專(zhuān)利名稱(chēng)：產(chǎn)豐加霉素的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌工程菌、構(gòu)建方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用透明顫菌血紅蛋白基因在淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌中表達(dá)提高豐加霉素產(chǎn)量的方法，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
豐加霉素是一種新型核苷類(lèi)抗生素，分子式為C12H13N5O4,核糖C1連接類(lèi)似鳥(niǎo)嘌呤的脫氮雜嘌呤環(huán)，核心結(jié)構(gòu)為吡咯嘧啶核苷類(lèi)似物。作用機(jī)理主要是通過(guò)抑制微生物的轉(zhuǎn)錄而影響菌體的生長(zhǎng)，其生物活性研究報(bào)道主要集中在臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。近期有研究發(fā)現(xiàn)豐加霉素對(duì)多種植物疫病具有良好的防治效果，長(zhǎng)期使用不會(huì)造成環(huán)境污染，而且對(duì)植物生長(zhǎng)也具有一定的調(diào)節(jié)作用。因此，豐加霉素在農(nóng)業(yè)植物病害防治領(lǐng)域具有的應(yīng)用潛力。相對(duì)于化學(xué)合成法，生物法合成豐加霉素以可再生資源為原料，具有反應(yīng)條件溫和、污染少以及成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，因此，生物合成法是目前豐加霉素工業(yè)化生產(chǎn)比較經(jīng)濟(jì)有效的方法。豐加霉素屬于次級(jí)代謝產(chǎn)物，在發(fā)酵過(guò)程中菌絲結(jié)構(gòu)稠密，發(fā)酵液粘稠導(dǎo)致溶氧水平受到限制，導(dǎo)致豐加霉素合成水平較低，生產(chǎn)能耗較大，難以規(guī)?；a(chǎn)。解決該問(wèn)題的現(xiàn)有方法一般都局限于通過(guò)通入純氧、通氣/攪拌優(yōu)化配置等方式來(lái)提高細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境中的氧氣傳遞性質(zhì)，增加了生產(chǎn)成本。透明顫菌血紅蛋白(VHb)是目前為止研究最為透徹的原核生物血紅蛋白，許多研究均表明它在細(xì)胞中處于限氧條件下促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、提高細(xì)胞培養(yǎng)密度和蛋白質(zhì)合成能力。抗生素的生產(chǎn)是一個(gè)好氧的過(guò)程，由于VHb在微氧條件下可以提高細(xì)胞的溶氧水平，促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)以及提高次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量，因此VHb在抗生素生產(chǎn)中受到廣泛的研究和應(yīng)用。安德榮等SOE-PCR (S plicing by overlap extension PCR)技術(shù)構(gòu)建含紅霉素抗性基因啟動(dòng)子和vgb結(jié)構(gòu)基因融合片段的整合型表達(dá)載體pJDlOO，利用接合轉(zhuǎn)移法將vgb基因整合到瑞拉菌素產(chǎn)生菌委內(nèi)瑞拉鏈霉菌秦嶺變種中，使工程菌株的效價(jià)提高，但其中獲得基因融合片段的過(guò)程操作復(fù)雜，易產(chǎn)生移碼突變。陳文青等基于質(zhì)粒PWQ2005中的硫鏈絲菌素誘導(dǎo)啟動(dòng)子啟動(dòng)vgb的表達(dá),利用接合轉(zhuǎn)移法將vgb基因整合到泰樂(lè)菌素的生產(chǎn)菌株弗氏鏈霉菌中，但由于啟動(dòng)子受到硫鏈絲菌素誘導(dǎo)，發(fā)酵過(guò)程中添加對(duì)菌體生長(zhǎng)不利。載體PIB139是在鏈霉菌整合型質(zhì)粒PSET152的多克隆位點(diǎn)加入啟動(dòng)子PermY^構(gòu)建而成的鏈霉菌穿梭質(zhì)粒，便于基因在鏈霉菌中的高效表達(dá)，同時(shí)由于其中具有用于接合轉(zhuǎn)移的orn功能區(qū)域，鏈霉菌篩選標(biāo)記-安普抗性基因(mpD,整合酶基因，鏈霉菌溫和噬菌體OC31的WiP位點(diǎn)。因此，PIB139可利用簡(jiǎn)便高效的屬間接合轉(zhuǎn)移法導(dǎo)入鏈霉菌，并可通過(guò)特異性重組整合在鏈霉菌染色體的禮位點(diǎn)上，隨著宿主染色體的復(fù)制而復(fù)制并賦予安普抗性。趙廣榮等將vgb基因置于pIB139中的下游，通過(guò)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化將其轉(zhuǎn)入鏈霉菌中。