專利名稱：一種菌絲相白念珠菌的培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種菌絲相白念珠菌的培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
白念珠菌為單細胞酵母樣真菌,又稱白假絲菌,有芽生孢子(spore, yeast form)和假絲相(pseudohyphae, mycelia form)兩種存在形式,一般認為假菌絲是孢子大量繁殖的致病形式，即菌相轉(zhuǎn)化。菌相轉(zhuǎn)換的這一過程可以說是念珠菌侵襲感染宿主的過程，菌絲越多，感染性越高；而不能形成菌絲的白念珠菌突變菌株毒力降低或喪失。白念珠菌的感染，其內(nèi)毒素或代謝產(chǎn)物使口腔黏膜上皮細胞中抑制細胞增殖的物質(zhì)(如第二信使cAMP)等受到影響，從而受到口腔黏膜上皮的過度角化，細胞異常增殖，甚至趨向癌變。故對念珠菌感染過程不可獲缺的菌絲相細胞其生成條件的研究受到較為廣泛的關(guān)注。白念珠菌在血清中37°C孵育3小時后可見芽管(germ tubes)形成；以牛奶吐溫培養(yǎng)基、玉米培養(yǎng)基、Lee培養(yǎng)基、Spider培養(yǎng)基等固體培養(yǎng)基為主,可使念珠菌產(chǎn)生一定量菌絲，但富含酵母相細胞，純度不足；以7天12次傳代可獲得高純度菌絲細胞，但實驗周期較長，菌絲挑取困難；再有文獻表明在pH=7.0的1640+56°C滅活小牛血清中且恒溫38°C條件可以更快捷的誘導出較純的菌絲。菌絲形成快慢與其毒力大小是否相關(guān)尚未見報道，且血清活性與菌絲形成是否相關(guān)亦無報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明采用相同條件下不同程度滅活的小牛血清誘導菌絲相細胞，檢測菌絲形成率，觀察血清成份與菌絲誘導的相互關(guān)系及作用，提供了可獲得近完全的純菌絲相細胞的菌絲相白念珠菌的培養(yǎng)方法。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:—種菌絲相白念珠菌的培養(yǎng)方法，所述方法包括:挑取白念珠菌菌落于液體培養(yǎng)基中(每5mL培養(yǎng)基接種直徑約2mm的菌落)，37°C恒溫培養(yǎng)6h以上，獲得菌絲相白念珠菌；所述液體培養(yǎng)基按如下方法配制:將胎牛血清于121°C下滅活30min后，按照1:9體積比(胎牛血清與1640培養(yǎng)液體積比)與1640培養(yǎng)液混合，調(diào)pH為7.4，即得所述液體培養(yǎng)基。按照本發(fā)明方法，恒溫培養(yǎng)6h即可獲得菌絲相白念珠菌(菌絲相形成95%以上)。優(yōu)選的,恒溫培養(yǎng)時間為6h ;或者,恒溫培養(yǎng)時間為7d,第I 2d,每8h傳代一次，第3 4d，每12h傳代一次，第5 7d，每24h傳代一次，菌絲相形成可達99%以上。血清是細胞培養(yǎng)中的重要成份之一，對細胞生長有廣泛意義:生長因子(如激素，白細胞介素等)可以促進細胞生長；貼附因子可促進細胞的貼壁；蛋白質(zhì)(如血清白蛋白，球蛋白等)，既可以作為營養(yǎng)物質(zhì)，又可以中止胰酶作用；血清也可以起到解毒作用，如脂肪酸、重金屬和某些蛋白酶的毒性；血清還可以使細胞免受機械損傷。加入動物血清還可起到酸堿度緩沖液的作用，為細胞生長提供一個類似生物體內(nèi)的環(huán)境。發(fā)明人用RPMI1640加不同程度滅活的胎牛血清，在不同時間觀察菌絲形成情況，發(fā)現(xiàn)RPMI1640空白對照組的菌絲形成率相似于RPMI1640中加入未經(jīng)滅活的血清組，提示未經(jīng)滅活的血清對菌絲形成無明顯助益。而未經(jīng)滅活的血清培養(yǎng)液中的菌絲形成率明顯低于56°C滅活血清培養(yǎng)基。56°C、30分鐘是血清滅活的常規(guī)方法，以滅活血清中的補體系統(tǒng)和可能的支原體等微生物。本發(fā)明采用121°C、30分鐘的非常規(guī)血清滅活方法，實驗表明，121°C滅活血清的培養(yǎng)要優(yōu)于56°C滅活血清。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在:本發(fā)明打破常規(guī)，提供了一種可獲得近完全的純菌絲相細胞的菌絲相白念珠菌的培養(yǎng)方法；本發(fā)明121°c滅活血清在菌絲形成過程中的作用有待進一步研究，有望為糜爛型OLP伴念珠菌感染的治療提供新的思路。


