專利名稱：一組環(huán)狀糊精葡糖基轉(zhuǎn)移酶及其編碼基因和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一組環(huán)狀糊精葡糖基轉(zhuǎn)移酶及其編碼基因和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
環(huán)狀糊精的英文為cyclodextrin，簡(jiǎn)稱⑶。環(huán)糊精是環(huán)糊精轉(zhuǎn)葡萄糖基酶(CGTase)作用于淀粉的產(chǎn)物，是六個(gè)以上葡萄糖以α — 1，4一糖苷鍵連結(jié)的環(huán)狀寡聚糖，其中最常見(jiàn)、研究最多的是<1-環(huán)糊精((1-^)、0-環(huán)糊精(0_00)、Y _環(huán)糊精(Y -⑶)，分別由六個(gè)、七個(gè)和八個(gè)葡萄糖分子構(gòu)成，是相對(duì)大和相對(duì)柔性的分子。環(huán)糊精的生成,主要是以淀粉為原料,經(jīng)過(guò)環(huán)狀糊精葡糖基轉(zhuǎn)移酶(cyclodextringlucano-transferase簡(jiǎn)稱CGTases)的糖基轉(zhuǎn)化作用而來(lái)。CGTases的專一性較低，在大多數(shù)情況下同時(shí)產(chǎn)生Y-⑶三種產(chǎn)物。采用不同的CGTases產(chǎn)生的三種產(chǎn)物比例不同，現(xiàn)有的CGTases的主要轉(zhuǎn)化產(chǎn)物是β _⑶，同時(shí)也產(chǎn)生一定量的α-和Υ-⑶?，F(xiàn)有的研究方向主要是兩個(gè)方面:其一是從自然資源中尋求催化效果更好或?qū)Ｒ恍愿叩拿?；其二是?duì)現(xiàn)有的酶蛋白進(jìn)行定向改造從而獲得催化效果更好或?qū)Ｒ恍愿叩拿?。?-環(huán)狀糊精為淀粉深加工的一類高值化產(chǎn)品，由六個(gè)葡萄糖基通過(guò)α _1，4葡萄糖苷鍵連接而成的環(huán)狀低聚糖。在結(jié)構(gòu)上，α-⑶的立體結(jié)構(gòu)呈圓筒形(一端大，一端小)，具有“外親水，內(nèi)疏水”的特殊性及無(wú)毒的優(yōu)良性能，可與多種客體化合物采用適當(dāng)方法進(jìn)行包結(jié)，從而改變被包結(jié)物質(zhì)的溶解度、揮發(fā)性及化學(xué)反應(yīng)性能等理化性質(zhì)，提供一些非常有用的功能。α-CD在食品工業(yè)有如下應(yīng)用前景:(1)將水不溶性或溶解度低的化合物制成水溶解度高的包封化合物；(2)使包封的化合物具有良好的穩(wěn)定性(如保色、保香，耐熱、耐酸、耐水解、抗氧化、防揮發(fā)等);(3)屏蔽作用(掩蓋食品中不愉快氣味和苦味)；(4)除去食品中不需要的成分(如咖啡因、膽固醇等)；(5)具有乳化、發(fā)泡作用，可作乳化劑和發(fā)泡劑；
(6)使液體狀、油狀、揮發(fā)性物料固化。目前，a-CD開(kāi)發(fā)和應(yīng)用的最大障礙是缺乏具有高a -環(huán)糊精轉(zhuǎn)化活力的酶制劑，使得該產(chǎn)品的成本和價(jià)格高出β -CD的三倍，限制了其大規(guī)模應(yīng)用。在三種環(huán)糊精中，β -環(huán)糊精應(yīng) 用最為廣泛。β -環(huán)糊精(β -Cyclodextyin)是由7個(gè)葡萄糖分子連續(xù)成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)化合物，主體構(gòu)型像個(gè)中間有空洞，兩端不封閉的筒。在空洞結(jié)構(gòu)中，空腔內(nèi)由于受到C-H鍵的屏蔽作用形成了疏水區(qū)。較大開(kāi)口端(上端)由C2和C3的仲羥基構(gòu)成，較小開(kāi)口端(下端)由C6的伯羥基構(gòu)成，具有親水性。有較好的熱穩(wěn)定性，加熱到約200°C開(kāi)始分解。由于其無(wú)還原端，沒(méi)有還原性；容易形成各種穩(wěn)定的水合物，無(wú)吸濕性；能在醇及水溶液中很好地結(jié)晶。可以將環(huán)糊精交鏈于聚合物上以環(huán)糊精為單體進(jìn)行聚合或?qū)⒐倌軋F(tuán)交鏈于環(huán)糊精分子上進(jìn)行化學(xué)改性。利用這個(gè)特殊的筒結(jié)構(gòu)，環(huán)糊精可與許多無(wú)機(jī)、有機(jī)分子結(jié)合成主客體包合物，并能改變被包合物的化學(xué)和物理性質(zhì)，具有保護(hù)、穩(wěn)定、增溶客體分子和選擇性定向分子的特性，因而在食品、環(huán)境、醫(yī)藥、高分子合成、化妝用品、化學(xué)檢測(cè)等方面都有廣泛的應(yīng)用。Y-環(huán)糊精具有比環(huán)糊精更大的空腔，所以空腔可包合的客體分子范圍更廣。Y-環(huán)糊精具有比β_環(huán)糊精更好的水溶性，室溫25°C時(shí)Y-環(huán)糊精溶解度為25.6g/100ml,而α -環(huán)糊精溶解度為12.7g/100ml水，β -環(huán)糊精溶解度則只有1.88g/100ml水。