專利名稱：用于檢測蜂蜜的組合物、試劑盒、檢測方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及用于檢測蜂蜜中蜜源植物成分的寡核苷酸引物和探針，包含所述引物和探針的試劑盒，以及使用所述引物和探針或試劑盒檢測蜂蜜中蜜源植物成分的方法。本發(fā)明還涉及所述弓I物和探針在檢測蜂蜜中蜜源植物成分中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
蜂蜜，是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，與自身分泌物結(jié)合后，經(jīng)充分釀造而成的天然甜味物質(zhì)。蜜源植物種類繁多，如油菜蜜、槐花蜜、荊條蜜、棗花蜜、龍眼蜜、荔枝蜜等等。不同蜜源蜂蜜價格相差較大，高端價位如龍眼蜜和荔枝蜜，低端價位如油菜蜜等。蜂蜜摻假中一種較為普遍的做法是將低價蜜源蜂蜜摻入高價蜜源蜂蜜。針對這類摻假，傳統(tǒng)的檢測方法，如感官法、物理性狀、化學(xué)成分分析等，由于受到生產(chǎn)、加工、貯藏條件影響存在很多不確定性。分子生物學(xué)技術(shù)通過檢測植物物種特異性基因片段來判斷蜜源，具有特異性強，靈敏度高，不易受環(huán)境條件干擾，結(jié)果穩(wěn)定等優(yōu)點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，簡單、快速、特異且靈敏地檢測蜂蜜中的荔枝、龍眼、洋槐、油菜蜜源植物成分。通過本發(fā)明，不僅能檢測蜂蜜中花粉沉淀中提取的DNA，而且能檢測蜂蜜上清中提取的DNA，能有效防止蜂蜜中添加花粉或過濾花粉的造假方式。本發(fā)明的發(fā)明人根據(jù)油菜的隱花色素2b基因，設(shè)計了能夠特異性檢測油菜成分的引物和探針；根據(jù)洋 槐葉綠體pseudoacacia maturase K基因,設(shè)計了特異性檢測洋槐成分的引物和探針；根據(jù)荔枝成熟酶K基因，設(shè)計了能同時特異性檢測荔枝和龍眼成分的引物和探針。根據(jù)龍眼葉綠體鐵超氧化物歧化酶(FSDlb)基因，設(shè)計了特異性檢測龍眼成分的引物和探針。這些基因靶序列小于lOObp，保證能從蜂蜜沉淀及上清中檢測目標(biāo)植物成分。所述油菜特異性上游引物為fcas-cry-F:GAGGATAACCCCGCACTAGC(SEQ ID N0.1),下游引物為 Bras-cry-R:GGTGGGAGCCAAGAGACTTC(SEQ ID N0.2);探針為 fcas-cry-P: TTTTCATTTGGTGCCCTGAAGAAGAAGG(SEQ ID N0.3)，在探針的3’端連接有一個熒光淬滅基團TAMRA，5’端連接有一個熒光報告基團FAM。洋槐特異性上游引物為Rob-matK-F:GCTCAACCAGGAACGATC (SEQ ID N0.4),下游引物為 Rob-matK-R:GCAGCATTTGACTACGTACCA (SEQ ID N0.5)；探針為 Rob-matK-P:CATAAACCTATTATCCGAACATTCATTTCA(SEQ ID N0.6)，在探針的 3’ 端連接有一個熒光淬滅基團TAMRA，5’端連接有一個熒光報告基團FAM。龍眼和荔枝特異性上游引物為 Lit-matK-F: TCATGTGTGGTCTCAACCCG (SEQ ID N0.7),下游引物為 LitiatK-R:CGTCGCCGACTGGAAAGATA (SEQ ID N0.8);探針為 Lit-matK_P:TTACACAAAGATTCTATCAACTTTCTGGGC(SEQ ID N0.9)，在探針的3’端連接有一個熒光淬滅基團TAMRA，5’端連接有一個熒光報告基團FAM。