來源于大豆的干旱誘導(dǎo)啟動子GmMYB363P及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了來源于大豆的干旱誘導(dǎo)啟動子GmMYB363P及其應(yīng)用。GmMYB363P，是如下a）、b）或c）的DNA分子：a）核苷酸序列是SEQ?ID?No.1的DNA分子；b）與a）限定的核苷酸序列具有75%或75%以上一致性，且具有啟動子功能的DNA分子；c）在高嚴謹條件下與a）或b）限定的核苷酸序列雜交，且具有啟動子功能的DNA分子。GmMYB363P為干旱誘導(dǎo)型啟動子。利用GmMYB363P可以使基因在干旱誘導(dǎo)條件下表達，因而避免了組成型啟動子過量表達帶來的負作用—產(chǎn)生大量的異源蛋白和有毒物質(zhì)。
【專利說明】來源于大豆的干旱誘導(dǎo)啟動子GmMYB363P及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及來源于大豆的干旱誘導(dǎo)啟動子GmMYB363P及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 啟動子（Promoter)是基因組基因的一個重要組成部分，它像"開關(guān)"一樣，在轉(zhuǎn)錄 水平上基本決定其控制下的編碼基因是否表達、何時表達、何處表達和表達強度。一般根據(jù) 啟動子作用方式和功能將其大體可以分為三大類：組成型啟動子、特異性啟動子和誘導(dǎo)型 啟動子。組成型啟動子（Constitutive promoter)是指能夠驅(qū)使其控制下的編碼基因在不 同器官和/或組織大體恒定表達的一類啟動子。它的特點是：受其控制的編碼基因的表達 具有持續(xù)性，但不具有時空特異性；RNA和蛋白質(zhì)表達量相對恒定，不受外界因素的誘導(dǎo)。 誘導(dǎo)型啟動子（Inducible promoter)是指能夠響應(yīng)某些特定的物理、化學(xué)和生物信號（統(tǒng) 稱為"誘導(dǎo)子"或"誘導(dǎo)因子")而驅(qū)動其控制的編碼基因大幅度地增加轉(zhuǎn)錄水平的一類啟動 子。誘導(dǎo)型啟動子常常根據(jù)其誘導(dǎo)信號來分類和命名，例如：真菌誘導(dǎo)啟動子、共生細菌誘 導(dǎo)啟動子、化學(xué)誘導(dǎo)啟動子、金屬離子誘導(dǎo)啟動子、光誘導(dǎo)啟動子、熱誘導(dǎo)啟動子和創(chuàng)傷誘 導(dǎo)啟動子等。器官和/或組織特異性啟動子（〇rgan-and/or Tissue-specific promoter), 能夠驅(qū)使其控制下的編碼基因僅僅在生物體的某一或某些特定的器官和/或組織，或者僅 僅在生長發(fā)育的某一或某些特定階段表達的一類基因。它的特征為，受其控制或調(diào)節(jié)的基 因表達具有明顯的時空性，并往往表現(xiàn)出發(fā)育調(diào)節(jié)的特性。例如，植物上的根特異性啟動 子、葉片特異性啟動子、花特異性啟動子、氣孔特異性啟動子、氣孔絨氈層特異性啟動子、花 粉特異性啟動子、果實特異性啟動子、種子特異性啟動子、胚乳特異性啟動子、棉花纖維特 異性啟動子和韌皮部特異性啟動子等等。
[0003] 在自然環(huán)境中，植物生長在開放的系統(tǒng)中，經(jīng)常會遇到冷、熱、旱、澇、鹽堿、大氣 污染等不良環(huán)境的影響。不良環(huán)境作用于植物，將會引起植物體內(nèi)發(fā)生一系列的生理代謝 反應(yīng)，表現(xiàn)為代謝和生長的可逆性抑制，嚴重時甚至引起不可逆?zhèn)Γ瑢?dǎo)致整個植株死亡。 在各種環(huán)境脅迫中，干旱、低溫、高熱和高鹽等非生物脅迫對植物的影響尤為突出，表現(xiàn)為 不同程度地對植物體內(nèi)水分狀況的影響，因此又成為水分脅迫，是制約植物生長和農(nóng)作物 產(chǎn)量的最主要非生物性逆境因子。植物在長期的進化中，逐漸形成了一系列應(yīng)答逆境脅迫 的生理、代謝以及防御系統(tǒng)。從植物中克隆非生物逆境誘導(dǎo)啟動子將為提高植物對非生物 脅迫的抗性奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供植物受干旱誘導(dǎo)啟動子。
[0005] 本發(fā)明所提供的啟動子，名稱為GmMYB363P，來源于大豆，是如下a)、b)或c)的DNA 分子：
[0006] a)核苷酸序列是SEQ ID No. 1的DNA分子；
[0007] b)與a)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上一致性，且具有啟動子功能的DNA 分子；
[0008] c)在高嚴謹條件下與a)或b)限定的核苷酸序列雜交，且具有啟動子功能的DNA 分子。
[0009] 其中，SEQ ID No. 1由1384個核苷酸組成。
[0010] 上述75%或75%以上一致性，可為80%、85%、90%、95%以上的一致性。
