一種致敏動(dòng)物的脾細(xì)胞模型及其在藥物篩選中的用途
【專利摘要】本發(fā)明屬于藥學(xué)藥物篩選領(lǐng)域，涉及一種致敏動(dòng)物的脾細(xì)胞模型及其用途。本發(fā)明采用空腸彎曲菌CJ-S131誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生SLE樣癥狀，無(wú)菌條件下，制備其脾臟單細(xì)胞懸液；在培養(yǎng)板中加入空腸彎曲菌CJ-S131，再次刺激已致敏的脾細(xì)胞，制得致敏動(dòng)物的脾細(xì)胞模型，并采用具有抗SLE作用的藥物，驗(yàn)證該模型在制備防治系統(tǒng)性紅斑狼瘡藥物中的用途。本發(fā)明還提供了采用制得的脾細(xì)胞模型建立離體篩選抗SLE相關(guān)藥物的方法，實(shí)現(xiàn)抗SLE藥物的高通量篩選；該離體篩選抗SLE相關(guān)藥物的方法彌補(bǔ)了現(xiàn)有篩選抗SLE藥物不能高通量進(jìn)行的缺陷，同時(shí)顯著地縮短了普通SLE模型評(píng)價(jià)的周期。
【專利說(shuō)明】一種致敏動(dòng)物的脾細(xì)胞模型及其在藥物篩選中的用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于藥學(xué)藥物篩選領(lǐng)域，涉及細(xì)胞模型及其用途，具體涉及一種致敏動(dòng)物 的脾細(xì)胞模型及其在藥物篩選中的用途；所述模型可用于建立離體藥物篩選，尤其作為篩 選防治系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE)藥物的高通量篩選平臺(tái)。

【背景技術(shù)】
[0002] 已知系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE)是一種難治的、反復(fù)發(fā)作、致死率高的嚴(yán)重自身免疫 病；雖然所述SLE的病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，但患者均存在免疫調(diào)節(jié)功能嚴(yán)重失 調(diào)，機(jī)體高水平的抗自身抗體和低水平的單核巨噬細(xì)胞清除能力，使免疫復(fù)合物增多，并廣 泛性激活補(bǔ)體系統(tǒng)，造成機(jī)體的炎癥擴(kuò)大和組織器官損傷，同時(shí)使機(jī)體對(duì)自身抗原的識(shí)別 長(zhǎng)期存在，造成病情的遷延不愈。
[0003] 有研究報(bào)道，針對(duì)SLE患者能檢測(cè)到多種自身抗體的產(chǎn)生，如抗核抗體，抗雙鏈 DNA抗體(抗dsDNA抗體)，抗組蛋白抗體等；且由于其免疫調(diào)節(jié)障礙，能引起丙種球蛋白升 高，以及相關(guān)細(xì)胞因子分泌的改變，如干擾素(IFN-γ)、白細(xì)胞介素-10 (IL-10)和白 細(xì)胞介素-17 (IL-17)等的水平升高。
[0004] 目前，國(guó)內(nèi)外抗SLE藥物研究中采用的動(dòng)物模型有自發(fā)性的SLE模型(如MRL/ lpr)和空腸彎曲菌誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性模型等，上述模型證實(shí)了環(huán)境因素對(duì)免疫耐受的維持和遺 傳因素起著同樣至關(guān)重要的作用；但其中所述動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，不能實(shí)現(xiàn)藥物高通 量篩選；由于空腸彎曲菌CJ-S131的43KD的熱休克蛋白和LPS均具有與機(jī)體自身抗原相 似的抗原表位(分子模擬現(xiàn)象)，細(xì)菌成分作為交叉抗原進(jìn)入體內(nèi)，產(chǎn)生應(yīng)激，引起一系列免 疫反應(yīng)，T細(xì)胞活化后通過(guò)旁路途徑輔助B細(xì)胞多克隆激活，引起自身抗體的產(chǎn)生，使得空 腸彎曲菌可誘導(dǎo)小鼠形成具有典型的SLE樣癥狀，該模型為目前研究SLE病理機(jī)制及尋 找治療藥物較理想的模型之一。