龍眼特異性上游引物為Longan-FSD-F:CCCAAGCTTCCTGATTGGGT(SEQ IDN0.10),下游引物為 Longan-FSD-R:AGGTGGTGTTTGTCGCTTCT (SEQ ID N0.11);探針為 Longan-FSD-P:CTTCATTGAAAGAAAGGCATAACTAG(SEQ ID N0.12)，在探針的 3’端連接有一個熒光淬滅基團TAMRA，5’端連接有一個熒光報告基團FAM。一方面，本發(fā)明提供了用于通過實時熒光PCR方法鑒別蜂蜜中蜜源植物成分的組合物，所述組合物包含選自以下(I)至(4)中的任意一組或多組引物和探針序列:(I)油菜特異性寡核苷酸引物對SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2以及探針SEQ IDN0.3序列；(2)洋槐特異性寡核苷酸引物對SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.5以及探針SEQ IDN0.6序列；(3)荔枝和龍眼特異性寡核苷酸引物對SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.8以及探針SEQID N0.9 序列；(4)龍眼特異性寡核苷酸引物對SEQ ID N0.10和SEQ ID N0.11以及探針SEQ IDN0.12序列。在一個實施方式中，在探針的3’端連接有熒光淬滅基團，5’端連接有熒光報告基團。在一個實施方式中，所述熒光淬滅基團為TARMA，所述熒光報告基團為FAM。在本發(fā)明中，蜜源植物為荔枝、龍眼、洋槐和油菜中的一種或多種。另一方面，本發(fā)明提供了用于通過實時熒光PCR方法鑒別蜂蜜中蜜源植物成分的試劑盒，所述試劑盒包括本發(fā)明的所述組合物。

在一個實施方案，本發(fā)明提供了用于快速檢測蜂蜜中荔枝、洋槐、油菜、龍眼蜜源植物成分的試劑盒，所述試劑盒包括本發(fā)明的用于實時熒光PCR方法檢測蜂蜜中荔枝、洋槐、油菜、龍眼蜜源植物成分的特異性寡核苷酸引物對以及探針和使用說明書。在優(yōu)選的實施方案中，所述試劑盒還包括用于樣品DNA提取的試劑和用于PCR反應(yīng)的試劑。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述試劑盒的使用說明書中包括對用于快速檢測蜂蜜中荔枝、洋槐、油菜、龍眼蜜源植物成分的PCR擴增的條件的描述。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述試劑盒的說明書中給出的PCR擴增條件是:95°C，IOmin ；95°C 15s，60°C lmin，40個循環(huán)。在一個具體的實施方案中，本發(fā)明的用于檢測蜂蜜中荔枝、洋槐、油菜、龍眼蜜源植物成分的試劑盒還包括標(biāo)準(zhǔn)品和對照品。優(yōu)選地，對照品包括陽性對照品和陰性對照品。在一個實施方案中，陰性對照為無菌雙蒸水。再一方面，本發(fā)明提供了蜂蜜中蜜源植物成分鑒別的實時熒光PCR檢測方法，所述方法包括使用本發(fā)明的所述組合物或試劑盒。在一個實施方式中，PCR擴增條件是95°C，IOmin ；95°C 15s，60°C lmin，40個循環(huán)。優(yōu)選地，本發(fā)明所使用的實時熒光PCR方法為Taqman熒光探針法。在一個實施方案中，本發(fā)明的蜂蜜中荔枝、龍眼、洋槐、油菜蜜源植物成分實時熒光PCR檢測方法還進一步包括提取樣品總DNA和確定特異性寡核苷酸引物和探針組合的相對檢測限的步驟。在本發(fā)明中，所述實時熒光PCR檢測方法檢測出荔枝或龍眼成分的檢測限為
0.0005ng/l.! L，洋槐成分的檢測限為0.0005ng/μ L，油菜成分的檢測限為0.005ng/l.! L，龍眼成分的檢測限為0.005ng/y L。