Y-環(huán)糊精應(yīng)用前景比β _環(huán)糊精更為廣闊，但目前由于生產(chǎn)規(guī)模較小，所以價(jià)格較高，限制了 Y-環(huán)糊精的生產(chǎn)和應(yīng)用。3種環(huán)糊精中，Y-環(huán)糊精內(nèi)腔最大，具有更廣泛的包埋客體分子的能力，并且其較高的水溶性、突出的乳化特性和安全性，使其在食品、制藥和化妝品等領(lǐng)域具有很大的應(yīng)用空間。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一組環(huán)狀糊精葡糖基轉(zhuǎn)移酶及其編碼基因和應(yīng)用。本發(fā)明提供的環(huán)狀糊精葡糖基轉(zhuǎn)移酶，是將序列表的序列I所示蛋白質(zhì)進(jìn)行如下(a)和(b)兩個(gè)突變得到的蛋白質(zhì):(a)將序列表的序列I自N末端第167位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)榻M氨酸；(b)將序列表的序列I自N末端第195位氨基酸殘基進(jìn)行突變。所述(b)中，所述突變可為如下(I)至(16)中的任意一種:(I)將序列表的序列I自N末端第195位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)榫彼幔?2)將序列表的序列I自N末端第195位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)橘嚢彼幔?3)將序列表的序列I自N末端第195位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)榱涟彼幔?4)將序列表的序列I自N末端第195位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)槔i氨酸；(5)將序列表的序·列I自N末端第195位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)楫惲涟彼幔?6)將序列表的序列I自N末端第195位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)樘於０罚?7)將序列表的序列I自N末端第195位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)榻z氨酸；(8)將序列表的序列I自N末端第195位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)榘腚装彼幔?9)將序列表的序列I自N末端第195位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)楦拾彼幔?10)將序列表的序列I自N末端第195位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)楣劝彼幔?11)將序列表的序列I自N末端第195位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)樯彼幔?12)將序列表的序列I自N末端第195位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)樘於彼幔?13)將序列表的序列I自N末端第195位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)榻M氨酸；(14)將序列表的序列I自N末端第195位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)楦彼幔?15)將序列表的序列I自N末端第195位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)榧琢虬彼幔?16)將序列表的序列I自N末端第195位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)楸奖彼?。上述突變?nèi)鐭o(wú)特殊說(shuō)明，均為單個(gè)氨基酸殘基。編碼所述蛋白質(zhì)的基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述基因可為將序列表的序列2所示蛋白質(zhì)進(jìn)行如下(C)和(d)兩個(gè)突變得到的DNA分子:(c)將序列表的序列2自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突變?yōu)镃AC ；(d)將序列表的序列2自5’末端第583-585位核苷酸進(jìn)行突變。所述(d)中的所述突變可為如下(I)至(16)中的任意一種:(I)將序列表的序列2自5’末端第583-585位核苷酸由TAC突變?yōu)镃GC ；(2)將序列表的序列2自5’末端第583-585位核苷酸由TAC突變?yōu)锳AA ；