[0005] 柴胡是我國(guó)的傳統(tǒng)中藥和常用中藥，其性味苦涼，有疏散退熱、疏肝解郁、升陽(yáng)舉 氣之功效，用于治療寒熱往來(lái)，胸滿脅痛，口苦耳聾，頭痛目眩等。以柴胡為主藥的小柴 胡湯性較平和，具有和解少陽(yáng)之功，以清泄樞機(jī)之熱為特點(diǎn)，有報(bào)道用于熱毒熾盛型SLE， 療效顯著；已有文獻(xiàn)（ZhengWang, Hong Li, et al. Beneficial effect of Bupleurum polysaccharides on autoimmune disease induced by Campylobacter jejuni in BALB/ c mice. Journal of Ethnopharmacology. 2009; 124: 481-487.)報(bào)道，柴胡多糖對(duì) SLE 樣小鼠具有保護(hù)作用，能選擇性抑制補(bǔ)體激活，并對(duì)小鼠免疫功能具有調(diào)節(jié)作用。鑒于目前 國(guó)內(nèi)外均缺乏離體高通量篩選制備防治系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE)藥物的方法，本申請(qǐng)的發(fā)明 人擬提供一種致敏動(dòng)物的脾細(xì)胞模型，并采用所述柴胡多糖驗(yàn)證該脾細(xì)胞模型在離體高通 量篩藥方面的特性，進(jìn)一步建立離體高通量篩選制備防治系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE)藥物的方 法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種致敏動(dòng)物的脾細(xì)胞模型及其在藥物篩選中的用途。該致 敏動(dòng)物的脾細(xì)胞模型實(shí)驗(yàn)周期短、能實(shí)現(xiàn)藥物高通量篩選。
[0007] 本發(fā)明的致敏動(dòng)物的脾細(xì)胞模型通過(guò)下述方法制備，采用空腸彎曲菌CJ-S131誘 導(dǎo)建立小鼠 SLE樣模型，取模型鼠脾臟細(xì)胞，用CJ-S131離體刺激，制得SLE樣表現(xiàn)的離體 模型；該離體模型表現(xiàn)出SLE相關(guān)免疫指標(biāo)升高，所述SLE相關(guān)免疫指標(biāo)包括：抗dsDNA抗 體、總 IgG、IFN-γ 和 IL-10。
[0008] 更具體的，本發(fā)明的致敏動(dòng)物的脾細(xì)胞模型的制備方法，其特征在于，其包括步 驟： 采用空腸彎曲菌CJ-S131誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生SLE樣癥狀，按常規(guī)方法處理實(shí)驗(yàn)小鼠，無(wú)菌條 件下取其脾臟，制備單細(xì)胞懸液；在培養(yǎng)板中加入空腸彎曲菌CJ-S131，再次刺激已致敏的 脾細(xì)胞，制得致敏動(dòng)物的脾細(xì)胞模型。
[0009] 本發(fā)明進(jìn)一步采用具有抗SLE作用的藥物柴胡多糖，驗(yàn)證上述離體模型在藥物篩 選中的用途，尤其是在制備防治系統(tǒng)性紅斑狼瘡藥物中的用途。
[0010] 本發(fā)明中，在制得的脾細(xì)胞模型中加入不同濃度的待測(cè)藥物柴胡多糖，置于37°C、 5% C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h ;培養(yǎng)結(jié)束后，吸取培養(yǎng)板中的細(xì)胞培養(yǎng)上清，檢測(cè)抗dsDNA抗體、總 IgG、IFN- γ和IL-10等疾病相關(guān)免疫學(xué)指標(biāo)，結(jié)果顯示，SLE相關(guān)病變指標(biāo)中，細(xì)胞培養(yǎng)上 清液中抗dsDNA抗體、總IgG、相關(guān)炎癥因子IFN- γ和IL-10水平明顯升高； 結(jié)果表明，采用本發(fā)明制得的脾細(xì)胞模型可用于篩選防治系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE)的藥 物。