在本發(fā)明中，所述實施熒光PCR檢測方法檢測荔枝蜜與油菜蜜混樣沉淀DNA，其中荔枝成分檢測限為0.1%，油菜成分的檢測限為0.1% ;上清DNA中荔枝成分檢測限為0.1%，油菜成分檢測限為5%。在本發(fā)明中，所述實施熒光PCR檢測方法檢測龍眼蜜與洋槐蜜混樣沉淀DNA，其中龍眼成分檢測限為1%，洋槐成分的檢測限為0.1% ;上清DNA中龍眼成分檢測限為1%，洋槐成分檢測限為0.1%。再在一方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的所述組合物或所述試劑盒在鑒別蜂蜜中蜜源植物成分中的應(yīng)用。實時熒光定量PCR即在常規(guī)PCR方法的基礎(chǔ)上，加入熒光標(biāo)記的探針或者熒光染料，隨著PCR產(chǎn)物的積累，探針或染料發(fā)出的熒光信號增強，而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每產(chǎn)生一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。因此可以實時監(jiān)控整個PCR反應(yīng)過程，并最終檢測出待測樣品的初始拷貝數(shù)，從而可檢測待測蜜源植物成分。本發(fā)明的實時熒光PCR檢測方法可采用完全閉管檢測，無需PCR后處理，避免了交叉污染和假陽性。本發(fā)明的方法巧妙地運用了 PCR技術(shù)的DNA高效擴增、核酸雜交的特異性和熒光檢測技術(shù)的快速和敏感性，具有操作簡單、省時省力、結(jié)果可靠和準(zhǔn)確靈敏等優(yōu)點。使用本發(fā)明的實時熒光PCR檢測方法，其簡單、快速、特異且靈敏的特點適合用于國內(nèi)外市場上蜂蜜蜜源植物的檢測。


圖1是利用實時熒光PCR特異性檢測油菜DNA(Crypt0Chr0me2b)區(qū)序列時，油菜樣品出現(xiàn)典型的擴增曲線。其中使用油菜特異性寡核苷酸引物對SEQ ID N0.1和SEQ IDN0.2和探針SEQ ID N0.3檢測，熒光曲線編號與樣品對應(yīng)如下:1.油菜；2.荔枝；3.洋槐；4.紫云英；5.梨；6.蘋果；7.桃；8.大豆；9.大麥；10.大米；11.黃瓜；12.胡蘿卜；13.桂圓；14.桔子；15.荊條；16.銀杏；17.枇杷；18.棗；19.枸杞；20.月季；21.蜜蜂；22.狗；23.鹿；24.駱駝；25.馬；26.牛；27.鴨；28.羊；29.魚；30.豬；31.空白；圖1中的橫坐標(biāo)為PCR循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)為PCR相對熒光單位值。圖2是利用實時突光PCR特異性檢測洋槐DNA(pseudoacacia maturase K)序列時，洋槐樣品出現(xiàn)典型的擴增曲線。其中使用洋槐特異性寡核苷酸引物對SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.5和探針SEQ ID N0.6檢測，熒光曲線編號與樣品對應(yīng)如下:1.洋槐；2.荔枝；
3.油菜；4.紫云英；5.梨；6.蘋果；7.桃；8.大豆；9.大麥；10.大米；11.黃瓜；12.胡蘿卜；13.桂圓；14.桔子；15.荊條；16.銀杏；17.枇杷；18.棗；19.枸杞；20.月季；21.蜜
蜂；22.狗；23.鹿；24.駱駝；25.馬；26.牛；27.鴨；28.羊；29.魚；30.豬；31.空白；圖2中的橫坐標(biāo)為PCR循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)為PCR相對熒光單位值。圖3是利用實時熒光PCR特異性檢測荔枝DNA (成熟酶K)序列時，荔枝和龍眼樣品出現(xiàn)典型的擴增曲線。其中使用荔枝和龍眼特異性寡核苷酸引物對SEQ ID N0.7和SEQ IDN0.8和探針SEQ ID N0.9檢測，熒光曲線編號與樣品對應(yīng)如下:1.荔枝；2.龍眼；3.油菜；
