' -ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3 ' (SEQ ID NO:1)和3' -CGAGAAGGCTAGANNNNN-5' (SEQ ID NO: 2)，其中 N 為堿基 A、T、G、C 中的任一個(gè)；構(gòu)成slx2的兩個(gè)核苷酸片段，其序列分別為Y -GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3' (SEQ ID NO:3)和 3' -CGAGAAGGCTAGANNNNN-5' (SEQID N0:2)。所述的步驟3)中的引物,為Slx-Primer I和Slx-Primer 2,其核苷酸序列分別為:Slx-Primerl:5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGAC-3，(SEQ ID N0:4)；Slx-Primer 2:5’-GTGACTGGAGTTCAGACGTGT-3， (SEQ ID NO:5);所述的步驟4)中的引物為Slx-Primer I和Slx-1ndex Primer,其核苷酸序列分別為:Slx-Primerl:5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGAC-3，(SEQ ID N0:4)；Six-1ndex Primer:5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGT-3’ (SEQ IDNO:6);其中N為堿基A、T、G、C中的任一個(gè)。本方法可以實(shí)現(xiàn)甲基化修飾位點(diǎn)的準(zhǔn)確定位，通過酶切富集基因組甲基化位點(diǎn)，直接對(duì)甲基化標(biāo)簽序列進(jìn)行測(cè)序和定量，可以有效降低測(cè)序費(fèi)用。實(shí)驗(yàn)流程僅需兩天，具有通量高、操作簡(jiǎn)便、成本低廉、可靠性好等優(yōu)點(diǎn)，是一種優(yōu)良的適用于非模式生物的高通量全基因組甲基化檢測(cè)方法。


圖1:本發(fā)明的全基因組甲基化檢測(cè)方法的流程及原理示意圖。
具體實(shí)施方式
:本發(fā)明開發(fā)了基于高通量測(cè)序平臺(tái)的新型全基因組甲基化檢測(cè)分析技術(shù) MethylRAD-Seq (MethyIation-dependent restriction-site associated DNAsequencing),結(jié)合甲基修飾依賴性內(nèi)切酶和高通量測(cè)序的特點(diǎn)，在不需要基因組背景信息的前提下可以大規(guī)模發(fā)掘全基因組范圍內(nèi)的甲基化位點(diǎn)，直接精確檢測(cè)發(fā)生甲基化的胞嘧啶位點(diǎn)。該技術(shù)的原理主要是利用甲基化修飾依賴性限制性酶FspEI對(duì)基因組DNA進(jìn)行酶切，基因組中CG或CHG位點(diǎn)上的甲基化修飾均可以被FspEI識(shí)別，酶切后產(chǎn)生具有核心甲基化位點(diǎn)的等長(zhǎng)標(biāo)簽，對(duì)標(biāo)簽文庫進(jìn)行高通量測(cè)序技術(shù)能夠獲得全基因組范圍內(nèi)的甲基化位點(diǎn)序列信息。建庫流程簡(jiǎn)便快速，可同時(shí)對(duì)多個(gè)樣本進(jìn)行全基因組DNA甲基化分析。而且，本發(fā)明所用的接頭和引物可以高效的對(duì)基因組DNA進(jìn)行操作，提高了效率。本發(fā)明的方法對(duì)于表觀遺傳學(xué)背景相對(duì)較少的非模式生物是一種成本較低、操作簡(jiǎn)便的高通量全基因組甲基化分析方法。對(duì)于本發(fā)明中所涉及的名詞，定義如下:1、內(nèi)切酶,又稱為核酸內(nèi)切酶(endonuclease)在核酸水解酶中，為可水解分子鏈內(nèi)部磷酸二酯鍵生成寡核苷酸的酶；本發(fā)明所用到的FspEI內(nèi)切酶是一種甲基化修飾依賴性內(nèi)切酶，依賴于胞嘧啶位點(diǎn)的甲基化修飾從而對(duì)DNA分子產(chǎn)生切割作用。該酶購自NEB(New England Biolabs)有限公司。2、接頭:adaptor DNA，是一段短的含酶切位點(diǎn)并能與鈍性末端或粘性末端匹配的人工合成DNA片段，接頭DNA常用于一鈍性末端DNA與一粘性末端DNA的連接。有時(shí)連接到粘性末端的接頭DNA是為了給未知DNA片段提供一段已知的序列，根據(jù)其設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增未知的DNA片段。3、其中N為堿基A、T、G、C中的任一個(gè)；其中A、T、G、C代表組成DNA分子的四種