[0011] 所述高嚴謹條件是指，將雜交膜置于預(yù)雜交液（〇. 25mol/L磷酸鈉緩沖液，pH7. 2， 7%SDS)中，65°C預(yù)雜交30min ;棄預(yù)雜交液，加入雜交液（0. 25mol/L磷酸鈉緩沖液，pH7. 2， 7%SDS，同位素標記的核苷酸片段)，65°C雜交12hr ;棄雜交液，加入洗膜液I (20mmol/L磷酸 鈉緩沖液，PH7. 2, 5%SDS)，65°C洗膜2次，每次30min ;加入洗膜液II (20mmol/L磷酸鈉緩沖 液，ρΗ7· 2,1%SDS)，65°C洗膜 30min。
[0012] 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以很容易地采用已知的方法，例如定向進化和點突變的方 法，對本發(fā)明的啟動子核苷酸序列進行突變。那些經(jīng)過人工修飾的，具有與本發(fā)明分離得 到的啟動子核苷酸序列70%或者更高同源性的核苷酸，只要保持了表達靶基因的啟動子活 性，均是衍生于本發(fā)明的核苷酸序列并且等同于本發(fā)明的序列。
[0013] 這里使用的術(shù)語"同源性"指與天然核酸序列的序列相似性。"同源性"包括與本 發(fā)明的啟動子核苷酸序列具有優(yōu)選地75%或更高，更優(yōu)選地85%或更高，甚至更優(yōu)選地90% 或更高，以及最優(yōu)選地95%或更高同一性的核苷酸序列。同源性可以用肉眼或計算機軟件 進行評價。使用計算機軟件，兩個或多個序列之間的同源性可以用百分比（％)表示，其可以 用來評價相關(guān)序列之間的同源性。
[0014] 含有GmMYB363P的表達盒、重組載體、重組微生物或轉(zhuǎn)基因細胞系也屬于本發(fā)明 的保護范圍。
[0015] 所述含有GmMYB363P的表達盒，是指能夠在宿主細胞中表達目的基因的DNA， 該DNA不但包括啟動所述目的基因的GmMYB363P，還可包括終止所述目的基因轉(zhuǎn)錄的 終止子。進一步，所述表達盒還可包括增強子序列。所述轉(zhuǎn)錄終止子包括但不限于：農(nóng) 桿菌胭脂堿合成酶終止子（N0S終止子)、花椰菜花葉病毒CaMV35S終止子、tml終止子、 豌豆rbcS E9終止子和胭脂氨酸和章魚氨酸合酶終止子（參見，例如：0dell等人（I985) Nature 313:810 ;Rosenberg 等人（1987)Gene, 56:125 ;Guerineau 等人（1991)Mol. Gen. Genet, 262:141;Proudfoot(1991)Cell, 64:671;Sanfacon 等人 Genes Dev.，5:141;Mogen 等人（1990)卩13拉〇611，2:1261以11111'〇6等人（1990)66116,91:151;83113(1等人（1989) Nucleic Acids Res. 17:7891 Joshi 等人（1987)Nucleic Acid Res.，15:9627)。
[0016] 所述的含有GmMYB363P的重組載體具體可為用SEQ ID No. 1的第1-1384位所示 的啟動子GmMYB363P替換pCAMBIA-1301的Hind III和Bgl II之間片段得到的⑶S基因重 組表達載體pCAMBIA-1301-GmMYB363P-⑶S。所述重組微生物具體可為細菌，酵母，藻和 真菌。其中，細菌可來自埃希氏菌屬（Escherichia),歐文氏菌（Erwinia),根癌農(nóng)桿菌屬 (Agrobacterium)、黃桿菌屬（Flavobacterium)，產(chǎn)喊菌屬（Alcaligenes)，假單胞菌屬 (Pseudomonas),芽胞桿菌屬（Bacillus)等。所述的轉(zhuǎn)基因細胞系不包括動物和植物的繁 殖材料。
[0017] 本發(fā)明中，攜帶有GmMYB363P的植物表達載體可通過使用包含但不限于Ti質(zhì)粒、 Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化 植物細胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成植株。
[0018] 擴增GmMYB363P全長或其任一片段的引物對也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0019] 實驗證明，GmMYB363P可在4%分子量為6000的聚乙二醇（PEG6000)水溶液模擬的 干旱脅迫誘導(dǎo)下啟動目的基因在的表達。
[0020] GmMYB363P可用于培育轉(zhuǎn)基因植物，該轉(zhuǎn)基因植物在干旱脅迫誘導(dǎo)下能增加目的 基因的表達量。
[0021] 上述應(yīng)用中，所述植物可為單子葉植物或雙子葉植物，如大豆。