4.紫云英；5.梨；6.蘋果； 7.桃；8.大豆；9.大麥；10.大米；11.黃瓜；12.胡蘿卜；13.洋槐；14.桔子；15.荊條；16.銀杏；17.枇杷；18.棗；19.枸杞；20.月季；21.蜜蜂；22.狗；23.鹿；24.駱駝；25.馬；26.牛；27.鴨；28.羊；29.魚；30.豬；31.空白；圖3中的橫坐標(biāo)為PCR循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)為PCR相對熒光單位值。圖4是利用實時熒光PCR特異性檢測龍眼DNA (鐵超氧化物歧化酶)序列時，龍眼樣品出現(xiàn)典型的擴增曲線。其中使用龍眼特異性寡核苷酸引物對SEQ ID N0.10和SEQ IDN0.11和探針SEQ ID N0.12檢測，熒光曲線編號與樣品對應(yīng)如下:1.龍眼；2.荔枝；3.油菜；4.紫云英；5.梨；6.蘋果；7.桃；8.大豆；9.大麥；10.大米；11.黃瓜；12.胡蘿卜；13.洋槐；14.桔子；15.荊條；16.銀杏；17.枇杷；18.棗；19.枸杞；20.月季；21.蜜蜂；22.狗；23.鹿；24.駱駝；25.馬；26.牛；27.鴨；28.羊；29.魚；30.豬；31.空白；圖4中的橫坐標(biāo)為PCR循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)為PCR相對熒光單位值。圖5-圖8分別是檢測油菜、洋槐、荔枝和龍眼、龍眼特異性寡核苷酸引物和探針組合的靈敏度的結(jié)果，進行實時熒光PCR擴增的DNA溶液的濃度依次為50ng/l.! l、5ng/l.! 1、
0.5ng/y 1、0.05ng/y 1、0.005ng/y 1、0.0005ng/μ 1，其中熒光曲線編號與濃度對應(yīng)如下:I:50ng/μ I ；2:5ng/μ I ；3:0.5ng/μ I ；4:0.05ng/μ I ；5:0.005ng/μ I ；6:0.0005ng/μ I ;7:空白對照，圖中的橫坐標(biāo)為PCR循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)為PCR相對熒光單位值。圖9和圖10是以油菜蜜和荔枝蜜為例，確定荔枝和龍眼特異性寡核苷酸引物和探針組合的實際檢測靈敏度，將油菜蜜和荔枝蜜按比例混合，使荔枝蜜的比例達到100%、99.9%、90%、50%、10%、5%、1%和0.1%。其中熒光曲線編號與荔枝蜜比例對應(yīng)如下:1:陽性對照；2:100% ；3:99.9% ；4:90% ；5:50% ；6:10% ；7:5% ；8:1% ；9:0.1% ；10:空白對照。圖 9 是蜂蜜沉淀中DNA的檢測結(jié)果，圖10是蜂蜜上清DNA的檢測結(jié)果。圖中的橫坐標(biāo)為PCR循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)為PCR相對熒光單位值。圖11和圖12是以油菜蜜和荔枝蜜為例，確定油菜特異性寡核苷酸引物和探針組合的實際檢測靈敏度，將油菜蜜和荔枝蜜按比例混合，使油菜蜜的比例達到100%、99.9%、90%、50%、10%、5%、1%和0.1%。其中熒光曲線編號與油菜蜜比例對應(yīng)如下:1: 100% ；2:99.9% ；3:90% ；4:10% ；5:5% ；6:1% ；7:0.1% ；8:空白對照。圖 11 是蜂蜜沉淀中 DNA 的檢測結(jié)果，圖12是蜂蜜上清DNA的檢測結(jié)果。圖中的橫坐標(biāo)為PCR循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)為PCR相對熒光單位值。圖13和圖14是以洋槐蜜和龍眼蜜為例，確定龍眼特異性寡核苷酸引物和探針組合的實際檢測靈敏度，將洋槐蜜和龍眼蜜按比例混合，使龍眼蜜的比例達到100%、99.9%、90%、50%、10%、5%、1%和0.1%。其中熒光曲線編號與龍眼蜜比例對應(yīng)如下:1: 100% ; 2:99.9% ；3:90% ；4:10% ；5:5% ；6:1% ；7:0.1% ；8:空白對照。