脫氧核苷。4、Barcode即一 段短的特征序列，對(duì)多個(gè)樣本同時(shí)進(jìn)行高通量測(cè)序時(shí),對(duì)每條reads上帶有的一段特定短序列(即barcode)測(cè)序能夠準(zhǔn)確識(shí)別樣本來源。本發(fā)明的方法，包括有如下的步驟:I)制備生物基因組DNA:提取生物的基因組DNA，4°C冰箱保存?zhèn)溆?。將提取的基因組DNA利用甲基化修飾依賴性內(nèi)切酶FspEI酶切基因組，獲得全基因組范圍內(nèi)的甲基化標(biāo)簽，其中酶切體系為20μ1，包含300ng基因組DNA，4U的FspEI內(nèi)切酶(ΝΕΒ),ΙΧΝΕ Buffer4, IXEnzyme Activator Solution, I XBSA, 37°C 保溫 4 小時(shí)。2)設(shè)計(jì)有粘性末端的接頭，連接標(biāo)簽酶切反應(yīng)產(chǎn)生的標(biāo)簽5'末端都帶有一個(gè)4堿基突出，設(shè)計(jì)3’端帶4個(gè)兼并堿基的接頭Six-Adaptor I, Slx-Adaptor 2，連接反應(yīng)體系為20μ1,包含ΙΟμΙ上步的酶切產(chǎn)物，800U Τ4 DNA連接酶(NEB), 1ΧΤ4 Ligase Buffer, 4μΜ SIex-Adl, 4μΜ Slx_Ad2，20mM三磷酸腺苷ATP, 4°C連接16h。其中接頭的序列信息見表I。3)進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增，富集標(biāo)簽，其中PCR反應(yīng)體系為20μ ，包含7μ1連接了接頭的酶切片段作為反應(yīng)模板，4μΜ Slx-Primerl引物(5，- AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGAC -3，)，4μΜSlx-Primer2 引物(5，- GTGACTGGAGTTCAGACGTGT -3’)，0.3mM dNTPs, 0.4U Phusion 超保真DNA聚合酶(NEB)，1X HF buffer ;反應(yīng)條件為98°C變性5 s，60°C退火20 s，72°C延伸10 S，進(jìn)行14-18個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸5min。PCR產(chǎn)物用8%非變性聚丙烯酰胺瓊凝膠電泳檢測(cè)，擴(kuò)增產(chǎn)物大小約為120bp，切膠回收PCR產(chǎn)物。
4) Barcode特異性引物二輪PCR擴(kuò)增為了實(shí)現(xiàn)多個(gè)個(gè)體混合測(cè)序進(jìn)行甲基化檢測(cè)，可以通過對(duì)每個(gè)個(gè)體添加不同的Barcode來區(qū)分，利用PCR反應(yīng)的不同引物引入不同的Barcode。PCR反應(yīng)體系為20μ ，包含 25ng—輪 PCR 擴(kuò)增純化產(chǎn)物，4μΜ Slx-Primerl 引物 5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGAC -3’ ，4MM Six-1ndex Primer 引物:5’ - CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGT-3’，其中 NNNNNN可根據(jù)不同的Barcode序列改變)，0.3mM dNTPs, 0.4U Phusion超保真DNA聚合酶(ΝΕΒ),ΙΧ HF buffer ;反應(yīng)條件為 98°C變性 5 s，60°C退火 20 s，72°C延伸 10 S，進(jìn)行 5-7個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸5min。平行擴(kuò)增3管，PCR產(chǎn)物用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，擴(kuò)增產(chǎn)物大小約為150bp，利用QIAGEN PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收純化PCR產(chǎn)物。利用Solexa Hiseq2000測(cè)序平臺(tái)測(cè)序，此部分由測(cè)序公司完成。5)數(shù)據(jù)分析:本實(shí)施例采用的方法如下:1、Illunima/Solexa測(cè)序產(chǎn)生的結(jié)果文件為fastq格式，首先利用SolexaQA軟件包對(duì)原始序列進(jìn)行質(zhì)量過濾，去除含有N的序列以及大于5個(gè)堿基的質(zhì)量值小于10的reads ；2、利用CD-HIT軟件對(duì)短序列進(jìn)行聚類分析，獲得測(cè)序文庫中的甲基化標(biāo)簽種類以及該代表標(biāo)簽的豐度信息，甲基化位點(diǎn)的覆蓋reads數(shù)目可以衡量該位點(diǎn)的甲基化水平； 3、利用SOAP軟件將甲基化位點(diǎn)的序列比對(duì)基因組參考序列，可以獲得該位點(diǎn)的基因組來源信息。表I本發(fā)明中涉及的接頭及引物序列表
接頭及引物名稱接頭及引物序列
Six-Adaptor I5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3'