(3)將序列表的序列2自5’末端第583-585位核苷酸由TAC突變?yōu)镃TA ；(4)將序列表的序列2自5’末端第583-585位核苷酸由TAC突變?yōu)镚TA ；(5)將序列表的序列2自5’末端第583-585位核苷酸由TAC突變?yōu)锳TA ；(6)將序列表的序列2自5’末端第583-585位核苷酸由TAC突變?yōu)锳AC ；(7)將序列表的序列2自5’末端第583-585位核苷酸由TAC突變?yōu)锳GC ；(8)將序列表的序列2自5’末端第583-585位核苷酸由TAC突變?yōu)門GC。(9)將序列表的序列2自5’末端第583-585位核苷酸由TAC突變?yōu)镚GG ；(10)將序列表的序列2自5’末端第583-585位核苷酸由TAC突變?yōu)镚AA ；(11)將序列表的序列2自5’末端第583-585位核苷酸由TAC突變?yōu)門GG ；(12)將序列表的序列2自5’末端第583-585位核苷酸由TAC突變?yōu)镚AC ；(13)將序列表的序列2自5’末端第583-585位核苷酸由TAC突變?yōu)镃AC ；(14)將序列表的序列2自5’末端第583-585位核苷酸由TAC突變?yōu)镃CG ；(15)將序列表的序列2自5’末端第583-585位核苷酸由TAC突變?yōu)锳TG ；(16)將序列表的序列2自5’末端第583-585位核苷酸由TAC突變?yōu)門TC。含有所述基因的重組表達(dá)載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述重組表達(dá)載體具體可為將所述基因插入載體pET_22b(+)的多克隆位點(diǎn)得到的重組質(zhì)粒。所述重組表達(dá)載體具體可為將所述基因插入載體pET-22b (+)的BamHI和XhoI酶切位點(diǎn)之間得到的重組質(zhì)粒。所述重組菌具體可為將所述重組表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌得到的重組菌。所述大腸桿菌具體可為大腸桿菌BL21 (DE3)。本發(fā)明還保護(hù)一種制備所述蛋白質(zhì)的方法，是培養(yǎng)所述重組菌，得到所述蛋白質(zhì)。所述培養(yǎng)的過(guò)程具體如下:將所述重組菌接種至TB培養(yǎng)基，37°C、220rpm振蕩培養(yǎng)至( 600Μ=0.6 (0.6-0.8均可)；加IPTG，使其在培養(yǎng)體系中的濃度為0.0lmM，然后16。。、220rpm振蕩培養(yǎng)96h ;將培養(yǎng)體系4°C、8000rpm離心10分鐘，收集上清液。本發(fā)明還保護(hù)所述蛋白質(zhì)的應(yīng)用，為如下(I )、(II)、(III)或(IV):( I )制備環(huán)狀糊精葡糖基轉(zhuǎn)移酶；( II )降解淀粉(如可溶性淀粉)；(III)生產(chǎn)Y -環(huán)狀糊精；(IV)生產(chǎn)α-環(huán)狀糊精。本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)，研究了位于催化中心195位氨基酸對(duì)于a -CGTase催化專一性的影響，對(duì)CGTa se的催化機(jī)理研究具有重大價(jià)值。


圖1為重組質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)示意圖。 圖2為α -CD標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖3為β -CD標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖4為Y-CD標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值?？扇苄缘矸?北京現(xiàn)代東方精細(xì)化學(xué)品有限公司，批號(hào):20070216。載體pET-22b (+):N0Vagen，產(chǎn)品目錄號(hào)為69744-3。大腸桿菌BL21 (DE3):北京全式金生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為⑶601-01。TB培養(yǎng)基:胰蛋白胨12g、酵母提取膏24g、甘油4mL,蒸懼水定容至1L。α -⑶標(biāo)準(zhǔn)品:大連美侖生物公司ΜΒ3077。β -⑶標(biāo)準(zhǔn)品:大連美侖生物公司ΜΒ1895。y -⑶標(biāo)準(zhǔn)品:大連美侖生物公司ΜΒ5536。實(shí)施例1、突變蛋白及其編碼基因的發(fā)現(xiàn)從自然界篩選到一株軟腐芽孢桿菌(Bacillus macerans)，可以生產(chǎn)環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶，該菌株中的環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶基因如序列表的序列2所不，編碼序列表的序列I所不的蛋白質(zhì)。將序列I所不蛋 白質(zhì)命名為ct-CGTase-1蛋白，將其編碼基因命名為a-CGTase-1基因(如序列2所不)。將序列3所不蛋白質(zhì)命名為a-CGTase-WT蛋白(NCBI中公開(kāi)的序列)，將其編碼基因命名為α _CGTase-WT基因(如序列4所不)。