圖 13 是蜂蜜沉淀中 DNA 的檢測結(jié)果，圖14是蜂蜜上清DNA的檢測結(jié)果。圖中的橫坐標(biāo)為PCR循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)為PCR相對熒光單位值。圖15和圖16是以洋槐蜜和龍眼蜜為例，確定洋槐特異性寡核苷酸引物和探針組合的實際檢測靈敏度，將洋槐蜜和龍眼蜜按比例混合，使洋槐蜜的比例達到100%、99.9%、90%、50%、10%、5%、1%和0.1%。其中熒光曲線編號與洋槐蜜比例對應(yīng)如下:1: 100% ；2:99.9% ；3:90% ；4:10% ；5:5% ；6:1% ；7:0.1% ；8:空白對照。圖 15 是蜂蜜沉淀中 DNA 的檢測結(jié)果，圖16是蜂蜜上清DNA的檢測結(jié)果。圖中的橫坐標(biāo)為PCR循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)為PCR相對熒光單位值。
具體實施例方式以下通過實施例的方式對本發(fā)明作進一步的說明，但是本發(fā)明并不僅僅局限于以下實施例。實施例1本實施例為通過如下試驗對荔枝和龍眼、洋槐、油菜、龍眼的引物和探針進行了特異性和靈敏度驗證。檢測主要試劑:氯仿、異丙醇分別購于北京六合通公司；CTAB裂解液(20g/L CTAB, 1.4mol/LNaCl，0.lmol/L Tris、0.02mol/L Na2-EDTA)、CTAB 沉淀液(5g/L CTAB，0.04mol/L NaCl)、
1.2mol/L NaCl 均為本實驗自行配制；Fast Start Universal Probe MasterMix (Rox)購于羅氏公司；引物及探針由上海奧科生物科技有限公司合成等。檢測主要步驟:I) DNA 提取檢測樣本:30份樣品，包括洋槐、蒸枝、油菜、紫云英、梨、蘋果、桃、大豆、大麥、大米、黃瓜、胡蘿卜、桂圓、桔子、荊條、銀杏、枇杷、率、枸杞、月季、蜜蜂、狗、鹿、駱騎、馬、牛、鴨、羊、魚、豬，用于特異性分析。稱取洋槐、荔枝、油菜、紫云英、梨、蘋果、桃、大豆、大麥、大米、黃瓜、胡蘿卜、桂圓、桔子、荊條、銀杏、枇杷、率、枸杞、月季、蜜蜂、狗、鹿、駱騎、馬、牛、鴨、羊、魚、豬樣品各0.1g至一潔凈2.0mL離心管中，加入1.5mLCTAB裂解液，6 5°C作用2h，間期不斷混勻幾次；4°C、8000rpm離心15min,取ImL上清液至I只潔凈2.0mL離心管中，加入700 μ L氯仿，劇烈混勻30s,4°C> 14500rpm離心IOmin,分別取650 μ L上清液至潔凈2.0mL離心管中，加入1300 μ L CTAB沉淀液，劇烈混勻30s，室溫靜置Ih ；4°C 14500rpm離心20min，棄上清液，加入350 μ L1.2Μ NaCl，劇烈振蕩30s,再加入350 μ L氯仿，劇烈混勻30s，4。。、14500rpm離心IOmin ;分別取上清液320 μ L，加入0.8倍體積異丙醇，混勻后，-20°C lh，4°C、14500rpm離心20min,棄上清液,加入500 μ L70%乙醇,混勻后,4°C、14500rpm離心20min,棄上清液，晾至風(fēng)干，加入100 μ L ddH20溶解，4°C儲存?zhèn)溆谩Ｉ鲜鰷y試樣品通過以上所述方法提取DNA。蜂蜜樣品使用商業(yè)化DNA提取試劑盒(例如 Nucleospin,德國 Macheney-Nagel 公司)提取。2)實時熒光PCR檢測所用引物和探針?biāo)褂玫挠筒颂禺愋怨押塑账嵋飳τ缮嫌我锖拖掠我锝M成，所述上游引物的喊基序列為SEQ ID N0.1，所述下游引物的喊基序列為SEQ ID N0.2 ;所使用的探針的喊基序列為SEQ ID N0.3，在探針的3’端連接有一個熒光淬滅基團TAMRA，5’端連接有一個熒光報告基團FAM。