[0022] 所述轉(zhuǎn)基因植物理解為不僅包含將目的基因轉(zhuǎn)化目的植物得到的第一代轉(zhuǎn)基因 植物，也包括其子代。對于轉(zhuǎn)基因植物，可以在該物種中繁殖該基因，也可用常規(guī)育種技術(shù) 將該基因轉(zhuǎn)移進入相同物種的其它品種，特別包括商業(yè)品種中。所述轉(zhuǎn)基因植物包括種子、 愈傷組織、完整植株和細胞。
[0023] 本發(fā)明的GmMYB363P為干旱誘導(dǎo)型啟動子。利用GmMYB363P可以使基因在干旱誘 導(dǎo)條件下表達，因而避免了組成型啟動子過量表達帶來的負作用一產(chǎn)生大量的異源蛋白和 有毒物質(zhì)。本發(fā)明的GmMYB363P對通過目的基因在干旱脅迫下的高表達來提高轉(zhuǎn)基因植物 耐旱性有重要意義。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0024] 圖1為植物表達載體pCAMBIA-1301-GmMYB363P -⑶S示意圖。
[0025] 圖中，GmMYB363promoter 表示 GmMYB363P。
[0026] 圖2為轉(zhuǎn)pCAMBIA-1301-GmMYB363P -⑶S毛狀根在水中或4%PEG6000水溶液中培 養(yǎng)12小時后的GUS染色圖。
[0027] 圖2中，左圖為轉(zhuǎn)pCAMBIA-1301-GmMYB363P -⑶S毛狀根在水中培養(yǎng)12小時后的 ⑶S染色圖；右圖為轉(zhuǎn)pCAMBIA-1301-GmMYB363P -⑶S毛狀根在4%PEG6000水溶液中培養(yǎng) 12小時后的GUS染色圖。

【具體實施方式】
[0028] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明，但本發(fā)明并不限于以下實施例。
[0029] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0030] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0031] 大豆南農(nóng)1138-2 (由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)國家大豆改良中心提供，公眾可從中國科學(xué)院 遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得，以重復(fù)本申請的實驗，記載在文獻w. K. Zhang，Y. J. Wang，G. Z. Luo, J. S. Zhang, C. Y. He, X. L. Wu, J. Y. Gai, S. Y. Chen, QTL mapping of ten agronomic traits on the soybean (Glycine max L Merr.) genetic map and their association with EST markers，Theor.Appl. Genet，2004, 108:1131-1139)。
[0032] 大豆科豐 1 號（Glycine max L· Merr. Kefeng 1)記載在胃.1(.211&叫，￥.<1.他叫，6· Z. Luo, J. S. Zhang, C. Y. He, X. L. Wu, J. Y. Gai, S. Y. Chen, QTL mapping of ten agronomic traits on the soybean (Glycine max L Merr.) genetic map and their association with EST markers，Theor. Appl. Genet，2004, 108:1131-1139 中，公眾可以從中國科學(xué)院遺 傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得，以重復(fù)本申請的實驗。
[0033] 植物表達載體 pCAMBIA-1301，記載于 Zheng SJ, et al.，Molecular characterization of transgenic shallots(Allium cepa L.)by adaptor ligation PCR(AL-PCR)and sequencing of genomic DNA flanking T-DNA borders, Transgenic Res. 2001，10(3) : 237-45。
[0034] 發(fā)根農(nóng)桿菌 K599 記載在 Attila Kereszt, et al.，Agrobacterium rhizogenes-mediaded transformation of soybean to study of root biology, Nature Protocols, 2007, 2(4)，549-552)中，公眾可從Peter M Gressnon教授，The University of Queensland, St Lucia, Queensland4072, Australia獲得，或經(jīng)Peter M Gressnon教授同意 (書面同意書）后由中科院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得，以重復(fù)本申請的實驗。