但是其中原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化操作復(fù)雜，需要原生質(zhì)體的制備，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化還存在宿主的限制性修飾系統(tǒng)而導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率較低，同時(shí)趙廣榮等并未考察重組菌中vgb表達(dá)對(duì)菌株合成目的代謝產(chǎn)物的影響。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)豐加霉素的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌工程菌、構(gòu)建方法及用途。淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌^Streptomyces dias ta tochromogenes) 1628 是一株拮抗放線菌，其發(fā)酵液對(duì)多種植物病原真菌具有較強(qiáng)的抑制作用，經(jīng)分離提取，確定其主要有效成分為豐加霉素，尚未見(jiàn)淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌的遺傳表達(dá)體系的研究報(bào)道。本發(fā)明以綠色熒光蛋白基因(gfp)作為報(bào)告基因，成功構(gòu)建了含有/κ /ΤΒΕ*啟動(dòng)子的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌重組表達(dá)載體pIB139-gfp，對(duì)其在淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌中啟動(dòng)子活性進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn)，在淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌中啟動(dòng)子可有效啟動(dòng)外源基因的表達(dá)。在此基礎(chǔ)上，成功構(gòu)建了攜帶有來(lái)源于透明顫菌血紅蛋白基因vgb的表達(dá)質(zhì)粒pIB139-vgb，并通過(guò)接合轉(zhuǎn)移法將其整合在淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628染色體上?！N產(chǎn)豐加霉素的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌工程菌，它的染色體上整合有來(lái)源于透明顫菌的血紅蛋白基因Fg力，具有比淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌i^treptomyces dias ta tochromogenes)1628更高的豐加霉素合成能力。所述的產(chǎn)豐加霉素的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌工程菌的構(gòu)建方法，過(guò)程如下:
O構(gòu)建表達(dá)載體pIB139-Vgb ；
2)利用接合轉(zhuǎn)移法將所述的表達(dá)載體整合入淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌染色體，獲得所述的工程菌。所述的方法，利用pIB139載體上的啟動(dòng)子pernm啟動(dòng)vgb基因的表達(dá)，利用接合轉(zhuǎn)移法將載體PIB139-V gb特異性的整合入淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌(51 trep tomycesdi as ta tochromoge nes) 1628的染色體，獲得了遺傳穩(wěn)定的工程菌。所述的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌工程菌生產(chǎn)豐加霉素的用途，將重組菌1628-VHB進(jìn)行發(fā)酵，與原始菌株相比，重組菌豐加霉素產(chǎn)量至少提高了 21.2%，菌濃提高了 11.6%。本發(fā)明的有益效果:
本發(fā)明提供了一種產(chǎn)豐加霉素的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌工程菌、構(gòu)建方法及用途，得到了整合血紅蛋白基因Vgb的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌后使其合成豐加霉素的能力比原始菌提高了21.2%，菌濃提高了 11.6%。為進(jìn)一步改善發(fā)酵法生產(chǎn)豐加霉素過(guò)程中溶氧的問(wèn)題奠定了基礎(chǔ)。