圖1為實驗菌株在5ml培養(yǎng)液中的菌絲形成率；圖2為實驗菌株6h時的表觀形態(tài)，自左向右依次為:4.5ml RPMI1640+0.5ml胎牛血清(無滅活)，4.5ml RPMI1640+0.5ml胎牛血清(56 °C, 30min滅活補體),4.5mlRPMI1640+0.5ml 胎牛血清(121°C，30min 滅活)，另 RPMI1640 中為清液；圖3為臨床分離菌株a-c在5ml培養(yǎng)液中的菌絲形成率；圖4為左起臨床分離菌株d-g在5ml培養(yǎng)液中的菌絲形成率；圖5為臨床分離菌株6h時的表觀形態(tài)，自左向右依次為:4.5ml RPMI1640+0.5ml胎牛血清(無滅活)，4.5ml RPMI1640+0.5ml胎牛血清(56 °C, 30min滅活補體),4.5mlRPMI1640+0.5ml 胎牛血清(121°C，30min 滅活)，另 RPMI1640 中為清液。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施 例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此:實施例1:1.1研究設(shè)備與材料API20C AUX 念珠菌鑒定系統(tǒng)(biomerieux, France)恒溫搖床(Forma,China)隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)倒置顯微鏡(Olympus,Germany)科瑪嘉顯色培養(yǎng)基(CHROMagar,Germany)RPMI1640 (Gbico，China)無支原體胎牛血清(杭州四季青生物材料工程有限公司，中國)SDA, YPD培養(yǎng)基(杭州微生物試劑有限公司)60mm、90mm 無菌培養(yǎng)皿(Coring, USA)1.2實驗步驟1.2.1菌株復蘇菌株來源:實驗菌株:ATCC64550 (原始來源:ATCC，美國)，由浙江大學醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院臨床微生物實驗室贈；
臨床分離菌株:2011年8月I日 2012年6月I日期間就診于浙江大學第二附屬醫(yī)院口腔內(nèi)科及黏膜病?？撇⒋_診為OLP的患者分離所得菌株；肉桂胨于37°C水浴中快速解凍，于超凈臺吸取IOul液于沙堡培養(yǎng)基，37°C恒溫培養(yǎng)箱靜置48h，菌株復蘇，菌落形成。1.2.3菌絲相白念珠菌的培養(yǎng)挑取直徑約2mm菌落分別于4.5ml RPMI1640+0.5ml胎牛血清(56°C, 30min滅活補體)，濃度調(diào)整為l*106/ml，隔水式恒溫培養(yǎng)箱7天傳代12次(I 2d，每8h傳代一次，3 4d，每12h傳代一次，5 7d，每24h傳代一次)，菌絲相形成達99%以上。另設(shè)5ml RPMI1640,4.5ml RPMI1640+0.5ml 胎牛血清(無滅活)，4.5mlRPMI1640+0.5ml胎牛血清(121°C，30min滅活)，同上傳代12次作對照，觀察菌絲細胞形成情況。分別選擇在211、311、611、811、1211、2411、7(1在高倍鏡下計每100個細胞形成菌絲的細胞數(shù)，每個樣本重復計數(shù)三次取平均值，作為菌絲的形成率。3、實驗結(jié)果不同來源的白念珠菌菌絲形成能力不同。不同培養(yǎng)基:5ml RPMI1640,4.5mlRPMI1640+0.5ml 胎牛血清(無滅活)，4.5ml RPMI1640+0.5ml 胎牛血清(56°C，30min 滅活補#),4.5ml RPMI1640+0.5ml 胎牛血清(121°C，30min 滅活)液，pH 均為 7.4，培養(yǎng) 2h，3h，6h，8h，12h，24h及7天12次傳代的菌絲形成情況如下表I 2、圖1 圖5所示。表1:實驗菌株在5ml培養(yǎng)液中的菌絲形成率
權(quán)利要求
1.一種菌絲相白念珠菌的培養(yǎng)方法,所述方法包括挑取白念珠菌菌落于液體培養(yǎng)基中，37°C恒溫培養(yǎng)6h以上，獲得菌絲相白念珠菌；所述液體培養(yǎng)基按如下方法配制將胎牛血清于121°C下滅活30min后，按照I :9體積比與1640培養(yǎng)液混合，調(diào)pH為7. 4，即得所述液體培養(yǎng)基。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于恒溫培養(yǎng)時間為6h。
3.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于恒溫培養(yǎng)時間為7d,第I 2d,每8h傳代一次，第3 4d，每12h傳代一次，第5 7d，每24h傳代一次。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種菌絲相白念珠菌的培養(yǎng)方法，所述方法包括挑取白念珠菌菌落于液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)6h以上，獲得菌絲相白念珠菌；所述液體培養(yǎng)基按如下方法配制將胎牛血清于121℃下滅活30min后，按照19體積比與1640培養(yǎng)液混合，調(diào)pH為7.4，即得所述液體培養(yǎng)基。本發(fā)明打破常規(guī)，提供了一種可獲得近完全的純菌絲相細胞的菌絲相白念珠菌的培養(yǎng)方法；本發(fā)明121℃滅活血清在菌絲形成過程中的作用有待進一步研究，有望為糜爛型OLP伴念珠菌感染的治療提供新的思路。
文檔編號C12R1/725GK103255066SQ20131016904
公開日2013年8月21日 申請日期2013年5月6日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月6日
發(fā)明者何虹, 范艷 申請人:浙江大學