所使用的洋槐特異性寡核苷酸引物對由上游引物和下游引物組成，所述上游引物的堿基序列為SEQ ID N0.4，所述下游引物的堿基序列為SEQ ID N0.5 ;所使用的探針的堿基序列為SEQ ID N0.6，在探針的3’端連接有一個熒光淬滅基團TAMRA，5’端連接有一個熒光報告基團FAM。所使用的荔枝和龍眼特異性寡核苷酸引物對由上游引物和下游引物組成，所述上游引物的喊基序列為SEQ ID N0.7,所述下游引物的喊基序列為SEQ ID N0.8;所使用的探針的堿基序列為SEQ ID N0.9，在探針的3’端連接有一個熒光淬滅基團TAMRA，5’端連接有一個突光報告基團FAM。所使用的龍眼特異性寡核苷酸引物對由上游引物和下游引物組成，所述上游引物的堿基序列為SEQ ID N0.10，所述下游引物的堿基序列為SEQ ID N0.11 ;所使用的探針的堿基序列為SEQ ID N0.12，在探針的3’端連接有一個熒光淬滅基團TAMRA，5’端連接有一個熒光報告基團FAM。3)實時熒光PCR反應(yīng)體系:TaqMan Universal PCR Master Mix 12.5 μ L探針(10μ Μ) 2μ L上游引物(10μ Μ) I μ L下游引物(10μ Μ) I μ L模板DNA 5 μ L加ddH20至總體積為25 μ L注:每次PCR檢測均設(shè)立相應(yīng)的空白對照(用配制反應(yīng)體系的超純水代替DNA模板，檢測試劑是否受到污染)；4)實時熒光PCR反應(yīng)參數(shù):95°C>IOmin ；95°C> 15s,60°C>lmin,40 個循環(huán)。注:不同儀器應(yīng)將PCR各試劑及反應(yīng)參數(shù)做適當(dāng)調(diào)整。如圖1所示,利用實時突光PCR特異性檢測油菜DNA(cryptochrome2b)區(qū)序列時，油菜樣品出現(xiàn)典型的擴增曲線，而其它樣品:荔枝、洋槐、紫云英、梨、蘋果、桃、大豆、大麥、大米、黃瓜、胡蘿卜、桂圓、桔子、荊條、銀杏、枇杷、率、枸杞、月季、蜜蜂、狗、鹿、駱騎、馬、牛、鴨、羊、魚、豬、空白均未出現(xiàn)擴增曲線，充分說明本實驗設(shè)計的油菜特異性寡核苷酸引物和探針對油菜樣品表現(xiàn)優(yōu)異的特異性。如圖2所示,利用實時突光PCR特異性檢測洋槐DNA(pseudoacacia maturase K)序列時，洋槐樣品出現(xiàn)典型的擴增曲線，而其它樣品:荔枝、油菜、紫云英、梨、蘋果、桃、大豆、大麥、大米、黃瓜、胡蘿卜、桂圓、桔子、荊條、銀杏、枇杷、率、枸杞、月季、蜜蜂、狗、鹿、駱駝、馬、牛、鴨、羊、魚、豬、空白均未出現(xiàn)擴增曲線，充分說明本實驗設(shè)計的洋槐特異性寡核苷酸引物和探針對洋槐樣品表現(xiàn)優(yōu)異的特異性。如圖3所示，利用實時熒光PCR特異性檢測荔枝DNA (成熟酶K)序列時，荔枝和龍眼樣品出現(xiàn)典型的擴增曲線，而其它樣品:油菜、洋槐、紫云英、梨、蘋果、桃、大豆、大麥、大米、黃瓜、胡蘿卜、桔子、荊條、銀杏、枇杷、率、枸杞、月季、蜜蜂、狗、鹿、駱騎、馬、牛、鴨、羊、魚、豬、空白均未出現(xiàn)擴增曲線，充分說明本實驗設(shè)計的荔枝特異性寡核苷酸引物和探針對荔枝和龍眼樣品表現(xiàn)特異性。如圖4所示，利用實時熒光PCR特異性檢測龍眼DNA(鐵超氧化物歧化酶)序列時，龍眼樣品出現(xiàn)典型的擴增曲線，而其它樣品:油菜、洋槐、荔枝、紫云英、梨、蘋果、桃、大豆、大麥、大米、黃瓜、胡蘿卜、桔子、荊條、銀杏、枇杷、率、枸杞、月季、蜜蜂、狗、鹿、駱騎、馬、牛、鴨、羊、魚、豬、空白均未出現(xiàn)擴增曲線，充分說明本實驗設(shè)計的龍眼特異性寡核苷酸引物和探針對龍眼樣品表現(xiàn)特異性。為確定油菜特異性寡核苷酸引物和探針組合的絕對檢測限，將提取的油菜DNA溶液用無菌水分別稀釋為 50ng/ μ l、5ng/ μ I, 0.5ng/ μ 1、0.05ng/ μ 1、0.005ng/ μ I 和