[0011] 本發(fā)明還提供了一種離體篩選抗SLE相關(guān)藥物的方法，實(shí)現(xiàn)抗SLE藥物的高通量 篩選；其步驟包括： (1) 建立SLE相關(guān)免疫異常細(xì)胞模型： 通過(guò)空腸彎曲菌CJ-S131再刺激疾病模型鼠脾細(xì)胞，成功建立離體SLE樣表現(xiàn)的炎癥 模型； (2) 采用SLE樣細(xì)胞模型篩選藥物； (3 )抗dsDNA抗體測(cè)定： (4) 總IgG測(cè)定： (5) IFN-γ 測(cè)定： (6) IL-10 測(cè)定： 篩選出防治系統(tǒng)性紅斑狼瘡的藥物。
[0012] 本發(fā)明中，所述的SLE疾病在病理上的顯著特征是患者體內(nèi)自身抗體的產(chǎn)生；所 述自身抗體包括抗雙鏈DNA抗體(抗dsDNA抗體)、抗核抗體等；本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，離 體未刺激時(shí)，模型組與正常對(duì)照組以及佐劑對(duì)照組相比，抗dsDNA抗體的水平已顯著升高， 表明整體動(dòng)物SLE樣模型造模成功；而離體脾細(xì)胞經(jīng)CJ-S131再刺激后，模型組的抗dsDNA 抗體的水平進(jìn)一步升高，且與對(duì)照組相比均有顯著性差異；此外，SLE疾病過(guò)程中，由于免 疫調(diào)節(jié)障礙，引起總免疫球蛋白IgG蛋白升高，以及相關(guān)細(xì)胞因子分泌的改變，如IFN-γ、 IL-10、IL-17等；本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，離體再刺激之前，總IgG、IFN-γ、IL-10的水平 在模型組和對(duì)照組之間無(wú)明顯差異，而離體脾細(xì)胞經(jīng)空腸彎曲菌CJ-S131再刺激后，模型 組的總IgG、IFN- γ、IL-10的水平較對(duì)照組均顯著升高； 上述檢測(cè)結(jié)果表明，通過(guò)空腸彎曲菌CJ-S131再刺激疾病模型鼠脾臟細(xì)胞，成功建立 了 SLE樣表現(xiàn)的炎癥模型；而所述柴胡多糖對(duì)該SLE離體藥物篩選模型有明顯的保護(hù)作用， 表現(xiàn)為明顯改善疾病相關(guān)免疫指標(biāo)的作用，證實(shí)了所述離體篩藥方法的有效性。
[0013] 本發(fā)明所述的離體篩選抗SLE相關(guān)藥物的方法，具有以下優(yōu)點(diǎn)： 取經(jīng)CJ-S131免疫過(guò)的脾細(xì)胞，采用CJ-S131離體再刺激，建立離體藥物篩選平臺(tái)，脾 細(xì)胞表現(xiàn)出SLE相關(guān)免疫指標(biāo)的改變；可實(shí)現(xiàn)對(duì)抗SLE藥物的高通量篩選，縮短了實(shí)驗(yàn)周 期，同時(shí)簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)條件和步驟。
[0014] 本發(fā)明在空腸彎曲菌誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性SLE模型中期結(jié)束整體建模，取已對(duì)空腸彎曲 菌CJ-S131建立了免疫反應(yīng)的脾細(xì)胞，通過(guò)離體空腸彎曲菌的再刺激，進(jìn)一步建立了離體 SLE樣表現(xiàn)脾細(xì)胞的篩藥方法；本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)中，采用離體給藥后，收集上述模型細(xì)胞培養(yǎng) 上清，檢測(cè)SLE相關(guān)的免疫學(xué)指標(biāo)，可有針對(duì)性地觀察藥效；觀察采用細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)免疫 后脾細(xì)胞對(duì)藥物的反應(yīng)，可快速篩選抗SLE藥物，實(shí)現(xiàn)高通量新藥篩選，極大地縮短了試驗(yàn) 周期。
