專利名稱：一種啟動(dòng)子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種啟動(dòng)子及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
當(dāng)今毛紡織品朝著輕薄、柔軟的高檔次方向發(fā)展，使得毛紡織工業(yè)對(duì)細(xì)毛羊的綜合品質(zhì)要求越來(lái)越高。近20多年來(lái)，澳洲羊毛細(xì)度發(fā)生了很大變化，目前有1/3以上的羊毛屬于超細(xì)羊毛，且這一趨勢(shì)還在繼續(xù)發(fā)展中。為適應(yīng)市場(chǎng)需求，我國(guó)從20世紀(jì)80年代開(kāi)始對(duì)中國(guó)美利奴超細(xì)毛羊進(jìn)行選育。但至今我國(guó)培育的超細(xì)毛羊毛細(xì)度尚達(dá)不到國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)，且在產(chǎn)量上尚不能批次生產(chǎn)，供求缺口很大。在培育轉(zhuǎn)基因超細(xì)毛美利奴綿羊的研究中，急需獲得皮膚毛囊組織特異性表達(dá)啟動(dòng)子指導(dǎo)目標(biāo)基因表達(dá)，從而分析和評(píng)價(jià)不同目標(biāo)基因?qū)γ疑L(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控機(jī)制。此基礎(chǔ)研究工作，為培育優(yōu)良超細(xì)毛美利奴綿羊品種、增加羊毛產(chǎn)量、改善羊毛品質(zhì)提供了科學(xué)依據(jù)。HGTP (高甘氨酸-酪氨酸蛋白)，屬于KAP (角蛋白相關(guān)蛋白)家族的重要成員之一，相對(duì)富含甘氨酸-酪氨酸(35% 60%)。根據(jù)氨基酸殘基和溶解性分為I型(KAP7和KAP8，氨基酸含量為50%)和II型(KAP6亞家族，氨基酸含量77%)。KAP6.1基因?qū)儆贙AP6亞家族中的一員。HGTP在毛囊的表達(dá)具有嚴(yán)格的時(shí)空表達(dá)特異性，但是在不同物種間存在差異。美利奴綿羊毛囊組織的原位雜交實(shí)驗(yàn)表明，綿羊KAP6基因表達(dá)僅限于毛囊球增殖區(qū)域上部約200 μ m處，該層為正在分化的毛干角質(zhì)化細(xì)胞，且發(fā)現(xiàn)KAP6.1基因僅在毛囊正皮質(zhì)區(qū)表達(dá)，KAP6.1基因表達(dá)的這種高度特異性和不對(duì)稱性說(shuō)明其在毛囊正副皮質(zhì)細(xì)胞中的比例和分布對(duì)羊毛的彎曲有重要作用。通過(guò)對(duì)美利奴羊突變個(gè)體研究表明，突變后羊毛纖維變粗、彎曲減少，KAP6.1基因、KAP7基因和KAP8基因表達(dá)嚴(yán)重下調(diào)，且在突變體毛囊細(xì)胞中只有副皮質(zhì)細(xì)胞，這說(shuō)明KAP6.1和KAP 8直接影響了羊毛的細(xì)度和彎曲。KAP6.1基因表達(dá)的時(shí)空特異性是由其5’側(cè)翼區(qū)的基序調(diào)控的，關(guān)于該基因的序列報(bào)道，包括編碼區(qū)和5’側(cè)翼區(qū)1042bp的序列，如序列表的序列I自5’末端第488至1529位核苷酸所示。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種啟動(dòng)子及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的啟動(dòng)子，獲自敖漢細(xì)毛羊，為如下I)或2)或3)所述的DNA分子:I)序列表的序列I所示的DNA分子；2)在嚴(yán)格條件下與I)限定的DNA序列雜交且具有啟動(dòng)子功能的DNA分子；3)與I)限定的DNA序列具有90%以上同源性且具有啟動(dòng)子功能的DNA分子。所述嚴(yán)格條件為在0.1 XSSPE (或0.1XSSC)、0.1% SDS的溶液中，65°C條件下雜交并洗膜。含有所述啟動(dòng)子的表達(dá)盒、重組載體、重組菌或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述重組載體可為重組質(zhì)粒，具體可為將所述啟動(dòng)子導(dǎo)入pGL3-Basic載體得到的重組質(zhì)粒。本發(fā)明還保護(hù)所述DNA分子作為啟動(dòng)子的應(yīng)用。本發(fā)明還保護(hù)所述DNA分子在啟動(dòng)目的基因表達(dá)中的應(yīng)用。用所述DNA分子啟動(dòng)目的基因表達(dá)的實(shí)現(xiàn)方法具體可為:將自上游至下游依次包括所述DNA分子和所述目的基因的表達(dá)盒導(dǎo)入表達(dá)載體，得到重組表達(dá)載體，然后將所述重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞并培養(yǎng)宿主細(xì)胞。所述目的基因可為促進(jìn)羊毛生長(zhǎng)、改善羊毛品質(zhì)的相關(guān)功能基因。所述目的基因可為編碼螢火蟲熒光素酶的基因。所述重組表達(dá)載體可為將所述啟動(dòng)子導(dǎo)入pGL3-Basic載體得到的重組質(zhì)粒。所述宿主細(xì)胞可為綿羊皮膚組織原代細(xì)胞。本發(fā)明公開(kāi)了一種啟動(dòng)子，與現(xiàn)有啟動(dòng)子相比具有更高的啟動(dòng)目的基因表達(dá)的活性，可以滿足目的基因在綿羊皮膚組織中的表達(dá)要求，滿足目的基因在毛囊組織中高效特異性表達(dá)的要求。本發(fā)明不僅能用于毛發(fā)細(xì)度、彎曲和毛囊發(fā)育中基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制的研究，而且對(duì)轉(zhuǎn)基因超細(xì)毛美利奴綿羊的培育也起到了促進(jìn)作用。