序列I與序列3的差異僅在于第590位氨基酸殘基(Μ/V)和第677位氨基酸殘基(S/G)。序列2與序列4的差異僅在于第1768位核苷酸(Α/G)和第2029位核苷酸(Α/G)。以序列表的序列I所示雙鏈DNA為模板，進(jìn)行195位飽和突變，得到包括缺失突變?cè)趦?nèi)的17個(gè)突變體。通過(guò)對(duì)各個(gè)突變體基因表達(dá)的蛋白進(jìn)行酶活鑒定，發(fā)現(xiàn)了一系列酶的產(chǎn)物專一性區(qū)別于序列I所示a -CGTase-1蛋白的突變蛋白。實(shí)施例2、酶活鑒定一、分別人工合成如下雙鏈DNA分子:(I)雙鏈DNA分子1:與序列表的序列2所示DNA分子的差異在于將自5’末端第583-585位核苷酸(TAC)缺失，并將自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突變?yōu)镃AC ;相應(yīng)的將序列I中的第195位酪氨酸缺失，并將第167位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)榻M氨酸。雙鏈DNA分子I編碼的蛋白命名為蛋白I。(2)雙鏈DNA分子2:與序列表的序列2所示DNA分子的差異在于將自5’末端第583-585位核苷酸由TAC突變?yōu)榱?TTC，并將自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突變?yōu)镃AC ;相應(yīng)的將序列I中的第195位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)楸奖彼?，并將?67位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)榻M氨酸。雙鏈DNA分子2編碼的蛋白命名為蛋白2。(3)雙鏈DNA分子3:與序列表的序列2所示DNA分子的差異在于將自5’末端第583-585位核苷酸由TAC突變?yōu)榱?CAC，并將自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突變?yōu)镃AC ;相應(yīng)的將序列I中的 第195位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)榻M氨酸，并將第167位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)榻M氨酸。雙鏈DNA分子3編碼的蛋白命名為蛋白3。(4)雙鏈DNA分子4:與序列表的序列2所示DNA分子的差異在于將自5’末端第583-585位核苷酸由TAC突變?yōu)榱?CCG，并將自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突變?yōu)镃AC ;相應(yīng)的將序列I中的第195位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)楦彼幔⒌?67位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)榻M氨酸。雙鏈DNA分子4編碼的蛋白命名為蛋白4。(5)雙鏈DNA分子5:與序列表的序列2所示DNA分子的差異在于將自5’末端第583-585位核苷酸由TAC突變?yōu)榱?TGG，并將自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突變?yōu)镃AC ;相應(yīng)的將序列I中的第195位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)樯彼?，并將?67位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)榻M氨酸。雙鏈DNA分子5編碼的蛋白命名為蛋白5。(6)雙鏈DNA分子6:與序列表的序列2所不DNA分子的差異在于將自5’末端第583-585位核苷酸由TAC突變?yōu)榱?GGG，并將自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突變?yōu)镃AC ;相應(yīng)的將序列I中的第195位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)楦拾彼幔⒌?67位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)榻M氨酸。雙鏈DNA分子6編碼的蛋白命名為蛋白6。(7)雙鏈DNA分子7:與序列表的序列2所不DNA分子的差異在于將自5’末端第583-585位核苷酸由TAC突變?yōu)榱?GTA，并將自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突變?yōu)镃AC ;相應(yīng)的將序列I中的第195位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)槔i氨酸，并將第167位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)榻M氨酸。雙鏈DNA分子7編碼的蛋白命名為蛋白7。(8)雙鏈DNA分子8:與序列表的序列2所示DNA分子的差異在于將自5’末端第583-585位核苷酸由TAC突變?yōu)榱?CTA，并將自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突變?yōu)镃AC ;相應(yīng)的將序列I中的第195位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)榱涟彼?，并將?67位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)榻M氨酸。雙鏈DNA分子8編碼的蛋白命名為蛋白8。