圖1重組質(zhì)粒pIB139_gfp的構(gòu)建示意圖。圖2質(zhì)粒pET28_gfp的酶切電泳驗(yàn)證圖。其中，M1: λ DNA///i/ d III Marker, M2:DL2000 Marker, 1: pET28a-^-y7 /i C(9Rl+Η η III 雙酶切；2: pMD18_ -gfp/BcoR l+Η η III 雙酶切；3:貧的 PCR 產(chǎn)物
圖3質(zhì)粒pIB139-gf/7的酶切電泳驗(yàn)證圖。其中，M:DL2000 Marker; 1: ^\^~gfp/Xba Ι+Μ Ι 雙酶切；2: pIB139A aIWoiI雙酶切；
圖4重組菌1628-GFP的PCR電泳驗(yàn)證圖。其中，1-4:以重組菌1628-GFP為模板PCR擴(kuò)增貧f/7基因；5:以1628為模板PCR擴(kuò)增貧令；M: DL2000 Marker 圖5啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性測(cè)定圖。其中，出發(fā)菌株1628和重組菌1628-GFP的綠色熒光檢測(cè):A.出發(fā)菌株1628; B.重組菌株1628- GFP
圖6重組質(zhì)粒PIB139-F.#的構(gòu)建示意圖。圖7重組質(zhì)粒pET28a-1^^的酶切電泳驗(yàn)證圖。其中，1:pET28a-K^/^coR l+Η η III雙酶切；2: pET28a/^boR l+Η η III雙酶切；M: DL2000.圖8重組質(zhì)粒ρΙΒ139-ι^6的酶切電泳驗(yàn)證圖。Μ: DL2000; 1: pIB139/ Nde l+Not I雙酶切；2: pIB139-^/ Nde !+Not I雙酶切.圖9重組菌1628-VHB的PCR電泳驗(yàn)證圖。其中，1-4:以重組菌1628-VHB為模版PCR擴(kuò)增a/ττ基因；5:以原始菌1628為模板PCR擴(kuò)增apr基因；6_9:以重組菌1628-VHB為模版PCR擴(kuò)增vgb基因；10:以原始菌1628為模板 PCR 擴(kuò)增 vgb 基因；M:DL2000 Marker。圖10重組淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628-VHB的CO差光譜圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1:以綠色熒光蛋白基因gfp作為報(bào)告基因的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌遺傳表達(dá)體系的構(gòu)建:
以質(zhì)粒pCAMBIA1302為模板，以 gfp EcoR I和Pg/pR Hindlll為引物PCR獲得含有I與歷fldIII兩個(gè)酶切位點(diǎn)的片段，與pMD18-T Vector連接，構(gòu)建克隆載體pMD18-T-^//7 iEcoR Ι+Η η ΙΙΙ) 0 將克隆載體 pMD18-T-^f/ 0boR I+ HindII )轉(zhuǎn)化至厶coli JM109受體菌，涂布·于含Amp、IPTG、X-gal的LB瓊脂平板上，37 °C培養(yǎng)過(guò)夜后，平板上長(zhǎng)出許多白色菌落。隨機(jī)挑取白色克隆酶切鑒定后送上海生工生物工程有限公司測(cè)序用EcoR I與#i/7dIII雙酶切得到含有I與Hind III兩個(gè)酶切位點(diǎn)的片段，與同樣酶切的pET28a連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109后在Kan抗性LB平板篩選得到轉(zhuǎn)化子，獲到質(zhì)粒pET28a-^f/7。然后用Xba I與Afoi I雙酶切pET28a_^f/7，與同樣酶切的pIB139連接轉(zhuǎn)化，涂布阿泊拉霉素抗性平板，挑取轉(zhuǎn)化子，酶切驗(yàn)證，即獲得重組質(zhì)粒pIB139-g//7 (圖1)。根據(jù)GenBank公布的綠色突光蛋白基因貧令序列，設(shè)計(jì)引物,通過(guò)PCR技術(shù)從質(zhì)粒pCAMBIA1302中擴(kuò)增出序列。引物設(shè)計(jì)如下:
PgfpF BcoR 1:5’ -ACGTtXlGiATGGTAGATCTGACTAGPgfpR NindlI1:5’ -ACGg^m^CCCGATCTAGTAAC
如圖2和3所示，分別為重組質(zhì)粒pET28a-^f/7和pIB139_^f/7酶切驗(yàn)證結(jié)果。重組質(zhì)粒pET28a-g//7經(jīng)&oR I與歷/ dIII雙酶切后獲得約1.1kb和5.3kb的DNA片段，分別與基因片段和質(zhì)粒pET28a的大小一致(圖2)。重組質(zhì)粒pIB139_^f/7經(jīng)油a I與I雙酶切后獲得約1.1kb和5.9kb的DNA片段，分別與基因片段和質(zhì)粒pIB139的大小一致(圖3)。以上結(jié)果證明重組質(zhì)粒pIB139-貧f/7構(gòu)建正確。