[0035] 實施例1、干旱誘導(dǎo)啟動子GmMYB363P的克隆及轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建
[0036] 一、干旱誘導(dǎo)啟動子GmMYB363P的克隆
[0037] 發(fā)明人將大豆南農(nóng)1138-2基因組進行了 99X測序和拼接，構(gòu)建了基因組物理圖 譜。根據(jù)測序數(shù)據(jù)，獲得了啟動子GmMYB363P區(qū)域序列，據(jù)此，設(shè)計了啟動子GmMYB363P序 列的克隆引物，正向引物中含有Hind III識別序列，反向引物中含有BamH I識別序列：
[0038] 正向：5, -AAGCTTATCTACCACGGAGACAA-3' ；
[0039] 反向：5, -GGATCCGGATCTATCTTTGCCTT-3'。
[0040] 用上述引物以大豆南農(nóng)1138-2的基因組DNA為模板，擴增得到1384bp的擴增產(chǎn) 物，將該PCR擴增產(chǎn)物與pMD18-T克隆載體連接后測序。將測序結(jié)果表明含有SEQ ID No. 1 的第1-1384位所示的DNA分子的重組載體命名為pMD18-T-GmMYB363P。其中，SEQ ID No. 1 由1384個核苷酸組成，為啟動子GmMYB363P的核苷酸序列。
[0041] 二、重組表達載體的構(gòu)建
[0042] 由于BamH I的酶切識別位點為5' G~GATCC3'，而Bgl II的酶切識別位 點為5' A~GATCT 3'，因此上述兩個酶切片段可連接。Hind III和BamH I雙酶切 pMD18-T-GmMYB363P，回收 GmMYB363P 片段并與 Hind III和 Bgl II 酶切后的 pCAMBIA-1301 (GenBank:AF234297. 1)植物表達載體連接，得到由啟動子GmMYB363P啟動⑶S基因轉(zhuǎn)錄的 重組表達載體 pCAMBIA-1301-GmMYB363P -⑶S。經(jīng)測序證實，pCAMBIA-1301-GmMYB363P -⑶S為用SEQ ID No. 1的第1-1384位所示的啟動子GmMYB363P替換pCAMBIA-1301的Hindlll 和Bgl II之間片段得到的⑶S基因重組表達載體。
[0043] 實施例2、利用啟動子GmMYB363P培育轉(zhuǎn)基因大豆
[0044] 運用發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因毛狀根方法，將pCAMBIA-1301-GmMYB363P -⑶S轉(zhuǎn)化 到發(fā)根農(nóng)桿菌K599中。
[0045] 發(fā)根農(nóng)桿菌侵染法根據(jù)Attila Kereszt等方法（Attila Kereszt, et al. , Agrobacterium rhizogenes-mediaded transformation of soybean to study of root biology, Nature Protocols, 2007, 2 (4)，549-552)進行，該方法獲得的新生毛狀根多 于96%均為轉(zhuǎn)基因毛狀根。
[0046] 具體操作如下：
[0047] 1)首先將含有⑶S基因的pCAMBIA-1301-GmMYB363P -⑶S，通過電擊法導(dǎo)入發(fā)根 農(nóng)桿菌K599中，得到重組農(nóng)桿菌。提取重組農(nóng)桿菌的質(zhì)粒，用PCR方法鑒定重組農(nóng)桿菌中 所含啟動子GmMYB363P，所用引物為
[0048] 正向：5' -AAGCTTATCTACCACGGAGACAA-3' ；
[0049] 反向：5, -GGATCCGGATCTATCTTTGCCTT-3，。
[0050] 將鑒定結(jié)果表明含有SEQ ID No. 1的第1-1384位所示的啟動子GmMYB363P的重 組農(nóng)桿菌命名為K599/GmMYB363P。
[0051] 2)大豆科豐1號種子播種于蛭石中，待長出2片真葉待用。
[0052] 3)在含有50mg/L卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基中劃線活化K599/GmMYB363P，挑單菌 落在含有50mg/L卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中搖菌過夜，得到K599/GmMYB363P發(fā)根農(nóng)桿菌 菌液。
[0053] 4)用步驟3)得到的K599/GmMYB363P發(fā)根農(nóng)桿菌菌液，用注射器接種6天含兩片 真葉的步驟2)獲得的大豆幼苗，保濕生長：光照16小時，溫度25°C，濕度50%。2周后，長 出毛狀根。
