枯草芽孢桿菌Jaas ed1無(wú)細(xì)胞濾液胞外合成納米銀粒子的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種枯草芽孢桿菌Jaas?ed1無(wú)細(xì)胞濾液胞外合成納米銀粒子的方法，包括以下步驟：1)枯草芽孢桿菌Jaas?ed1無(wú)細(xì)胞濾液的制備，其中包括一次振蕩培養(yǎng)、一次離心處理、收集菌體、二次振蕩培養(yǎng)、二次離心處理；2)納米銀粒子的合成與表征。本發(fā)明采用枯草芽孢桿菌(Bacillus?subtilis)Jaas?ed1無(wú)細(xì)胞濾液，通過(guò)胞外合成納米銀粒子。經(jīng)紫外/可見(jiàn)光分光光度計(jì)全波長(zhǎng)掃描(UV-vis)、透射電子顯微鏡掃描(TEM)、X射線粉末衍射分析(XRD)、傅里葉變換紅外光譜分析(FT-IR)等方法驗(yàn)證所合成的納米銀粒子粒度在20～50nm之間，形態(tài)均一，分散性較好。因此本發(fā)明條件溫和，既簡(jiǎn)便快捷，又經(jīng)濟(jì)環(huán)保，所用試劑環(huán)境友好，為納米銀的綠色合成提供了一種新的思路。
【專利說(shuō)明】枯草芽孢桿菌Jaas edl無(wú)細(xì)胞濾液胞外合成納米銀粒子的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物及納米材料領(lǐng)域，尤其涉及一種枯草芽孢桿菌Jaas edl無(wú)細(xì)胞濾液胞外制備銀納米粒子的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]以細(xì)菌、真菌、病毒等微生物為侵染源的植物病害種類繁多，對(duì)現(xiàn)代種植業(yè)構(gòu)成重大威脅。目前，各種有機(jī)殺菌劑農(nóng)藥的使用非常普遍與頻繁，導(dǎo)致了十分嚴(yán)重的農(nóng)藥污染與病原菌抗藥性問(wèn)題。銀作為傳統(tǒng)殺菌劑，具有高效、安全無(wú)毒、抗菌譜廣、無(wú)耐藥性等優(yōu)點(diǎn)， 但由于銀離子化學(xué)性質(zhì)活潑，在光照、受熱等作用下容易被氧化，且易與鹵族元素陽(yáng)離子形成鹵化銀沉淀，從而導(dǎo)致抗菌性能的下降。納米銀與銀離子相比，具有比表面積大，抑菌活性強(qiáng)和穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥載體、水質(zhì)凈化、抗菌涂料、催化等領(lǐng)域(Mallic K, 2006) o但是納米銀在農(nóng)業(yè)病害防治方面應(yīng)用的報(bào)道較少，Kim (2012), Marek (2010)和 Jo (2009)等分別報(bào)道了不同形態(tài)納米銀粒子對(duì)多種植物病原真菌的拮抗作用，顯示了納米銀在植物病害防治領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。
[0003]目前納米銀制備方法主要采用液相化學(xué)還原法、光化學(xué)還原法、微乳液法等化學(xué)方法和高能球磨、激光濺射、激光燒蝕等物理方法(周全法，2008)。物理方法所得產(chǎn)品質(zhì)量高，但對(duì)設(shè)備要求和能耗較高，且對(duì)納米銀顆粒形貌的調(diào)控能力有限，不利于工業(yè)化生產(chǎn)；化學(xué)方法由于其工藝相對(duì)簡(jiǎn)單，操作相對(duì)容易，生產(chǎn)成本較低，是較常采用的方法，但其所用的化學(xué)試劑對(duì)人體和環(huán)境有一定的危害(Andersson M，2005)。采用生物材料或生物體系天然合成納米材料是解決生態(tài)友好及可靠性問(wèn)題的一種較好的方法。近年來(lái)，納米材料制備過(guò)程綠色化的研究日趨活躍，因其具有安全、環(huán)保、反應(yīng)條件溫和、所得納米銀粒子穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)，微生物還原法成為具有發(fā)展前景的納米銀制備新方法(Prasad TN, 2011 ；Krishnan V，2010)。