[0015] 本發(fā)明所述離體篩選抗SLE相關(guān)藥物的方法，彌補(bǔ)了現(xiàn)有篩選抗SLE藥物不能高 通量進(jìn)行的缺陷，同時(shí)顯著地縮短了普通SLE模型評(píng)價(jià)的周期，操作過(guò)程簡(jiǎn)便，使實(shí)驗(yàn)更加 便捷。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0016] 圖1顯示了 SLE樣小鼠脾細(xì)胞分泌抗dsDNA抗體測(cè)定結(jié)果。
[0017] 圖2顯示了 SLE樣小鼠脾細(xì)胞分泌總IgG測(cè)定結(jié)果。
[0018] 圖3顯示了 SLE樣小鼠脾細(xì)胞分泌IFN- γ測(cè)定結(jié)果。
[0019] 圖4顯示了 SLE樣小鼠脾細(xì)胞分泌IL-10測(cè)定結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0020] 實(shí)施案例1建立SLE相關(guān)免疫功能異常的細(xì)胞模型 實(shí)驗(yàn)采用的動(dòng)物包括：正常對(duì)照鼠、佐劑對(duì)照鼠、SLE模型鼠（CJ-S131誘導(dǎo)的SLE樣 模型）小鼠；處死小鼠，無(wú)菌操作取出脾臟放入盛有預(yù)冷的1640培養(yǎng)液的表面皿中，制備得 脾單細(xì)胞懸液并調(diào)節(jié)脾細(xì)胞濃度，取細(xì)胞培養(yǎng)板，分別加入CJ-S131和脾細(xì)胞懸液；加完板 后，輕輕混勻，置于37°C、5% C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h。培養(yǎng)結(jié)束后，離心，吸取每孔的細(xì)胞上清 液，分裝后放入-80°C冰箱保存，用于檢測(cè)抗dsDNA抗體、IgG、IFNi和IL-10等指標(biāo)。
[0021] 實(shí)施例2離體篩選抗SLE相關(guān)藥物，實(shí)現(xiàn)抗SLE藥物的高通量篩選 (1)建立SLE相關(guān)免疫異常細(xì)胞模型： 實(shí)驗(yàn)采用：正常對(duì)照鼠、佐劑對(duì)照鼠、SLE模型鼠（CJ-S131誘導(dǎo)的SLE樣模型)小鼠；常 規(guī)處理實(shí)驗(yàn)小鼠，無(wú)菌操作取出脾臟放入盛有預(yù)冷的1640培養(yǎng)液的表面皿中；制得脾單細(xì) 胞懸液并調(diào)節(jié)脾細(xì)胞濃度，取細(xì)胞培養(yǎng)板，分別加入CJ-S131和脾細(xì)胞懸液；加板后，混勻， 置于37°C、5% C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h ;培養(yǎng)結(jié)束后，離心，吸取每孔的細(xì)胞上清液，分裝后，放 入-80°C冰箱保存，用于檢測(cè)抗dsDNA抗體、IgG、IFN-γ和IL-10等指標(biāo)；檢測(cè)結(jié)果為，離 體脾細(xì)胞經(jīng)CJ-S131再刺激后，模型組的抗dsDNA抗體的水平進(jìn)一步升高，且與對(duì)照組相比 均有顯著性差異；離體再刺激之前，總IgG、IFN-γ、IL-10的水平在模型組和對(duì)照組之間無(wú) 明顯差異，而離體脾細(xì)胞經(jīng)空腸彎曲菌CJ-S131再刺激后，模型組的總IgG、IFN-γ、IL-10 的水平較對(duì)照組均顯著升高； 述檢測(cè)結(jié)果表明，通過(guò)空腸彎曲菌CJ-S131再刺激疾病模型鼠脾細(xì)胞，成功建立了離 體SLE樣表現(xiàn)的炎癥模型； (2)采用SLE樣細(xì)胞模型篩選藥物 實(shí)驗(yàn)采用：SLE模型鼠（CJ-S131誘導(dǎo)的SLE樣模型）小鼠；常規(guī)處理小鼠，無(wú)菌操作取 出脾臟放入盛有預(yù)冷的1640培養(yǎng)液的表面皿中，制得脾單細(xì)胞懸液并調(diào)節(jié)脾細(xì)胞濃度，取 