(9)雙鏈DNA分子9:與序列表的序列2所示DNA分子的差異在于將自5’末端第583-585位核苷酸由TAC突變?yōu)榱?ATA，并將自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突變?yōu)镃AC ;相應(yīng)的將序列I中的第195位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?，并將?67位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)榻M氨酸。雙鏈DNA分子9編碼的蛋白命名為蛋白9。(10)雙鏈DNA分子10:與序列表的序列2所示DNA分子的差異在于將自5’末端第583-585位核苷酸由TAC突變?yōu)榱?AAA，并將自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突變?yōu)镃AC ;相應(yīng)的將序列I中的第195位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)橘嚢彼幔⒌?67位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)榻M氨酸。雙鏈DNA分子10編碼的蛋白命名為蛋白10。(11)雙鏈DNA分子11:與序列表的序列2所示DNA分子的差異在于將自5’末端第583-585位核苷酸由TAC突變?yōu)榱?CGC，并將自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突變?yōu)镃AC ;相應(yīng)的將序列I中的第195位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)榫彼?，并將?67位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)榻M氨酸。雙鏈DNA分子11編碼的蛋白命名為蛋白11。(12)雙鏈DNA分子12:與序列表的序列2所示DNA分子的差異在于將自5’末端第583-585位核苷酸由TAC突變?yōu)榱?GAC，并將自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突變?yōu)镃AC ;相應(yīng)的將序列I中的第195位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)樘於彼?，并將?67位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)榻M氨酸。雙鏈DNA分子12編碼的蛋白命名為蛋白12。(13)雙鏈DNA分子13:與序列表的序列2所示DNA分子的差異在于將自5’末端第583-585位核苷酸由TAC突變?yōu)榱?GAA，并將自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突變?yōu)镃AC ;相應(yīng)的將序列I中的第195位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)楣劝彼?，并將?67位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)榻M氨酸。雙鏈DNA分子13編碼的蛋白命名為蛋白13。
(14)雙鏈DNA分子14:與序列表的序列2所不DNA分子的差異在于將自5’末端第583-585位核苷酸由TAC突變?yōu)榱?AGC，并將自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突變?yōu)镃AC ;相應(yīng)的將序列I中的第195位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)榻z氨酸，并將第195位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)榻M氨酸。雙鏈DNA分子14編碼的蛋白命名為蛋白14。(15)雙鏈DNA分子15:與序列表的序列2所不DNA分子的差異在于將自5’末端第583-585位核苷酸由TAC突變?yōu)榱?ATG，并將自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突變?yōu)镃AC ;相應(yīng)的將序列I中的第195位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)榧琢虬彼?