當(dāng)前用于合成納米銀的微生物主要來(lái)自于細(xì)菌(Sahar Z，2011 ； Sintubin L, 2009)和真菌(Musarrat J, 2010 ；Kathiresan K, 2009)。細(xì)菌相對(duì)于真菌而言， 具有繁殖速度快、遺傳轉(zhuǎn)化操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，因而更多地被用于合成納米銀粒子。細(xì)菌合成納米銀粒子主要采用菌液胞內(nèi)合成與上清液胞外合成兩種方法，由于Ag+具有較強(qiáng)的殺菌作用，只有少數(shù)對(duì)Ag+有較強(qiáng)抗性的菌株才能采用菌液胞內(nèi)合成的方法，因此具有較大的局限性，同時(shí)菌液合成的納米銀顆粒大多吸附在菌體細(xì)胞壁表面或內(nèi)部，后期分離困難。而上清液胞外合成法因?yàn)檫x用細(xì)菌上清液，所以不存在拮抗Ag+的問(wèn)題，同時(shí)后期分離方便快捷，已成為細(xì)菌合成納米銀方法研究的重點(diǎn)。已有報(bào)道表明陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae) (Shahverdi AR, 2007)、地衣芽抱桿菌(Bacillus licheniform) (Kalimuthu K, 2008)可采用上清液胞外合`成法合成納米銀粒子。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種反應(yīng)條件溫和，既簡(jiǎn)便快捷，又經(jīng)濟(jì)環(huán)保的枯草芽孢桿菌Jaas edl胞外合成納米銀粒子制備方法。[0005]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為:一種枯草芽孢桿菌Jaas edl無(wú)細(xì)胞濾液胞外合成納米銀粒子的方法，包括以下步驟:
[0006]1)枯草芽孢桿菌Jaas edl無(wú)細(xì)胞濾液的制備:
[0007]—次振蕩培養(yǎng):將枯草芽孢桿菌Jaas edl放入裝有100毫升LB培養(yǎng)基的搖瓶中， 30°C振蕩培養(yǎng)，振蕩培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速為150轉(zhuǎn)/分鐘，時(shí)間為12-24個(gè)小時(shí)，獲得枯草芽孢桿菌 Jaas edl培養(yǎng)液；
[0008]一次離心處理:將經(jīng)過(guò)振蕩培養(yǎng)的枯草芽孢桿菌Jaas edl培養(yǎng)液進(jìn)行離心處理， 離心轉(zhuǎn)速為5000轉(zhuǎn)/分鐘，時(shí)間為15-30分鐘；
[0009]收集菌體:將經(jīng)過(guò)一次離心處理的枯草芽孢桿菌Jaas edl培養(yǎng)液中的菌體收集， 并將枯草芽孢桿菌Jaas edl菌體用去離子水蕩洗3次，以去除殘留的LB培養(yǎng)基；
[0010]二次振蕩培養(yǎng):將經(jīng)過(guò)上述收集菌體步驟處理后的枯草芽孢桿菌Jaas edl菌體重懸于100毫升去離子水中，30°C二次振蕩培養(yǎng)，二次振蕩培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速為150轉(zhuǎn)/分鐘，時(shí)間為12-36個(gè)小時(shí)，獲得枯草芽孢桿菌Jaas edl菌體懸液；
[0011]二次離心處理:將上述經(jīng)過(guò)二次振蕩處理的枯草芽孢桿菌Jaas edl菌體懸液進(jìn)行二次離心處理，二次離心處理的轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，時(shí)間為15-30分鐘，以將枯草芽孢桿菌Jaas edl菌體及其碎片與上清液分離；
[0012]收集上清液:將經(jīng)過(guò)上述二次離心處理后產(chǎn)生的上清液收集，然后將收集的上清液用孔徑為0.22 y m的濾膜過(guò)濾，獲得枯草芽孢桿菌Jaas edl無(wú)細(xì)胞濾液；
[0013]2)納米銀粒子的合成與表征:
[0014]首先，取步驟I)中制得的枯草芽孢桿菌Jaas edl無(wú)細(xì)胞濾液100毫升，加入 100-200 u I濃度為lmol/L的AgNO3,并在室溫放置24-72個(gè)小時(shí)；接著進(jìn)行離心處理，離心毫升速為15000轉(zhuǎn)/分鐘，時(shí)間為30-60分鐘；離心結(jié)束后，將沉淀物收集，再將收集的沉淀物用無(wú)水乙醇蕩洗3次，然后將沉淀物在60°C的溫度下烘干成粉末，制得納米銀粒子。
[0015]作為本發(fā)明進(jìn)一步改進(jìn)的技術(shù)方案，在步驟2)中，枯草芽孢桿菌Jaas edl無(wú)細(xì)胞濾液與AgNO3體積比為I毫升:1_2微升。
[0016]作為本發(fā)明進(jìn)一步改進(jìn)的技術(shù)方案，在步驟2)中，所述銀納米粒子的粒徑在 20-50納米之間。
[0017]作為本發(fā)明進(jìn)一步改進(jìn)的技術(shù)方案，步驟I)中，所述一次振蕩的時(shí)間為12個(gè)小時(shí)，一次離心處理的時(shí)間為15分鐘，二次振蕩的時(shí)間為12個(gè)小時(shí)，二次離心處理的時(shí)間為 30分鐘；步驟2)中，向枯草芽孢桿菌Jaas edl無(wú)細(xì)胞濾液中加入的AgNO3為200微升，離心處理的時(shí)間為30分鐘。
[0018]作為本發(fā)明進(jìn)一步改進(jìn)的技術(shù)方案，步驟I)中，所述一次振蕩的時(shí)間為12個(gè)小時(shí)，一次離心處理的時(shí)間為15分鐘，二次振蕩的時(shí)間為24個(gè)小時(shí)，二次離心處理的時(shí)間為 30分鐘；步驟2)中，向枯草芽孢桿菌Jaas edl無(wú)細(xì)胞濾液中加入的AgNO3為100微升，室溫放置時(shí)間為36個(gè)小時(shí)，離心處理的時(shí)間為50分鐘。
[0019]作為本發(fā)明進(jìn)一步改進(jìn)的技術(shù)方案，在步驟I)中，所述一次振蕩的時(shí)間為24個(gè)小時(shí)，一次離心處理的時(shí)間為15分鐘，二次振蕩的時(shí)間為36個(gè)小時(shí)，二次離心處理的時(shí)間為 30分鐘；步驟2)中，向枯草芽孢桿菌Jaas edl無(wú)細(xì)胞濾液中加入的AgNO3為150微升，室溫放置時(shí)間為24個(gè)小時(shí)，離心處理的時(shí)間為30分鐘。
[0020]作為本發(fā)明進(jìn)一步改進(jìn)的技術(shù)方案，在步驟I)中，所述一次振蕩的時(shí)間為24個(gè)小時(shí)，一次離心處理的時(shí)間為30分鐘，二次振蕩的時(shí)間為36個(gè)小時(shí)，二次離心處理的時(shí)間為 30分鐘；步驟2)中，向枯草芽孢桿菌Jaas edl無(wú)細(xì)胞濾液中加入的AgNO3為200微升，室溫放置時(shí)間為72個(gè)小時(shí),離心處理的時(shí)間為60分鐘。
[0021]本發(fā)明采用枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) Jaas edl無(wú)細(xì)胞濾液,所用枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) Jaas edl菌株為江蘇省農(nóng)科院植保所自棉花莖桿內(nèi)分離保存，經(jīng)鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，于2005年12月12日由中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心收藏保存，保藏號(hào)CGMCC N0.1564。通過(guò)胞外合成納米銀粒子，因此本發(fā)明條件溫和，既簡(jiǎn)便快捷，又經(jīng)濟(jì)環(huán)保，所用試劑環(huán)境友好。為納米銀的綠色合成提供了一種新的思路。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0022]圖1本發(fā)明實(shí)施例1所制備的納米銀粒子的紫外-可見(jiàn)光譜圖。
[0023]圖2本發(fā)明實(shí)施例1所制備的納米銀粒子的透射電鏡掃描圖。
[0024]圖3本發(fā)明實(shí)施例1所制備的納米銀粒子的X射線粉末衍射掃描圖。