[0054] 當毛狀根長度為5 - 10厘米時，剪去老根，新的毛狀根即為轉(zhuǎn)化的根，可進一步用 于鑒定。
[0055] 將新的轉(zhuǎn)pCAMBIA-1301-GmMYB363P -⑶S毛狀根分為兩組，每組10根，一組 置于水中培養(yǎng)，一組置于4%PEG6000水溶液中，12小時后分別進行⑶S染色。將毛狀根 直接放在下列染色液：50!111似?04?!17.2水溶液，21111乂1111(3,0.511111^^(0幻 6，&11(1 0.5mM K4Fe (CN)6中，37°C過夜，毛狀根經(jīng)系列濃度70、50、30%乙醇洗(脫色），之后 放在重蒸水中，觀察，結(jié)果如圖2所示，可以看出，經(jīng)GUS染色表明在水中培養(yǎng)12小時的 轉(zhuǎn)pCAMBIA-1301-GmMYB363P -⑶S毛狀根顯示⑶S染色較淺，表明GmMYB363P啟動子驅(qū) 動⑶S基因的表達較弱；而在4%PEG6000水溶液處理12小時后，GmMYB363P啟動子受誘 導(dǎo)，驅(qū)動⑶S基因的表達，因此轉(zhuǎn)基因毛狀根經(jīng)染色后呈現(xiàn)明顯的深藍色。按照Cote等 方法（Cote C et al. , An improved MUG fluorescent assay for the determination of the GUS activity within transgenic tissue of woody plants, Plant Cell R印·，2003, 21 (6)，619-624)對水中培養(yǎng) 12 小時的轉(zhuǎn) pCAMBIA-1301-GmMYB363P -⑶S 毛狀根和在4%PEG6000水溶液處理12小時的轉(zhuǎn)pCAMBIA-1301-GmMYB363P -⑶S毛狀 根進行GUS基因表達的熒光定量分析，結(jié)果顯示在4%PEG6000水溶液培養(yǎng)12小時的轉(zhuǎn) pCAMBIA-1301-GmMYB363P -⑶S 毛狀根的⑶S 活性值為 287±20nmol 4-MU mirT1!!^1 蛋白， 水中培養(yǎng)12小時的轉(zhuǎn)pCAMBIA-1301-GmMYB363P -⑶S毛狀根的⑶S活性值為64± 13nmol 4-MU 蛋白，⑶S基因的表達在PEG模擬的干旱脅迫情況下是水中（正常情況）的 4. 5倍。上述結(jié)果表明啟動子GmMYB363P受干旱誘導(dǎo)。
[0056] 聚乙二醇6000 (PEG6000)是親水性大分子，具有很強的吸水性，可以使植物失水， 造成干旱脅迫。所以本實施例采用PEG6000來模擬干旱。
【權(quán)利要求】
1. 如下a)、b)或C)的DNA分子： a) 核苷酸序列是SEQ ID No. 1的DNA分子； b) 與a)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上一致性，且具有啟動子功能的DNA分 子； c) 在高嚴謹條件下與a)或b)限定的核苷酸序列雜交，且具有啟動子功能的DNA分子。
2. 含有權(quán)利要求1所述DNA分子的表達盒。
3. 含有權(quán)利要求1所述DNA分子的重組載體，或含有權(quán)利要求2所述表達盒的重組載 體。
4. 含有權(quán)利要求1所述DNA分子的重組微生物、含有權(quán)利要求2所述表達盒的重組微 生物、或含有權(quán)利要求3所述重組載體的重組微生物。
5. 含有權(quán)利要求1所述DNA分子的轉(zhuǎn)基因細胞系、含有權(quán)利要求2所述表達盒的轉(zhuǎn)基 因細胞系、或含有權(quán)利要求3所述重組載體的轉(zhuǎn)基因細胞系。
6. 擴增權(quán)利要求1所述的DNA分子全長或其任一片段的引物對。
7. 權(quán)利要求1所述的DNA分子作為啟動子的應(yīng)用。
8. 權(quán)利要求1所述的DNA分子在干旱脅迫誘導(dǎo)下啟動目的基因在植物中表達的應(yīng)用。
9. 權(quán)利要求1所述的DNA分子在培育轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于：所述轉(zhuǎn)基因植物為轉(zhuǎn)基因大豆。
【文檔編號】C12N15/113GK104152454SQ201310174327
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2013年5月13日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月13日
【發(fā)明者】張勁松, 陳受宜, 李擎天, 馬彪, 劉云峰, 張萬科, 林晴, 何鍶潔 申請人:中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所