0.0005ng/ μ I的濃度，分別按上述條件進行實時熒光PCR擴增，結(jié)果如圖5所示，上述油菜DNA濃度50ng/l.! 1-0.005ng/μ 1，均有特異性擴增曲線出現(xiàn)，重復(fù)性良好。實驗結(jié)果表明建立的實時熒光PCR檢測方法能夠檢出油菜成分的含量至少為0.005ng/l.! I。為確定洋槐特異性寡核苷酸引物和探針組合的絕對檢測限，將提取的洋槐DNA溶液用無菌水分別稀釋為 50ng/ μ 1、5ng/ μ 1、0.5ng/ μ 1、0.05ng/ μ 1、0.005ng/ μ I 和
0.0005ng/ μ I的濃度，分別按上述條件進行實時熒光PCR擴增，結(jié)果如圖6所示。上述6個洋槐DNA濃度，均有特異性擴增曲線出現(xiàn)，重復(fù)性良好。實驗結(jié)果表明建立的實時熒光PCR檢測方法能夠檢出洋槐成分的含量至少為0.0005ng/l.! I。為確定荔枝和龍眼特異性寡核苷酸引物和探針組合的絕對檢測限，將提取的荔枝DNA 溶液用無菌水分別稀釋為 50ng/ μ l、5ng/ μ 1、0.5ng/ μ 1、0.05ng/ μ 1、0.005ng/ μ I 和
0.0005ng/ μ I的濃度，分別按上述條件進行實時熒光PCR擴增，結(jié)果如圖7所示。上述6個荔枝DNA濃度，均有特異性擴增曲線出現(xiàn)， 重復(fù)性良好。實驗結(jié)果表明建立的實時熒光PCR檢測方法能夠檢出荔枝成分的含量至少為0.0005ng/y I。為確定龍眼特異性寡核苷酸引物和探針組合的絕對檢測限，將提取的龍眼DNA溶液用無菌水分別稀釋為 50ng/ μ 1、5ng/ μ 1、0.5ng/ μ 1、0.05ng/ μ 1、0.005ng/ μ I 和
0.0005ng/ μ I的濃度，分別按上述條件進行實時熒光PCR擴增，結(jié)果如圖8所示。龍眼DNA濃度50ng/l.! 1-0.005ng/μ 1，均有特異性擴增曲線出現(xiàn)，重復(fù)性良好。實驗結(jié)果表明建立的實時熒光PCR檢測方法能夠檢出龍眼成分的含量為0.005ng/l.! I。實施例2本發(fā)明的發(fā)明人通過如下試驗對收集的蜂蜜樣品進行了驗證。選取油菜蜜、荔枝蜜、洋槐蜜、龍眼蜜及其混合物進行實時熒光PCR反應(yīng)，以確定所建立的實時熒光PCR方法的可行性、特異性、實際靈敏度等。在本實施例中，使用的特異性探針和進行實時熒光PCR檢測的實驗操作條件如實施例I中所述。常規(guī)地，擴增待測樣品時，重復(fù)3次出現(xiàn)I次以上陽性信號即代表檢測結(jié)果為陽性。以荔枝蜜和油菜蜜的混合物為例，用荔枝蜜和油菜蜜按不同比例混合。如圖9所示，荔枝蜜和油菜蜜的比例分別為100%、99.9%、90%、50%、10%、5%、1%和0.1%。利用Nucleospin試劑盒從混合物的沉淀物中提取DNA后使用蒸枝特異性引物和探針組合進行實時突光PCR,結(jié)果說明可以檢測到0.1%的蒸枝蜜。如圖10所示,利用Nucleospin試劑盒從上述蜂蜜混合物上清中提取DNA，使用荔枝特異性引物和探針組合進行實時熒光PCR，結(jié)果說明可以檢測到0.1%的荔枝蜜。以荔枝蜜和油菜蜜的混合物為例，用荔枝蜜和油菜蜜按不同比例混合。如圖11所示，油菜蜜和荔枝蜜的比例分別為100%、99.9%、90%、50%、10%、5%、1%和0.1%。利用Nucleospin試劑盒從混合物的沉淀物中提取DNA后使用油菜特異性引物和探針組合進行實時熒光PCR，結(jié)果說明可以檢測到0.1%的油菜蜜。如圖12所示，從上述蜂蜜混合物上清中提取DNA，使用油菜特異性引物和探針組合進行實時熒光PCR，結(jié)果說明可以檢測到5%的油菜蜜。