[0025]圖4本發(fā)明實(shí)施例1所制備的納米銀粒子的傅里葉變換紅外光譜掃描圖。
[0026]下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作進(jìn)一步說(shuō)明。
【具體實(shí)施方式】
[0027]實(shí)施例1
[0028]本枯草芽孢桿菌Jaas edl無(wú)細(xì)胞濾液胞外合成納米銀粒子的方法，包括以下步驟:
[0029]I)枯草芽孢桿菌Jaas edl無(wú)細(xì)胞濾液的制備:
[0030]—次振蕩培養(yǎng):將枯草芽孢桿菌Jaas edl放入裝有100毫升LB培養(yǎng)基的搖瓶中， 30°C振蕩培養(yǎng)，振蕩培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速為150轉(zhuǎn)/分鐘，時(shí)間為12個(gè)小時(shí)，獲得枯草芽孢桿菌Jaas edl培養(yǎng)液；
[0031]一次離心處理:將經(jīng)過(guò)振蕩培養(yǎng)的枯草芽孢桿菌Jaas edl培養(yǎng)液進(jìn)行離心處理， 離心轉(zhuǎn)速為5000轉(zhuǎn)/分鐘，時(shí)間為30分鐘；
[0032]收集菌體:將經(jīng)過(guò)一次離心處理的枯草芽孢桿菌Jaas edl培養(yǎng)液中的菌體收集， 并將枯草芽孢桿菌Jaas edl菌體用去離子水蕩洗3次，以去除殘留的LB培養(yǎng)基；
[0033]二次振蕩培養(yǎng):將經(jīng)過(guò)上述收集菌體步驟處理后的枯草芽孢桿菌Jaas edl菌體重懸于100毫升去離子水中，30°C二次振蕩培養(yǎng)，二次振蕩培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速為150轉(zhuǎn)/分鐘，時(shí)間為24個(gè)小時(shí)，獲得枯草芽孢桿菌Jaas edl菌體懸液；
[0034]二次離心處理:將上述經(jīng)過(guò)二次振蕩處理的枯草芽孢桿菌Jaas edl菌體懸液進(jìn)行二次離心處理，二次離心處理的轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，時(shí)間為30分鐘，以將枯草芽孢桿菌Jaas edl菌體及其碎片與上清液分離；
[0035]收集上清液:將經(jīng)過(guò)上述二次離心處理后產(chǎn)生的上清液收集，然后將收集的上清液用孔徑為0.22 y m的濾膜過(guò)濾，獲得枯草芽孢桿菌Jaas edl無(wú)細(xì)胞濾液；[0036]2)納米銀粒子的合成與表征:
[0037]首先，取步驟I)中制得的枯草芽孢桿菌Jaas edl無(wú)細(xì)胞濾液100毫升，然后向枯草芽孢桿菌Jaas edl無(wú)細(xì)胞濾液中加入200 u L濃度為lmol/L的AgNO3,并在室溫放置24 個(gè)小時(shí)；接著進(jìn)行離心處理，離心毫升速為15000轉(zhuǎn)/分鐘，時(shí)間為30分鐘；離心結(jié)束后，將沉淀物收集，再將收集的沉淀物用無(wú)水乙醇蕩洗3次，然后將沉淀物在60°C的溫度下烘干成粉末，制得納米銀粒子。
[0038]如圖1、圖2、圖3和圖4所示，用透射電鏡(TEM)觀察本實(shí)施例制得的納米銀粒子， 其中銀納米顆粒的形貌均為近球形，粒徑分布在20-50納米。本實(shí)施例中所用枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) Jaas edl菌株為江蘇省農(nóng)科院植保所自棉花莖桿內(nèi)分離保存，經(jīng)鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis),于2005年12月12日由中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院中科院微生物研究所)收藏保存，保藏號(hào)CGMCC N0.1564。
[0039]實(shí)施例2
[0040]本枯草芽孢桿菌Jaas edl無(wú)細(xì)胞濾液胞外合成納米銀粒子的方法，包括以下步驟:
[0041]I)枯草芽孢桿菌Jaas edl無(wú)細(xì)胞濾液的制備:
[0042]—次振蕩培養(yǎng):將枯草芽孢桿菌Jaas edl放入裝有100毫升LB培養(yǎng)基的搖瓶中， 30°C振蕩培養(yǎng)，振蕩培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速為150轉(zhuǎn)/分鐘，時(shí)間為12個(gè)小時(shí)，獲得枯草芽孢桿菌Jaas edl培養(yǎng)液；
[0043]一次離心處理:將經(jīng)過(guò)振蕩培養(yǎng)的枯草芽孢桿菌Jaas edl培養(yǎng)液進(jìn)行離心處理， 離心轉(zhuǎn)速為5000轉(zhuǎn)/分鐘，時(shí)間為15分鐘；
[0044]收集菌體:將經(jīng)過(guò)一次離心處理的枯草芽孢桿菌Jaas edl培養(yǎng)液中的菌體收集， 并將菌體用去離子水蕩洗3次，以去除殘留的LB培養(yǎng)基；
[0045]二次振蕩培養(yǎng):將經(jīng)過(guò)上述收集菌體步驟處理后的枯草芽孢桿菌Jaas edl菌體重懸于100毫升去離子水中，30°C二次振蕩培養(yǎng)，二次振蕩培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速為150轉(zhuǎn)/分鐘，時(shí)間為24個(gè)小時(shí)，獲得枯草芽孢桿菌Jaas edl菌體懸液；
`[0046]二次離心處理:將上述經(jīng)過(guò)二次振蕩處理的枯草芽孢桿菌Jaas edl菌體懸液進(jìn)行二次離心處理，二次離心處理的轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，時(shí)間為30分鐘，以將枯草芽孢桿菌Jaas edl菌體及其碎片與上清液分離；
[0047]收集上清液:將經(jīng)過(guò)上述二次離心處理后產(chǎn)生的上清液收集，然后將收集的上清液用孔徑為0.22 y m的濾膜過(guò)濾，獲得枯草芽孢桿菌Jaas edl無(wú)細(xì)胞濾液；
[0048]2)納米銀粒子的合成與表征:
[0049]首先，取步驟I)中制得的枯草芽孢桿菌Jaas edl無(wú)細(xì)胞濾液100毫升，加入 100 U I濃度為lmol/L的AgNO3,并在室溫放置36個(gè)小時(shí)；接著進(jìn)行離心處理，離心轉(zhuǎn)速為 15000轉(zhuǎn)/分鐘，時(shí)間為30分鐘；離心結(jié)束后，將沉淀物收集，再將收集的沉淀物用無(wú)水乙醇蕩洗3次，然后將沉淀物在60°C的溫度下烘干成粉末，制得納米銀粒子。
[0050]本實(shí)施例中所用枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) Jaas edl菌株為江蘇省農(nóng)科院植保所自棉花莖桿內(nèi)分離保存，經(jīng)鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，于2005 年12月12日由中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心收藏保存，保藏號(hào)CGMCCN0.1564。
[0051]實(shí)施例3
[0052]本枯草芽孢桿菌Jaas edl無(wú)細(xì)胞濾液胞外合成納米銀粒子的方法，包括以下步驟:
[0053]I)枯草芽孢桿菌Jaas edl無(wú)細(xì)胞濾液的制備:
[0054]—次振蕩培養(yǎng):將枯草芽孢桿菌Jaas edl放入裝有100毫升LB培養(yǎng)基的搖瓶中， 并置于30°C溫度，然后進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，振蕩培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速為150轉(zhuǎn)/分鐘，時(shí)間為24個(gè)小時(shí)， 獲得枯草芽孢桿菌Jaas edl培養(yǎng)液；
[0055]一次離心處理:將經(jīng)過(guò)振蕩培養(yǎng)的枯草芽孢桿菌Jaas edl培養(yǎng)液進(jìn)行離心處理， 離心轉(zhuǎn)速為5000轉(zhuǎn)/分鐘，時(shí)間為15分鐘；