細(xì)胞培養(yǎng)板，分別加入待測(cè)藥物，CJ-S131和脾細(xì)胞懸液，加完板后，輕輕混勻，置于37°C、5% C〇2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h后，離心，吸取每孔的細(xì)胞上清液，分裝后放入-80°C冰箱保存，用于檢 測(cè)抗dsDNA抗體、IgG、IFN- γ和IL-10等指標(biāo)； (3 )抗dsDNA抗體測(cè)定： 50 μ g/ml dsDNA 包被酶標(biāo)板，4°C過(guò)夜；PBS-1%BSA 封閉，100 μ 1/ 孔，37°C 孵育 2h ; PBS-T洗滌，加待測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清原液，100ul/孔，35C孵育2h ;加1:1000稀釋的羊抗小鼠 IgG-HRP，37°C孵育2h ;加1/1000稀釋的羊抗兔IgG-HRP酶標(biāo)抗體，37°C孵育lh ;加入0PD 底物溶液，37°C避光孵育20min ;加入2M H2S04終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀492nm測(cè)定0D ; 結(jié)果顯示，未刺激時(shí)，模型組與正常對(duì)照組以及佐劑對(duì)照組相比，抗dsDNA抗體的水平 已顯著升高；而離體CJ-S131再刺激脾細(xì)胞后，模型組的抗dsDNA抗體的水平進(jìn)一步升高， 且與對(duì)照組相比均有顯著性差異；待測(cè)藥物柴胡多糖（20、40、80ug/ml)能顯著地降低模型 組由CJ-S131再刺激引起的抗dsDNA抗體的高水平； (4) 總IgG測(cè)定： 10 μ g/ml羊抗小鼠 IgG包被酶標(biāo)板，4°C過(guò)夜；配制純小鼠 IgG標(biāo)準(zhǔn)曲線；取出酶標(biāo) 板，傾去其上清，PBS-1%BSA封閉，100μ 1/孔，37°C孵育2h ;分別加入各濃度的純小鼠 IgG 或待測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清原液，100 μ 1/孔，35C孵育2h，PBS-T洗滌5次，250 μ 1/孔；加1:1000 稀釋的羊抗小鼠 IgG_HRP，100ul/孔，37°C孵育2h ;PBS-T洗滌5次，300μ 1/孔；加1:5000 稀釋的羊抗小鼠 IgG-HRP酶標(biāo)抗體，100μ 1/孔，37°C孵育2h ;PBS-T洗滌4次，300μ 1/孔； 加入0PD底物溶液，100 μ 1/孔，37°C避光孵育20min ;加入2Μ H2S04終止反應(yīng)，50 μ 1/孔， 用酶標(biāo)儀492nm測(cè)定0D ; 結(jié)果顯示，未刺激時(shí)，總IgG水平在模型組和對(duì)照組之間無(wú)明顯差異，柴胡多糖對(duì)實(shí)驗(yàn) 各組的總IgG水平無(wú)明顯影響；而離體空腸彎曲菌CJ-S131再刺激后，模型組的總IgG的水 平較對(duì)照組均顯著升高，待測(cè)藥物柴胡多糖各濃度均能顯著地降低總IgG水平，其中模型 組總IgG幾乎降至正常水平； (5) IFN-γ 測(cè)定： 所述細(xì)胞培養(yǎng)上清按IFN-γ試劑盒說(shuō)明書(shū)記載的方法測(cè)定；結(jié)果顯示，未刺激時(shí)， IFN-γ的水平在模型組和對(duì)照組之間無(wú)明顯差異，待測(cè)藥物柴胡多糖也無(wú)明顯作用；而離 體CJ-S131再刺激后，模型組的IFN-γ的水平較對(duì)照組均顯著升高，且柴胡多糖各濃度均 能顯著地降低IFN-γ水平，其中模型組IFN-γ水平降低的幅度最大，幾乎降至正常水平； (6) IL-10 測(cè)定： 所述細(xì)胞培養(yǎng)上清按IFN-γ試劑盒說(shuō)明書(shū)記載的方法測(cè)定；結(jié)果顯示，未刺激時(shí)， IL-10的水平在模型組和對(duì)照組之間無(wú)明顯差異，待測(cè)藥物柴胡多糖也無(wú)明顯作用；離體 空腸彎曲菌CJ-S131再刺激后，模型組的IL-10的水平較對(duì)照組均顯著升高，而待測(cè)藥物柴 胡多糖各濃度均能顯著地降低IL-10水平，篩選出防治系統(tǒng)性紅斑狼瘡的藥物。
