專利名稱：鑒定大蔥細(xì)胞質(zhì)育性的方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，具體而言，涉及鑒定大蔥細(xì)胞質(zhì)育性的方法及試劑盒。
背景技術(shù)：
大蔥(Alliumfistulosum L.var.giganteum Makino)屬于兩年生草本植物，完成一個(gè)生命周期約需兩年時(shí)間，且大蔥花器小，單花結(jié)籽率低，人工去雄成本高，因而利用傳統(tǒng)方法選育大蔥雜交種，周期長(zhǎng)，效率低，這也是目前限制大蔥雜交種選育的重要原因。大蔥自然雄性不育株率較高，其不育性可以遺傳，可用于大蔥雜交育種(張啟沛，1987 ;馬上武彥，1985)。因此，利用雄性不育系進(jìn)行大蔥雜交種的研制，是一種行之有效的途徑，然而在利用雄性不育系選育雜交種的過程中，保持系的選育工作又成為雜交育種亟需解決的關(guān)鍵問題之一。利用分子標(biāo)記輔助選擇體系進(jìn)行保持系輔助選擇不受環(huán)境條件的限制，可實(shí)現(xiàn)苗期選擇，減少工作量，加快育種進(jìn)程。大蔥細(xì)胞質(zhì)育性分子標(biāo)記的開發(fā)工作，不僅成為利用分子標(biāo)記輔助育種的前提，也是建立新型的大蔥雜交育種選擇體系的重中之重。但是，對(duì)于大蔥雄性不育分子標(biāo)記輔助育種的研究卻鮮見報(bào)道，無可供借鑒的成熟技術(shù)。為加快大蔥雄性不育系選育進(jìn)程，蓋樹鵬以章丘大蔥不育系與保持系為材料，對(duì)大蔥細(xì)胞質(zhì)線粒體DNA進(jìn)行了 RAH)標(biāo)記，并成功獲得了兩個(gè)能夠鑒定部分大蔥品種細(xì)胞質(zhì)育性的RAPD標(biāo)記，并將其中一個(gè)RAPD標(biāo)記成功轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記，現(xiàn)有技術(shù)報(bào)道了該片段大小約為2800bp，兩端序列已公開，但中間片段未見報(bào)道。另一方面，提取線粒體DNA的復(fù)雜性也限制了這一標(biāo)記的廣泛應(yīng)用。另外，此標(biāo)記為S型細(xì)胞質(zhì)特異標(biāo)記，只能夠進(jìn)行單株選擇，而不能進(jìn)行群體選擇。植物育種中分子標(biāo)記輔助選擇是通過分析與目標(biāo)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記來判斷目標(biāo)基因是否存在的。通過不同分子標(biāo)記技術(shù)的分析可篩選出與目標(biāo)基因性狀緊密連鎖的DNA片段，這樣可以作為輔助育種的分子標(biāo)記。應(yīng)用這些分子標(biāo)記進(jìn)行苗期選擇，將得到事半功倍的作用，因?yàn)榉肿訕?biāo)記輔助選擇不受植物生長(zhǎng)發(fā)育的時(shí)期及環(huán)境的影響，不存在表達(dá)與否的問題。無論是與·細(xì)胞質(zhì)位點(diǎn)還是與核基因連鎖的標(biāo)記的輔助選擇都可減少工作量，提高育種效率。我們?cè)诤Y選保持系時(shí)，一般只需要將100株或者50株混合提取總DNA樣品進(jìn)行簡(jiǎn)單PCR擴(kuò)增，若只出現(xiàn)N型標(biāo)記，說明此群體中都是N型細(xì)胞質(zhì)類型，若既有N型標(biāo)記，也有S型標(biāo)記，說明此群體含有兩種類型的細(xì)胞質(zhì)，然后依次縮小群體范圍；若只出現(xiàn)S型標(biāo)記，即使耗費(fèi)再多的時(shí)間和精力，也不可能得到保持系。因此S/N共顯性標(biāo)記能節(jié)省大量的人力和財(cái)力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種鑒定大蔥細(xì)胞質(zhì)育性的方法，其特征在于包括如下步驟:(I)提取待鑒定大蔥基因組DNA(2)采用如下引物擴(kuò)增大蔥基因組DNA:正向引物:5'TAATGGAGGCGGTCTTCGTG3;
反向引物:5'TAGGCTTTGGTATTTGTTGC3'；(3)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物多態(tài)性，在自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)上觀察擴(kuò)增產(chǎn)物的片段長(zhǎng)度，根據(jù)片段長(zhǎng)度判斷大蔥細(xì)胞質(zhì)育性。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，采用CTAB法提取大蔥基因組DNA ；在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述的片段長(zhǎng)度通過凝膠電泳和/或測(cè)序的方法進(jìn)行。