[0056]收集菌體:將經(jīng)過(guò)一次離心處理的枯草芽孢桿菌Jaas edl培養(yǎng)液中的菌體收集， 并將枯草芽孢桿菌Jaas edl菌體用去離子水蕩洗3次，以去除殘留的LB培養(yǎng)基；
[0057]二次振蕩培養(yǎng) :將經(jīng)過(guò)上述收集菌體步驟處理后的枯草芽孢桿菌Jaas edl菌體重懸于100毫升去離子水中，30°C二次振蕩培養(yǎng)，二次振蕩培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速為150轉(zhuǎn)/分鐘，時(shí)間為36個(gè)小時(shí)，獲得枯草芽孢桿菌Jaas edl菌體懸液；
[0058]二次離心處理:將上述經(jīng)過(guò)二次振蕩處理的枯草芽孢桿菌Jaas edl菌體懸液進(jìn)行二次離心處理，二次離心處理的轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，時(shí)間為30分鐘，以將枯草芽孢桿菌Jaas edl菌體及其碎片與上清液分離；
[0059]收集上清液:將經(jīng)過(guò)上述二次離心處理后產(chǎn)生的上清液收集，然后將收集的上清液用孔徑為0.22 y m的濾膜過(guò)濾，獲得枯草芽孢桿菌Jaas edl無(wú)細(xì)胞濾液；
[0060]2)納米銀粒子的合成與表征:
[0061]首先，取步驟I)中制得的枯草芽孢桿菌Jaas edl無(wú)細(xì)胞濾液100毫升，然后向枯草芽孢桿菌Jaas edl無(wú)細(xì)胞濾液中加入150 U I濃度為lmol/L的AgNO3,并在室溫放置24 個(gè)小時(shí)；接著進(jìn)行離心處理，離心轉(zhuǎn)速為15000轉(zhuǎn)/分鐘，時(shí)間為30分鐘；離心結(jié)束后，將沉淀物收集，再將收集的沉淀物用無(wú)水乙醇蕩洗3次，然后將沉淀物在60°C的溫度下烘干成粉末，制得納米銀粒子。
[0062]本實(shí)施例中所用枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) Jaas edl菌株為江蘇省農(nóng)科院植保所自棉花莖桿內(nèi)分離保存，經(jīng)鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，于2005 年12月12日由中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心收藏保存，保藏號(hào)CGMCC N0.1564。
[0063]實(shí)施例4
[0064]本枯草芽孢桿菌Jaas edl無(wú)細(xì)胞濾液胞外合成納米銀粒子的方法，包括以下步驟:
[0065]I)枯草芽孢桿菌Jaas edl無(wú)細(xì)胞濾液的制備:
[0066]—次振蕩培養(yǎng):將枯草芽孢桿菌Jaas edl放入裝有100毫升LB培養(yǎng)基的搖瓶中， 30°C振蕩培養(yǎng)，振蕩培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速為150轉(zhuǎn)/分鐘，時(shí)間為24個(gè)小時(shí)，獲得枯草芽孢桿菌Jaas edl培養(yǎng)液；
[0067]一次離心處理:將經(jīng)過(guò)振蕩培養(yǎng)的枯草芽孢桿菌Jaas edl培養(yǎng)液進(jìn)行離心處理， 離心轉(zhuǎn)速為5000轉(zhuǎn)/分鐘，時(shí)間為30分鐘；[0068]收集菌體:將經(jīng)過(guò)一次離心處理的枯草芽孢桿菌Jaas edl培養(yǎng)液中的菌體收集， 并將枯草芽孢桿菌Jaas edl菌體用去離子水蕩洗3次，以去除殘留的LB培養(yǎng)基；
[0069]二次振蕩培養(yǎng):將經(jīng)過(guò)上述收集菌體步驟處理后的枯草芽孢桿菌Jaas edl菌體重懸于100毫升去離子水中，30°C二次振蕩培養(yǎng)，二次振蕩培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速為150轉(zhuǎn)/分鐘，時(shí)間為36個(gè)小時(shí)，獲得枯草芽孢桿菌Jaas edl菌體懸液；