3 ' -CGAGAAGGCTAGANNNNN- 5 Six-Adaptor 25'-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3'
3'-CGAGAAGGCTAGANNNNN-5r
Slx-Priraer I5 '-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGAd
Slx-Primer 25'-GTGACTGGAGTTCAGACGTGT-3,
Six-1ndex Primer 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACcT^T 3下面以蝦夷扇貝為例通過實(shí)施例詳細(xì)敘述本發(fā)明，對(duì)于本發(fā)明所用的試劑，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案，在現(xiàn)有試劑中進(jìn)行選擇，而不僅限于本發(fā)明具體實(shí)施例的限制。I)提取扇貝基因組DNA取II齡野生群體的蝦夷扇貝和海大金貝各12只，每個(gè)個(gè)體閉殼肌約0.1克，加入500ulSTE 裂解緩沖液(NaCl:1OOmM ；EDTA:lmM, ρΗ=8.0 ；Tris-HCl, IOnM, pH=8.0)，剪碎，再加入50μ1 10%的SDS，以及5μ1蛋白酶K (20mg/ml), 56°C水浴消化，至組織碎塊完全裂解，裂解液澄清。加入等體積飽和酚(250μ1)以及氯仿/異戊醇(24:1) (250μ1)，抽提3次，取上清液，加入等體積氯仿/異戊醇(24:1) (500ul)抽提I次，取上清液，加入1/10體積NaAc (3M，pH 5.2) (50μ1)和2倍體積_20°C保存無水乙醇(ΙΟΟΟμΙ )，緩慢搖勻；_20°C沉淀30min.12000rpm離心IOmin,核酸將沉淀于管底。70%乙醇(ΙΟΟΟμΙ)洗漆沉淀并干燥至乙醇全部揮發(fā)，加入ΙΟΟμΙ無菌水以及少量(l-2Pl)RNase A，4°C冰箱保存?zhèn)溆?。扇貝基因組DNA的消化利用甲基化修飾依賴性內(nèi)切酶FspEI酶切基因組，獲得全基因組范圍內(nèi)的甲基化標(biāo)簽:酶切體系為20μ1，包含300ng基因組DNA，4U的FspEI內(nèi)切酶(NEB) , I XNEBuffer4, I XEnzyme Activator Solution, I XBSA, 37°C保溫 4 小時(shí)。2)將酶切片段的兩端分別連接上接頭，作為擴(kuò)增引物的結(jié)合點(diǎn)酶切反應(yīng)產(chǎn)生的標(biāo)簽5'末端都帶有一個(gè)4堿基突出，設(shè)計(jì)3’端帶4個(gè)兼并堿基的接頭Slx-Adl，Slx-Ad2,連接反應(yīng)體系為20ul，包含IOul上步的酶切產(chǎn)物，800U T4DNA 連接酶(NEB)，I X T4 Ligase Buffer, 4uM Adaptor I, 4uM Adaptor 2，20mM 三憐酸腺苷 ATP，4°C連接 16h。3)將連接上接頭的酶切片段用引物進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增，從而富集接頭連接正確的酶切片段；PCR反應(yīng)體系為20μ ，包含7ul反應(yīng)模板，4μΜ Slx-Primerl引物(5，- AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGAC -3，)，4μΜ Slx-Primer2 引物(5，-GTGACTGGAGTTCAGACGTGT -3’)，0.3mM dNTPs, 0.4U Phusion 超保真 DNA 聚合酶(NEB)，IX HF buffer ;反應(yīng)條件為98°C變性5 s，60°C退火20 s，72°C延伸10 S，進(jìn)行14-18個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸5min。PCR產(chǎn)物用8%非`變性聚丙烯酰胺瓊凝膠電泳檢測(cè)，擴(kuò)增產(chǎn)物大小約為120bp，切膠回收PCR產(chǎn)物。4)將第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用引物進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，引入Barcode來構(gòu)建測(cè)序文庫；為了實(shí)現(xiàn)多個(gè)個(gè)體混合測(cè)序進(jìn)行甲基化檢測(cè)，可以通過對(duì)每個(gè)個(gè)體添加不同的Barcode來區(qū)分，利用PCR反應(yīng)的不同引物引入不同的Barcode。