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，進(jìn)行群體鑒定:例如將50-100株混合提取總DNA進(jìn)行簡(jiǎn)單PCR擴(kuò)增，若只出現(xiàn)327bp的片段，說明此群體中都是N型細(xì)胞質(zhì)類型，若只出現(xiàn)1412bp的片段，說明此群體中都是S型細(xì)胞質(zhì)類型；若同時(shí)出現(xiàn)327bp的片段和1412bp的片段，說明此群體含有兩種類型的細(xì)胞質(zhì)，依次縮小群體范圍繼續(xù)鑒定。本發(fā)明另一方面涉及一種鑒定大蔥細(xì)胞質(zhì)育性的試劑盒，其特征在于包括如下引物:正向引物:5'TAATGGAGGCGGTCTTCGTG3;反向引物:5'TAGGCTTTGGTATTTGTTGC3'。本發(fā)明獲得了鑒別大蔥細(xì)胞質(zhì)育性相關(guān)基因的一個(gè)穩(wěn)定SCAR共顯性標(biāo)記。本發(fā)明的大蔥細(xì)胞質(zhì)育性鑒定的SCAR共顯性標(biāo)記在大蔥不育系的相應(yīng)保持系的選育中具有廣泛應(yīng)用，可以進(jìn)行群體選擇，極大地節(jié)約了人力物力和財(cái)力，提高大蔥雜交育種效率。本發(fā)明的優(yōu) 點(diǎn)是:(I)標(biāo)記穩(wěn)定:對(duì)已知育性的14份材料(148個(gè)單株)進(jìn)行廣泛的驗(yàn)證，其分子標(biāo)記鑒定結(jié)果與表現(xiàn)型和遺傳分析結(jié)果完全一致。原有報(bào)道的線粒體DNA的PCR擴(kuò)增得到的2800bp片段的分子標(biāo)記不能在廣泛的大蔥材料中應(yīng)用，應(yīng)用范圍較窄；
(2)分子標(biāo)記輔助選擇操作簡(jiǎn)單，節(jié)約成本和時(shí)間，大蔥是兩年生草本植物，育種年限長(zhǎng)，采用常規(guī)選育方法，周期長(zhǎng)，成本高，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。通過本發(fā)明，只需簡(jiǎn)單提取大蔥總DNA進(jìn)行簡(jiǎn)單PCR擴(kuò)增，然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，即可有效的鑒定細(xì)胞質(zhì)的育性。不僅避免了常規(guī)方法繁瑣的篩選過程，還避免了提取線粒體DNA的復(fù)雜操作，使操作過程更簡(jiǎn)單有效。(3)可以進(jìn)行群體選擇:在篩選保持系時(shí)，一般只需要將100株或者50株混合提取總DNA進(jìn)行簡(jiǎn)單PCR擴(kuò)增，若只出現(xiàn)N型標(biāo)記，說明此群體中都是N型細(xì)胞質(zhì)類型，若既有N型標(biāo)記，也有S型標(biāo)記，說明此群體含有兩種類型的細(xì)胞質(zhì)，然后依次縮小群體范圍；若只出現(xiàn)S型標(biāo)記，即使耗費(fèi)再多的時(shí)間和精力，也不可能得到保持系。而原有的S型標(biāo)記的缺點(diǎn)在于無法進(jìn)行群體選擇，100株或者50株個(gè)體中，只要有一株S型細(xì)胞質(zhì)的大蔥，就無法判斷有無N型細(xì)胞質(zhì)類型的大蔥單株。因此S/N共顯性標(biāo)記能節(jié)省大量的人力和財(cái)力。


圖1:S327N1412弓丨物在S/N細(xì)胞質(zhì)基因池中的擴(kuò)增結(jié)果其中:M為DM2000的Marker，S為細(xì)胞質(zhì)雄性不育基因池，N為細(xì)胞質(zhì)雄性可育基因池。圖2SCAR共顯性標(biāo)記在980238A/B單株上的驗(yàn)證結(jié)果其中:M為DM2000的Marker，1-10為細(xì)胞質(zhì)雄性不育單株，11-20為細(xì)胞質(zhì)雄性可
育單株。
具體實(shí)施例方式具體實(shí)施方法(一 )材料與方法1、DNA的提取與檢測(cè)、基因池的建立大蔥材料總DNA提取方法采用北京天根生化科技有限公司生產(chǎn)的快捷型植物基因組提取試劑盒，提取方法參照說明書。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的濃度和質(zhì)量。隨機(jī)選取10株不育系980238A和10株保持系980238B，將其DNA分別等量混合，構(gòu)建S型細(xì)胞質(zhì)基因池和N型細(xì)胞質(zhì)基因池。