圖1為重組質(zhì)粒甲構(gòu)建過(guò)程中的瓊脂糖凝膠電泳圖。圖2為重組質(zhì)粒乙構(gòu)建過(guò)程中的瓊脂糖凝膠電泳圖。圖3為各組處理后，細(xì)胞的螢火蟲熒光素酶的相對(duì)活性結(jié)果。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便·于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。敖漢細(xì)毛羊:購(gòu)買自內(nèi)蒙赤峰市敖漢旗種羊場(chǎng)。pRL-TK質(zhì)粒(該質(zhì)粒具有編碼海腎突光素酶的基因):購(gòu)買自promoga公司(產(chǎn)品目錄號(hào):E2241)。pGL3_Basic載體(該質(zhì)粒具有編碼螢火蟲突光素酶的基因):購(gòu)買自promoga公司(產(chǎn)品目錄號(hào):E1751)。promegaDual-Glo Luciferase Assay System:購(gòu)買自 Promega 公司(產(chǎn)品目錄號(hào):E1910)。實(shí)施例1、啟動(dòng)子的發(fā)現(xiàn)在KAP6.1基因及其已知啟動(dòng)子序列的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)將已知啟動(dòng)子序列向5’側(cè)翼區(qū)延長(zhǎng)481bp得到的新啟動(dòng)子具有更高的啟動(dòng)目的基因表達(dá)的活性。將序列表的序列I自5’末端第488至1529位核苷酸所示的啟動(dòng)子命名為啟動(dòng)子甲(已知啟動(dòng)子)。將序列表的序列I自5’末端第7至1529位核苷酸所示的啟動(dòng)子命名為啟動(dòng)子乙(本發(fā)明提供的啟動(dòng)子)。實(shí)施例2、啟動(dòng)子的功能驗(yàn)證Fl:5，-ctagctagcCTGCAGTTCATGGGGTCAC-3’ ；F2:5’ -ctagctagcTCCGTTTTACTAAGAAGCATTTT-3’ ；R: 5 ’ -ccgctcgagGGTGTTGCTTGTTGAGGTTG-3，。
一、重組質(zhì)粒甲的構(gòu)建1、提取敖漢細(xì)毛羊的基因組DNA。2、以步驟I提取的基因組DNA為模板，用Fl和R組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖見(jiàn)圖1(M為2kb marker, 1、2、3為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物)。PCR 反應(yīng)條件:95°C，5min ;95°C 30s、60°C 30s、72°C 1.5min，35 個(gè)循環(huán)；72°C延伸7min。3、用限制性內(nèi)切酶NheI和XhoI雙酶切步驟2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。4、用限制性內(nèi)切酶NheI和XhoI雙酶切pGL3_Basic載體，回收約4805bp的載體骨架。5、將步驟3的酶切產(chǎn)物和步驟4的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒甲。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，對(duì)重組質(zhì)粒甲進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下:在pGL3_Basic載體的NheI和XhoI酶切位點(diǎn)之間插入了序列表的序列I自5’末端第488至1529位核苷酸所示的雙鏈DNA分子。二、重組質(zhì)粒乙的構(gòu)建1、提取敖漢細(xì)毛羊的基因組DNA。2、以步驟I提取的基因組DNA為模板，用F2和R組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂 糖凝膠電泳圖見(jiàn)圖2(M為2kb marker, 1、2、3為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物)。3、用限制性內(nèi)切酶NheI和XhoI雙酶切步驟2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。4、用限制性內(nèi)切酶NheI和XhoI雙酶切pGL3_Basic載體，回收約4805bp的載體骨架。5、將步驟3的酶切產(chǎn)物和步驟4的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒乙。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，對(duì)重組質(zhì)粒乙進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下:在pGL3_Basic載體的NheI和XhoI酶切位點(diǎn)之間插入了序列表的序列I自5’末端第7至1529位核苷酸所示的雙鏈DNA分子。