，并將?67位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)榻M氨酸。雙鏈DNA分子15編碼的蛋白命名為蛋白15。(16)雙鏈DNA分子16:與序列表的序列2所示DNA分子的差異在于將自5’末端第583-585位核苷酸由TAC突變?yōu)锳AC，并將自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突變?yōu)镃AC ;相應(yīng)的將序列I中的第195位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)樘於０罚⒌?67位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)榻M氨酸 。雙鏈DNA分子16編碼的蛋白命名為蛋白16。(17)雙鏈DNA分子17:與序列表的序列2所示DNA分子的差異在于將自5’末端第583-585位核苷酸由TAC突變?yōu)門GC，并將自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突變?yōu)镃AC ;相應(yīng)的將序列I中的第195位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)榘腚装彼?，并將?67位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)榻M氨酸。雙鏈DNA分子17編碼的蛋白命名為蛋白17。(18)雙鏈DNA分子18:即序列表的序列2所示的雙鏈DNA分子。(19)雙鏈DNA分子19:即序列表的序列4所示的雙鏈DNA分子。二、重組質(zhì)粒的構(gòu)建(結(jié)構(gòu)示意圖見(jiàn)圖1)1、設(shè)計(jì)一對(duì)引物，由S2和A3組成。
權(quán)利要求
1.將序列表的序列I所示蛋白質(zhì)進(jìn)行如下(a)和(b)兩個(gè)突變得到的蛋白質(zhì): Ca)將序列表的序列I自N末端第167位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)榻M氨酸； (b)將序列表的序列I自N末端第195位氨基酸殘基進(jìn)行突變。
2.如權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，其特征在于:所述(b)中的所述突變?yōu)槿缦?I)至(16)中的任意一種: (1)將序列表的序列I自N末端第195位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)榫彼幔? (2)將序列表的序列I自N末端第195位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)橘嚢彼幔? (3)將序列表的序列I自N末端第195位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)榱涟彼幔? (4)將序列表的序列I自N末端第195位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)槔i氨酸； (5)將序列表的序列I自N末端第195位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)楫惲涟彼幔? (6)將序列表的序列I自N末端第195位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)樘於０罚? (7)將序列表的序列I自N末端第195位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)榻z氨酸； (8)將序列表的序列I自N末端第195位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)榘腚装彼幔? (9)將序列表的序列I自N末端第195位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)楦拾彼幔? (10)將序列表的序列I自 N末端第195位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)楣劝彼幔? (11)將序列表的序列I自N末端第195位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)樯彼幔? (12)將序列表的序列I自N末端第195位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)樘於彼幔? (13)將序列表的序列I自N末端第195位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)榻M氨酸； (14)將序列表的序列I自N末端第195位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)楦彼幔? (15)將序列表的序列I自N末端第195位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)榧琢虬彼幔? (16)將序列表的序列I自N末端第195位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)楸奖彼帷?br> 3.編碼權(quán)利要求1或2所述蛋白質(zhì)的基因。