[0070]二次離心處理:將上述經(jīng)過(guò)二次振蕩處理的枯草芽孢桿菌Jaas edl菌體懸液進(jìn)行二次離心處理，二次離心處理的轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，時(shí)間為30分鐘，以將枯草芽孢桿菌Jaas edl菌體及其碎片與上清液分離；
[0071]收集上清液:將經(jīng)過(guò)上述二次離心處理后產(chǎn)生的上清液收集，然后將收集的上清液用孔徑為0.22 y m的濾膜過(guò)濾，獲得枯草芽孢桿菌Jaas edl無(wú)細(xì)胞濾液；
[0072]2)納米銀粒子的合成與表征:
[0073]首先，取步驟I)中制得的枯草芽孢桿菌Jaas edl無(wú)細(xì)胞濾液200毫升，加入 150 u I濃度為lmol/L的AgNO3,并在室溫放置72個(gè)小時(shí)；接著進(jìn)行離心處理，離心轉(zhuǎn)速為 15000轉(zhuǎn)/分鐘，時(shí)間為60分鐘；離心結(jié)束后，將沉淀物收集，再將收集的沉淀物用無(wú)水乙醇蕩洗3次，然后將沉淀物在60°C的溫度下烘干成粉末，制得納米銀粒子。
[0074]本實(shí)施例中所用枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) Jaas edl菌株為江蘇省農(nóng)科院植保所自棉花莖桿內(nèi)分離保存，經(jīng)鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，于2005 年12月12日由中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心收藏保存，保藏號(hào)CGMCC N0.1564。`
【權(quán)利要求】
1.一種枯草芽孢桿菌Jaas edl無(wú)細(xì)胞濾液胞外合成納米銀粒子的方法，包括以下步驟:1)枯草芽孢桿菌Jaasedl無(wú)細(xì)胞濾液的制備:一次振蕩培養(yǎng):將枯草芽孢桿菌Jaas edl放入裝有100毫升LB培養(yǎng)基的搖瓶中，30°C 振蕩培養(yǎng)，振蕩培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為150轉(zhuǎn)/分鐘，時(shí)間為12-24個(gè)小時(shí)，獲得枯草芽孢桿菌Jaas edl培養(yǎng)液；一次離心處理:將經(jīng)過(guò)振蕩培養(yǎng)的枯草芽孢桿菌Jaas edl培養(yǎng)液進(jìn)行離心處理，離心轉(zhuǎn)速為5000轉(zhuǎn)/分鐘，時(shí)間為15-30分鐘；收集菌體:將經(jīng)過(guò)一次離心處理的枯草芽孢桿菌Jaas edl培養(yǎng)液中的菌體收集,并將枯草芽孢桿菌Jaas edl菌體用去離子水蕩洗3次，以去除殘留的LB培養(yǎng)基；二次振蕩培養(yǎng):將經(jīng)過(guò)上述收集菌體步驟處理后的枯草芽孢桿菌Jaas edl菌體重懸于100毫升去離子水中，并置于30°C的溫度下，二次振蕩培養(yǎng)，二次振蕩培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速為150 轉(zhuǎn)/分鐘，時(shí)間為12-36個(gè)小時(shí)，獲得枯草芽孢桿菌Jaas edl菌體懸液；二次離心處理:將上述經(jīng)過(guò)二次振蕩處理的枯草芽孢桿菌Jaas edl菌體懸液進(jìn)行二次離心處理，二次離心處理的轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，時(shí)間為15-30分鐘，以將枯草芽孢桿菌Jaas edl菌體及其碎片與上清液分離；收集上清液:將經(jīng)過(guò)上述二次離心處理后產(chǎn)生的上清液收集，用孔徑為0.22 的濾膜過(guò)濾，獲得枯草芽孢桿菌Jaas edl無(wú)細(xì)胞濾液；2)納米銀粒子的合成與表征:首先，取步驟I)中制得的枯草芽孢桿菌Jaas edl無(wú)細(xì)胞濾液100毫升，加入 100-200 u I濃度為lmol/L的AgNO3,并在室溫放置24-72個(gè)小時(shí)；接著進(jìn)行離心處理，轉(zhuǎn)速為15000轉(zhuǎn)/分鐘，時(shí)間為30-60分鐘；離心結(jié)束后，將沉淀物收集，再將收集的沉淀物用無(wú)水乙醇蕩洗3`次，在60°C的溫度下烘干成粉末，制得納米銀粒子。