提取質(zhì)粒pIB139-g//7，用接合轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)入淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌。在阿泊拉霉素抗性平板上隨機(jī)挑取若干菌落于CP培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，提取染色體。PCR實(shí)驗(yàn)均能擴(kuò)增出gfp基因(圖4)，證明重組淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628-GFP構(gòu)建成功。實(shí)施例2:以綠色熒光蛋白基因作為報(bào)告基因的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌遺傳表達(dá)體系的初步評(píng)價(jià):
挑取在含50 μ g/mL阿泊拉霉素的平板生長(zhǎng)的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌菌落接種CP培養(yǎng)基，28 0C , 180 r/min振蕩過(guò)夜，然后再以1:50的接種量分別接種于裝有50 mL新鮮CP培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期，細(xì)胞干重(DCW)約為0.3 g/L, 6000 r/min離心收集菌絲體，用PBS緩沖液洗滌菌絲體2次后，重懸于30 mL PBS中。取5 -10 μ L菌液涂片，在Olympus BX50突光顯微鏡下觀察，同時(shí)用SONY 3CO)的Color Video Camera拍照。以野生菌作為對(duì)照，選擇激發(fā)濾光片為485 nm，發(fā)射濾光片為520 nm，確定啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性。結(jié)果顯示重組菌1628-GFP菌絲能發(fā)出穩(wěn)定的明亮的綠色熒光(圖5)，而對(duì)照無(wú)熒光，說(shuō)明在淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628中啟動(dòng)子能有效啟動(dòng)外源基因的表達(dá)。實(shí)施例3:透明顫菌血紅蛋白基因vgb在淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌中的表達(dá):
重組質(zhì)粒PIB139-F.#的構(gòu)建如圖6所示,步驟與重組質(zhì)粒PIB139-F.#的構(gòu)建方法類(lèi)似。如圖7和圖8所示，分別為重組質(zhì)粒pET28a-1^^和ρΙΒ139_ι^6酶切驗(yàn)證結(jié)果。重組質(zhì)質(zhì)粒pET28a-r#經(jīng)&oR I與歷雙酶切后獲得約0.5kb和5.3kb的DNA片段，分別與vgb基因片段和質(zhì)粒pET28a的大小一致。重組質(zhì)粒pIB139-r#經(jīng)與Not I雙酶切后獲得約0.6kb的DNA片段，與vgb基因片段的大小一致。以上結(jié)果證明重組質(zhì)粒pIB139_Fg^構(gòu)建正確。 提取質(zhì)粒pIB139-r#，用接合轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)入淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628。在阿泊拉霉素抗性平板上隨機(jī)挑取若干菌落于CP培養(yǎng)基中多次培養(yǎng)后，提取染色體。PCR實(shí)驗(yàn)均能擴(kuò)增出vgb基因和阿泊拉霉素抗性基因apr (圖9)，證明質(zhì)粒pIB139-r#成功的整合在淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌的染色體上，且遺傳穩(wěn)定，重組淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628-VHB構(gòu)建成功。成功獲得重組淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628-VHB后，對(duì)其進(jìn)行VHb的表達(dá)研究，并通過(guò)CO差光譜法測(cè)定了 VHb的表達(dá)量。如圖10所示，以原始淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628做對(duì)照，重組淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628-VHB,與CO結(jié)合后在419nm處均出現(xiàn)吸收峰，證明vgb基因以淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌為宿主細(xì)胞，在啟動(dòng)子作用下，能表達(dá)出具有活性的血紅蛋白。