2、特異條帶的回收純化、克隆、測(cè)序及SCAR標(biāo)記引物的設(shè)計(jì)與合成利用已報(bào)道的大蔥S型細(xì)胞質(zhì)特異片段設(shè)計(jì)引物，對(duì)大蔥細(xì)胞質(zhì)雄性不育系g80238A及其相應(yīng)的保持系980238B的總DNA進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)所得片段按照北京康為世紀(jì)生物科技有限公 司的Gel Extraction Kit使用說明進(jìn)行特異條帶回收純化；按照北京天根生化科技有限公司生產(chǎn)的P GM- T克隆試劑盒說明進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化、鑒定；DNA序列測(cè)定委托北京博尚生物技術(shù)有限公司完成。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，應(yīng)用PrimerPremier5.0開發(fā)了 S、N共顯性標(biāo)記(正向引物:5' TAATGGAGGCGGTCTTCGTG3'反向引物:
TAGGCTTTGGTATTTGTTGC3;)。由北京博尚生物技術(shù)有限公司合成，PAGE純化。3、PCR反應(yīng)與檢測(cè)利用S327N1412標(biāo)記對(duì)大蔥S型細(xì)胞質(zhì)基因池和N型細(xì)胞質(zhì)基因池在美國伯樂TC-XP-D型基因擴(kuò)增儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增。20μ L體系，其中2XTaq MasterMixlO μ L，兩條引物(10 μ mo 1.1/1)各 1.0 μ L，樣品 DNA50ng，反應(yīng)程序?yàn)?94°C 預(yù)變性 2min, [94°C 變性 30s，55°C退火lmin，72°C延伸lmin]，35個(gè)循環(huán)，72°C延伸5min，4°C保存；利用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物多態(tài)性，溴化乙啶染色，凝膠成像系統(tǒng)自動(dòng)成像。4、單株驗(yàn)證將S327N1412標(biāo)記首先在980238A/B材料中進(jìn)行單株驗(yàn)證。隨機(jī)抽取10株不育系和10株保持系，分別提取總DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增與檢測(cè)。5、在大蔥不育系、保持系以及雜交組合中的驗(yàn)證將S327N1412標(biāo)記應(yīng)用于大蔥雄性不育系與保持系980128A/B、200501A/B ;河南省新鄉(xiāng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供的大蔥雄性不育系與保持系08-9A/B ;遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所提供的大蔥雄性不育系與保持系244A/B以及雜交組合材料RSXZQ、RSXLY、RSXDZ與RS X RB中。每份材料隨機(jī)取10-12株，分別提取總DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增與檢測(cè)。( 二 )結(jié)果與分析I大蔥材料基因組DNA的檢測(cè)分析采用北京天根生化科技有限公司生產(chǎn)的快捷型植物基因組提取試劑盒提取大蔥植株基因組總DNA的結(jié)果表明，所提取的DNA溶液清亮，無褐化現(xiàn)象。0.8%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，DNA帶位于同一位置，且清晰、無彌散、無明顯降解。所以，所提DNA適用于PCR擴(kuò)+
日O2PCR擴(kuò)增結(jié)果根據(jù)已經(jīng)報(bào)道的大蔥S型細(xì)胞質(zhì)特異片段設(shè)計(jì)引物(SCS13L:5' CCCCGCTACCTAGGCAACCTTT3'和 SCS13R: 5' CGATGAGGAAGGAGAACTCCGA3')，對(duì)大蔥細(xì)胞質(zhì)雄性不育系980238A及其相應(yīng)的保持系980238B的總DNA進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)所得片段進(jìn)行測(cè)序，根據(jù)測(cè)序結(jié)果，應(yīng)用Premierf.0本發(fā)明人從中設(shè)計(jì)出一對(duì)SCAR標(biāo)記引物，正向引物:5' TAATGGAGGCGGTCTTCGTG3 '反向引物:5' TAGGCTTTGGTATTTGTTGC3 '。