以龍眼蜜和洋槐蜜的混合物為例，用龍眼蜜和洋槐蜜按不同比例混合。如圖13所示，龍眼蜜和洋槐蜜的比例分別為100%、99.9%、90%、50%、10%、5%、1%、0.1%。分別從混合物的沉淀物中提取DNA后使用龍眼特異性引物和探針組合進行實時熒光PCR，結(jié)果說明可以檢測到1%的龍眼蜜。如圖14所示，從上述蜂蜜混合物上清中提取DNA，使用龍眼特異性引物和探針組合進行實時熒光PCR，結(jié)果說明可以檢測到1%的龍眼蜜。以龍眼蜜和洋槐蜜的混合物為例，用龍眼蜜和洋槐蜜按不同比例混合。如圖15所示，洋槐蜜和龍眼蜜的比例分別為100%、99.9%、90%、50%、10%、5%、1%、0.1%。分別從混合物的沉淀物中提取DNA后使用洋槐特異性引物和探針組合進行實時熒光PCR，結(jié)果說明可以檢測到0.1%的洋槐蜜。如圖16所示，從上述蜂蜜混合物上清中提取DNA，使用洋槐特異性引物和探針組合進行實時熒光PCR，結(jié)果說明可以檢測到0.1%的洋槐蜜。雖然已經(jīng)對本發(fā)明的具體實施方案進行了描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)認識到，在不偏離本發(fā)明的范圍或精神的前提下可以對本發(fā)明進行多種改變與修飾。因而，本發(fā)明意欲涵蓋落在權(quán)利要求書 及其同等物范圍內(nèi)的所有這些改變與修飾。
權(quán)利要求
1.用于通過實時熒光PCR方法鑒別蜂蜜中蜜源植物成分的組合物，所述組合物包含選自以下(I)至(4)中的任意一組或多組引物和探針序列: Cl)油菜特異性寡核苷酸引物對SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2以及探針SEQ ID N0.3序列； (2)洋槐特異性寡核苷酸引物對SEQID N0.4和SEQ ID N0.5以及探針SEQ ID N0.6序列； (3)荔枝和龍眼特異性寡核苷酸引物對SEQID N0.7和SEQ ID N0.8以及探針SEQ IDN0.9序列； (4)龍眼特異性 寡核苷酸引物對SEQID N0.10和SEQ ID N0.11以及探針SEQ ID N0.12序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中，在探針的3’端連接有熒光淬滅基團，5’端連接有熒光報告基團。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的組合物，其中所述熒光淬滅基團為TAMRA，所述熒光報告基團為 FAM。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的組合物，其中，蜜源植物為荔枝、龍眼、洋槐和油菜中的一種或多種。
5.用于通過實時熒光PCR方法鑒別蜂蜜中蜜源植物成分的試劑盒，所述試劑盒包括權(quán)利要求1-4中任一項所述的組合物。
6.鑒別蜂蜜中蜜源植物成分的實時熒光PCR檢測方法，所述方法包括使用權(quán)利要求1-4中任一項所述的組合物或權(quán)利要求5所述的試劑盒。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的實時熒光PCR檢測方法，其為Taqman熒光探針法。
8.權(quán)利要求1-4中任一項所述的組合物或權(quán)利要求5所述的試劑盒在鑒別蜂蜜中蜜源植物成分中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于蜂蜜中龍眼、荔枝、洋槐、油菜蜜源植物成分檢測的寡核苷酸引物及探針，包含所述引物及探針的試劑盒，以及利用其檢測蜂蜜中上述蜜源植物成分的方法。通過本發(fā)明，能夠簡單、快速、特異且靈敏地檢測蜂蜜中的上述蜜源植物成分。
文檔編號C12Q1/68GK103215373SQ20131017081
公開日2013年7月24日 申請日期2013年5月10日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月10日
發(fā)明者吳亞君, 陳穎, 王斌, 劉明暢, 韓建勛 申請人:中國檢驗檢疫科學(xué)研究院