PCR反應(yīng)體系為20uL，包含 25ng—輪 PCR 擴(kuò)增純化產(chǎn)物，4μΜ Slx-Primerl 引物 5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGAC -3，，4μΜ Six-1ndex Primer 引物5，- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGT-3，，其中 NNNNNN可根據(jù)不同的Barcode序列改變，24只奸夷扇貝甲基化文庫使用的Six-1ndex Primer引物序列如表2所不，0.3mM dNTPs, 0.4U Phusion 超保真 DNA 聚合酶(ΝΕΒ),ΙΧ HF buffer ；反應(yīng)條件為98°C變性5 s，60°C退火20 s，72°C延伸10 S，進(jìn)行5_7個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸5min。平行擴(kuò)增3管，PCR產(chǎn)物用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，擴(kuò)增產(chǎn)物大小約為150bp，利用QIAGEN PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收純化PCR產(chǎn)物。利用Solexa Hiseq2000測(cè)序平臺(tái)測(cè)序,此部分由測(cè)序公司完成。表2本發(fā)明中涉及的Six-1ndex Primer引物序列表
權(quán)利要求
1.一種全基因組DNA甲基化檢測(cè)方法，包括如下的步驟: 1)將基因組DNA用內(nèi)切酶FspEI酶進(jìn)行酶切，獲得酶切片段； 2)將酶切片段的兩端分別連接上接頭，作為擴(kuò)增引物的結(jié)合點(diǎn)； 3)將連接上接頭的酶切片段用引物進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增，從而富集接頭連接正確的酶切片段； 4)將第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠純化后用引物進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，引入Barcode來構(gòu)建測(cè)序文庫； 5)測(cè)序文庫進(jìn)行測(cè)序；將測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析得到全基因組甲基化信息。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的步驟2)中的接頭，為接頭slxl和slx2，其中構(gòu)成slxl的兩個(gè)核苷酸片段，其序列分別為SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 2 ； 構(gòu)成slx2的兩個(gè)核苷酸片段，其序列分別為SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:2。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的步驟3)中的引物的核苷酸序列分別為SEQ ID NO:4 和 SEQ ID NO:5。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的步驟4)中的引物的核苷酸序列分別為SEQ ID NO:4 和 SEQ ID NO:6。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于提供一種高通量全基因組DNA甲基化檢測(cè)方法，用甲基化修飾依賴性限制性酶FspEI對(duì)基因組DNA進(jìn)行酶切，基因組中CG 或 CHG 位點(diǎn)上的甲基化修飾均可以被 FspEI 識(shí)別，酶切后產(chǎn)生具有核心甲基化位點(diǎn)的等長(zhǎng)標(biāo)簽，對(duì)標(biāo)簽文庫進(jìn)行高通量測(cè)序技術(shù)能夠獲得全基因組范圍內(nèi)的甲基化位點(diǎn)序列信息。本方法可以實(shí)現(xiàn)甲基化修飾位點(diǎn)的準(zhǔn)確定位，通過酶切富集基因組甲基化位點(diǎn)，直接對(duì)甲基化標(biāo)簽序列進(jìn)行測(cè)序和定量，可以有效降低測(cè)序費(fèi)用。實(shí)驗(yàn)流程僅需兩天，具有通量高、操作簡(jiǎn)便、成本低廉、可靠性好等優(yōu)點(diǎn)，是一種優(yōu)良的適用于非模式生物的高通量全基因組甲基化檢測(cè)方法。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103233072SQ20131016308
公開日2013年8月7日 申請(qǐng)日期2013年5月6日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月6日
發(fā)明者王師, 呂佳, 包振民, 張玲玲, 胡曉麗, 陸維 申請(qǐng)人:中國海洋大學(xué)