應(yīng)用這對(duì)引物對(duì)大蔥細(xì)胞質(zhì)雄性不育系980238A及其相應(yīng)的保持系980238B的基因池為模版進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果見圖1，圖中可以清晰地看到，在不育系980238A基因池中擴(kuò)增出一條大小為327bp的片段，在相應(yīng)的保持系980238B基因池中擴(kuò)增出一條1412bp的片段。3大蔥不育系、保持系以及雜交組合中的驗(yàn)證對(duì)已知細(xì)胞質(zhì)育性的14份材料進(jìn)行PCR驗(yàn)證(見表I)，所有的不育系材料中均擴(kuò)增出大小為327bp的片段，所有的保持系均擴(kuò)增出一條1412bp的片段(圖2)，雜交組合也擴(kuò)增出1412bp片段，PCR結(jié)果與遺傳分析結(jié)果一致，說明這對(duì)引物完全可以鑒別大蔥S/N細(xì)胞質(zhì)類型。表I大蔥不育系、保持系和雜交組合單株驗(yàn)證結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種鑒定大蔥細(xì)胞質(zhì)育性的方法，其特征在于包括如下步驟: (1)提取待鑒定大蔥基因組DNA； (2)采用如下引物擴(kuò)增大蔥基因組DNA: 正向引物:5' TAATGGAGGCGGTCTTCGTG3' 反向引物:5' TAGGCTTTGGTATTTGTTGC3'； (3)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物多態(tài)性，在自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)上觀察擴(kuò)增產(chǎn)物的片段長(zhǎng)度，根據(jù)片段長(zhǎng)度判斷大蔥細(xì)胞質(zhì)育性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于采用CTAB法提取大蔥基因組DNA。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的片段長(zhǎng)度通過PCR擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠電泳和凝膠成像系統(tǒng)自動(dòng)成像的方法進(jìn)行。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于進(jìn)行群體鑒定:例如將50-100株混合提取總DNA進(jìn)行簡(jiǎn)單PCR擴(kuò)增，若只出現(xiàn)327bp的片段，說明此群體中都是N型細(xì)胞質(zhì)類型，若只出現(xiàn)1412bp的片段，說明此群體中都是S型細(xì)胞質(zhì)類型；若同時(shí)出現(xiàn)327bp的片段和1412bp的片段，說明此群體含有兩種類型的細(xì)胞質(zhì)，依次縮小群體范圍繼續(xù)鑒定。
5.鑒定大蔥細(xì)胞質(zhì) 育性的試劑盒，其特征在于包括如下引物: 正向引物:5' TAATGGAGGCGGTCTTCGTG3' 反向引物:5' TAGGCTTTGGTATTTGTTGC3'； 以及DNA提取試劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種鑒定大蔥細(xì)胞質(zhì)育性的方法及其試劑盒，所述的方法包括如下步驟(1)提取待鑒定大蔥基因組DNA(2)采用如下引物擴(kuò)增大蔥基因組DNA正向引物5′TAATGGAGGCGGTCTTCGTG3′反向引物5′TAGGCTTTGGTATTTGTTGC3′；(3)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物多態(tài)性，在自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)上觀察擴(kuò)增產(chǎn)物的片段長(zhǎng)度，根據(jù)片段長(zhǎng)度判斷大蔥細(xì)胞質(zhì)育性。本發(fā)明的大蔥細(xì)胞質(zhì)育性鑒定的SCAR共顯性標(biāo)記在大蔥不育系的相應(yīng)保持系的選育中具有廣泛應(yīng)用，可以進(jìn)行群體選擇，極大地節(jié)約了人力物力和財(cái)力，提高大蔥雜交育種效率。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103243162SQ20131016801
公開日2013年8月14日 申請(qǐng)日期2013年5月9日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月9日
發(fā)明者高莉敏, 陳運(yùn)起, 霍雨猛, 董飛, 孔素萍, 陳偉 申請(qǐng)人:山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所