三、啟動(dòng)子的功能驗(yàn)證用于培養(yǎng)綿羊皮膚組織原代細(xì)胞的培養(yǎng)基為含20% (體積比)胎牛血清(購(gòu)買自invitrogen公司，貨號(hào)為:16000-044)、lg/100mL非必須氨基酸(購(gòu)買自invitrogen公司，目錄號(hào):11140-050)、100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基(購(gòu)買自invitrogen公司，目錄號(hào):C11995)。綿羊皮膚組織原代細(xì)胞的培養(yǎng)條件:5%C02，37°C恒溫培養(yǎng)，I 2d傳代一次。1、取50日齡的敖漢細(xì)毛羊胎羊的皮膚組織，貼壁法培養(yǎng)獲得綿羊皮膚組織原代細(xì)胞。2、將綿羊皮膚組織原代細(xì)胞鋪入6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，5 X IO5個(gè)細(xì)胞/孔，貼壁培養(yǎng)24h后(細(xì)胞匯合度達(dá)到80%或90%)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染采用Invitrogen Lipofectamine2000脂質(zhì)體進(jìn)行并按說(shuō)明書進(jìn)行操作(每孔細(xì)胞中加入10 μ I Lipofectamine2000),分組處理如下:第一組:每孔共轉(zhuǎn)染4 μ g重組質(zhì)粒甲和0.08 μ g pRL-TK質(zhì)粒；第二組:每孔共轉(zhuǎn)染4 μ g重組質(zhì)粒乙和0.08 μ g pRL-TK質(zhì)粒；第三組:每孔共轉(zhuǎn)染4 μ g pGL3-Basic載體和0.08 μ g pRL-TK質(zhì)粒；
第四組:不進(jìn)行任何處理。以上每組設(shè)置六個(gè)復(fù)孔。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后收集每孔中的細(xì)胞,采用promega Dual-Glo Luciferase AssaySystem并按說(shuō)明書進(jìn)行熒光素酶活性檢測(cè)，利用TACAN F200儀器檢測(cè)螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶與底物反應(yīng)的發(fā)光值。螢火蟲熒光素酶發(fā)光值與海腎熒光素酶發(fā)光值的比值為螢火蟲熒光素酶的相對(duì)活性。各組處理后，細(xì)胞的螢火蟲熒光素酶的相對(duì)活性結(jié)果見(jiàn)圖3。結(jié)果表明:第三組處理后的細(xì)胞和第四組處理后的細(xì)胞均沒(méi)有檢測(cè)到螢火蟲熒光素酶發(fā)光；第一組處理后的細(xì)胞和第二組處理后的細(xì)胞均能檢測(cè)到螢火蟲熒光素酶發(fā)光，且第二組處理后的細(xì)胞的螢火蟲熒光素酶發(fā)光強(qiáng)度高于第一組處理后的細(xì)胞，即啟動(dòng)子乙啟動(dòng)下游基因表達(dá)的能力高于啟動(dòng)子甲。`
權(quán)利要求
1.一種DNA分子，為如下I)或2)或3):1)序列表的序列I所不的DNA分子；2)在嚴(yán)格條件下與I)限定的DNA序列雜交且具有啟動(dòng)子功能的DNA分子；3)與I)限定的DNA序列具有90%以上同源性且具有啟動(dòng)子功能的DNA分子。
2.含有權(quán)利要求1所述DNA分子的表達(dá)盒、重組載體、重組菌或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
3.權(quán)利要求1所述DNA分子作為啟動(dòng)子的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求1所 述DNA分子在啟動(dòng)目的基因表達(dá)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種啟動(dòng)子及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的啟動(dòng)子，獲自敖漢細(xì)毛羊，為如下1)或2)或3)所述的DNA分子1)序列表的序列1所示的DNA分子；2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA序列雜交且具有啟動(dòng)子功能的DNA分子；3)與1)限定的DNA序列具有90%以上同源性且具有啟動(dòng)子功能的DNA分子。本發(fā)明公開(kāi)了一種啟動(dòng)子，與現(xiàn)有啟動(dòng)子相比具有更高的啟動(dòng)目的基因表達(dá)的活性，可以滿足目的基因在綿羊皮膚組織中的表達(dá)要求，滿足目的基因在毛囊組織中高效特異性表達(dá)的要求。本發(fā)明不僅能用于毛發(fā)細(xì)度、彎曲和毛囊發(fā)育中基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制的研究，而且對(duì)轉(zhuǎn)基因超細(xì)毛美利奴綿羊的培育也起到了促進(jìn)作用。
文檔編號(hào)C12N1/15GK103243099SQ201310170810
公開(kāi)日2013年8月14日 申請(qǐng)日期2013年5月10日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月10日
發(fā)明者鄧學(xué)梅, 楊祖, 崔凱 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)