將重組淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628-VHB接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28°C，180 r/min發(fā)酵96h。對(duì)照組為淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌出發(fā)株。發(fā)酵結(jié)束后，分別測(cè)定了菌濃，豐加霉素產(chǎn)量。如下表I所示，重組菌株的產(chǎn)素水平較出發(fā)菌株提高了 21.2%，菌濃提高了 11.6%，且重復(fù)性良好。說(shuō)明VHb的表達(dá)有利于淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌菌體的生長(zhǎng)和豐加霉素的合成。表I VHb表達(dá)對(duì)1628菌體生長(zhǎng)和豐加霉素生物合成的影響
Ii體 I豐加霉素產(chǎn)量(mg/L) I細(xì)胞干重(g/L)
1628134.97_0.43_
1628-VHB 1163.52|θ.49
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)豐加霉素的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌工程菌，其特征在于，它的染色體上整合有來(lái)源于透明顫菌的血紅蛋白基因，具有比淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌i^treptomycesdiastatochromogenes) 1628更高的豐加霉素表達(dá)能力。
2.一種如權(quán)利要求1所述的產(chǎn)豐加霉素的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，過(guò)程如下: O構(gòu)建表達(dá)載體pIB139-vgb ； 2)利用接合轉(zhuǎn)移法將所述的表達(dá)載體整合入淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌染色體，獲得所述的工程菌。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，利用PIB139載體上的啟動(dòng)子permE*啟動(dòng)vgb基因的表達(dá)，利用接合轉(zhuǎn)移法將載體pIB139-vgb特異性的整合入淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌{Streptomyces di as ta tochromogenes) 1628的染色體，獲得了遺傳穩(wěn)定的工程菌。
4.一種利用如權(quán)利要求1所述的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌工程菌生產(chǎn)豐加霉素的用途，其特征在于，將重組菌1628-VHB進(jìn)行發(fā)酵，與原始菌株相比，重組菌豐加霉素產(chǎn)量至少提高了.21.2%，菌濃提 高了 11.6%ο
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種產(chǎn)豐加霉素的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌工程菌、構(gòu)建方法及用途。它的染色體上整合有來(lái)源于透明顫菌的血紅蛋白基因vgb，具有比淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomyces diastatochromogenes)1628更高的豐加霉素表達(dá)能力。構(gòu)建過(guò)程如下1)構(gòu)建表達(dá)載體pIB139-vgb；2)利用接合轉(zhuǎn)移法將所述的表達(dá)載體整合入淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌染色體，獲得所述的工程菌。利用pIB139載體上的啟動(dòng)子permE*啟動(dòng)vgb基因的表達(dá)，利用接合轉(zhuǎn)移法將載體pIB139-vgb特異性的整合入淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomyces diastatochromogenes)1628的染色體，獲得了遺傳穩(wěn)定的工程菌。與原始菌株相比，重組菌豐加霉素產(chǎn)量至少提高21.2%，菌濃提高了11.6%。
文檔編號(hào)C12P19/40GK103243062SQ201310170658
公開(kāi)日2013年8月14日 申請(qǐng)日期2013年5月8日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月8日
發(fā)明者馬正, 俞曉平, 劉金秀, 申屠旭萍, 邊亞琳, 郝培應(yīng), 許益鵬 申請(qǐng)人:中國(guó)計(jì)量學(xué)院