4.如權(quán)利要求3所述的基因，其特征在于:所述基因?yàn)閷⑿蛄斜淼男蛄?所示蛋白質(zhì)進(jìn)行如下(c)和(d)兩個(gè)突變得到的DNA分子: (c)將序列表的序列2自5’末端第499-501位核苷酸由TAC突變?yōu)镃AC； Cd)將序列表的序列2自5’末端第583-585位核苷酸進(jìn)行突變。
5.如權(quán)利要求4所述的基因，其特征在于:所述(d)中的所述突變?yōu)槿缦?I)至(16)中的任意一種: 所述(d)中的所述突變?yōu)槿缦?I)至(16)中的任意一種: (1)將序列表的序列2自5’末端第583-585位核苷酸由TAC突變?yōu)镃GC； (2)將序列表的序列2自5’末端第583-585位核苷酸由TAC突變?yōu)锳AA； (3)將序列表的序列2自5’末端第583-585位核苷酸由TAC突變?yōu)镃TA； (4)將序列表的序列2自5’末端第583-585位核苷酸由TAC突變?yōu)镚TA； (5)將序列表的序列2自5’末端第583-585位核苷酸由TAC突變?yōu)锳TA； (6)將序列表的序列2自5’末端第583-585位核苷酸由TAC突變?yōu)锳AC； (7)將序列表的序列2自5’末端第583-585位核苷酸由TAC突變?yōu)锳GC； (8)將序列表的序列2自5’末端第583-585位核苷酸由TAC突變?yōu)門GC。
(9)將序列表的序列2自5’末端第583-585位核苷酸由TAC突變?yōu)镚GG； (10)將序列表的序列2自5’末端第583-585位核苷酸由TAC突變?yōu)镚AA；(11)將序列表的序列2自5’末端第583-585位核苷酸由TAC突變?yōu)門GG； (12)將序列表的序列2自5’末端第583-585位核苷酸由TAC突變?yōu)镚AC； (13)將序列表的序列2自5’末端第583-585位核苷酸由TAC突變?yōu)镃AC； (14)將序列表的序列2自5’末端第583-585位核苷酸由TAC突變?yōu)镃CG； (15)將序列表的序列2自5’末端第583-585位核苷酸由TAC突變?yōu)锳TG； (16)將序列表的序列2自5’末端第583-585位核苷酸由TAC突變?yōu)門TC。
6.含有權(quán)利要求3或4或5所述基因的重組表達(dá)載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
7.如權(quán)利要求6所述的重組表達(dá)載體，其特征在于:所述重組表達(dá)載體為將所述基因插入載體pET-22b (+)的多克隆位點(diǎn)得到的重組質(zhì)粒。
8.如權(quán)利要求6所述的重組菌，其特征在于:所述重組菌是將權(quán)利要求7所述重組表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌得到的重組菌。
9.一種制備權(quán)利要求1或2所述蛋白質(zhì)的方法，是培養(yǎng)權(quán)利要求6或8所述重組菌，得到權(quán)利要求1或2所述蛋白質(zhì)。
10.權(quán)利要求1或2所述蛋白質(zhì)的應(yīng)用，為如下(I)、( II )、(111)或(IV): (I )制備環(huán)狀糊精葡糖基轉(zhuǎn)移酶； (II)降解淀粉； (III)生產(chǎn)Y-環(huán)狀糊精； (IV)生產(chǎn)α-環(huán)狀糊精。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一組環(huán)狀糊精葡糖基轉(zhuǎn)移酶及其編碼基因和應(yīng)用。本發(fā)明提供的環(huán)狀糊精葡糖基轉(zhuǎn)移酶，是將序列表的序列1所示蛋白質(zhì)進(jìn)行如下(a)和(b)兩個(gè)突變得到的蛋白質(zhì)(a)將序列表的序列1自N末端第167位氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)榻M氨酸；(b)將序列表的序列1自N末端第195位氨基酸殘基進(jìn)行突變。本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)，研究了位于催化中心195位氨基酸對(duì)于α-CGTase催化專一性的影響，對(duì)CGTase的催化機(jī)理研究具有重大價(jià)值。
文檔編號(hào)C12R1/19GK103232981SQ20131016806
公開(kāi)日2013年8月7日 申請(qǐng)日期2013年5月6日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月6日
發(fā)明者鈔亞鵬, 錢世鈞, 謝婷 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院微生物研究所