經(jīng)紫外/可見(jiàn)光分光光度計(jì)全波長(zhǎng)掃描(UV-vis)、透射電子顯微鏡掃描(TEM)、X射線粉末衍射分析(XRD)、傅里葉變換紅外光譜分析(FT-1R)等方法驗(yàn)證所合成的納米銀粒子形態(tài)均一，分散性較好。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌Jaasedl無(wú)細(xì)胞濾液胞外合成納米銀粒子的方法，其特征在于:在步驟2)，枯草芽孢桿菌Jaas edl無(wú)細(xì)胞濾液與AgNO3體積比為I毫升:1_2微升。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌Jaasedl無(wú)細(xì)胞濾液胞外合成納米銀粒子的方法，其特征在于:所述銀納米粒子的粒徑在20-50納米之間。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的枯草芽孢桿菌Jaasedl無(wú)細(xì)胞濾液胞外合成納米銀粒子的方法，其特征在于:步驟I)中，所述一次振蕩的時(shí)間為12個(gè)小時(shí)，一次離心處理的時(shí)間為15分鐘，二次振蕩的時(shí)間為12個(gè)小時(shí)，二次離心處理的時(shí)間為30分鐘；步驟2)中， 向枯草芽孢桿菌Jaas edl無(wú)細(xì)胞濾液中加入的AgNO3為200微升，離心處理的時(shí)間為30分鐘。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的枯草芽孢桿菌Jaasedl無(wú)細(xì)胞濾液胞外合成納米銀粒子的方法，其特征在于:步驟I)中，所述一次振蕩的時(shí)間為12個(gè)小時(shí)，一次離心處理的時(shí)間為15分鐘，二次振蕩的時(shí)間為24個(gè)小時(shí)，二次離心處理的時(shí)間為30分鐘；步驟2)中， 向枯草芽孢桿菌Jaas edl無(wú)細(xì)胞濾液中加入的AgNO3為100微升，室溫放置時(shí)間為36個(gè)小時(shí)，離心處理的時(shí)間為50分鐘。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的枯草芽孢桿菌Jaasedl無(wú)細(xì)胞濾液胞外合成納米銀粒子的方法，其特征在于:步驟I)中，所述一次振蕩的時(shí)間為24個(gè)小時(shí)，一次離心處理的時(shí)間為15分鐘，二次振蕩的時(shí)間為36個(gè)小時(shí)，二次離心處理的時(shí)間為30分鐘；步驟2)中， 向枯草芽孢桿菌Jaas edl無(wú)細(xì)胞濾液中加入的AgN03為150微升，室溫放置時(shí)間為24個(gè)小時(shí)，離心處理的時(shí)間為30分鐘。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的枯草芽孢桿菌Jaasedl無(wú)細(xì)胞濾液胞外合成納米銀粒子的方法，其特征在于:步驟I)中，所述一次振蕩的時(shí)間為24個(gè)小時(shí)，一次離心處理的時(shí)間為30分鐘，二次振蕩的時(shí)間為36個(gè)小時(shí)，二次離心處理的時(shí)間為30分鐘；步驟2)中， 向枯草芽孢桿菌Jaas edl無(wú)細(xì)胞濾 液中加入的AgNO3為200微升，室溫放置時(shí)間為72個(gè)小時(shí)，離心處理的時(shí)間為60分鐘。
【文檔編號(hào)】C12R1/125GK103555769SQ201310163716
【公開(kāi)日】2014年2月5日 申請(qǐng)日期:2013年5月7日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月7日
【發(fā)明者】張昕, 林玲, 鄧晟, 周益軍 申請(qǐng)人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院