[0022] 實(shí)施案例3測(cè)定小葉黑柴胡多糖的離體抗SLE活性 實(shí)驗(yàn)采用的動(dòng)物包括：SLE模型鼠（CJ-S131誘導(dǎo)的SLE樣模型)。處死小鼠，無(wú)菌操作 取出脾臟放入盛有預(yù)冷的1640培養(yǎng)液的表面皿中。制備得脾單細(xì)胞懸液并調(diào)節(jié)脾細(xì)胞濃 度，取細(xì)胞培養(yǎng)板，分別加入待測(cè)藥物，CJ-S131和脾細(xì)胞懸液；加完板后，輕輕混勻，置于 37°C、5% C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h后，離心，吸取每孔的細(xì)胞上清液，分裝后放入-80°C冰箱保存， 待測(cè)。用于檢測(cè)抗dsDNA抗體、IgG、IFN- γ和IL-10等指標(biāo)； 采用柴胡多糖作為陽(yáng)性藥驗(yàn)證該離體藥物篩選模型在制備防治系統(tǒng)性紅斑狼瘡藥物 中的用途，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，柴胡多糖（20、40、8(^8/1111)能夠顯著地降低模型組由（^-5131 再刺激引起的抗dsDNA抗體的高水平表達(dá)；總IgG測(cè)定結(jié)果顯示，在離體再刺激之前，柴胡 多糖對(duì)模型組和對(duì)照組的總IgG水平無(wú)明顯影響，而離體再刺激后，柴胡多糖各濃度均能 顯著地降低總IgG水平，其中模型組總IgG水平降低的幅度最大，幾乎使總IgG降至正常水 平；通過(guò)檢測(cè)SLE相關(guān)的細(xì)胞因子IFN-γ和IL-10,發(fā)現(xiàn)柴胡多糖各濃度也能顯著性的抑 制炎癥因子的分泌水平，使IFN-γ和IL-10水平幾乎降至正常水平(檢測(cè)結(jié)果如圖1、2、3、 4所示)。
[0023] 現(xiàn)有技術(shù)已知小葉黑柴胡多糖整體給藥對(duì)SLE動(dòng)物模型療效顯著；在此基礎(chǔ) 上，本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在該離體藥物篩選模型上，同樣觀察到該藥可顯著性地抑制 SLE相關(guān)免疫學(xué)指標(biāo)的升高：包括抗自身抗體(抗dsDNA抗體)、總IgG以及相關(guān)炎癥因子 (IFN- γ和IL-10);結(jié)果表明，所述離體藥物篩選方法可作為篩選防治系統(tǒng)性紅斑狼瘡的藥 物的高通量篩選平臺(tái)。
【權(quán)利要求】
1. 一種致敏動(dòng)物的脾細(xì)胞模型，其特征在于，所述的致敏動(dòng)物的脾細(xì)胞模型通過(guò)采用 空腸彎曲菌CJ-S131誘導(dǎo)建立小鼠 SLE樣模型，取模型鼠脾臟細(xì)胞，用CJ-S131離體刺激， 制得SLE樣表現(xiàn)的離體模型；該離體模型表現(xiàn)出SLE相關(guān)免疫指標(biāo)升高，所述SLE相關(guān)免疫 指標(biāo)包括：抗dsDNA抗體、總IgG、IFN- γ和IL-10。
2. 權(quán)利要求1所述的致敏動(dòng)物的脾細(xì)胞模型的制備方法，其特征在于，其包括步驟： 采用空腸彎曲菌CJ-S131誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生SLE樣癥狀，按常規(guī)方法處理實(shí)驗(yàn)小鼠，無(wú)菌條 件下，制備其脾臟單細(xì)胞懸液；在培養(yǎng)板中加入空腸彎曲菌CJ-S131，再次刺激已致敏的脾 細(xì)胞，制得致敏動(dòng)物的脾細(xì)胞模型。
3. 權(quán)利要求1所述的致敏動(dòng)物的脾細(xì)胞模型在篩選防治系統(tǒng)性紅斑狼瘡藥物中的用 途。
4. 按權(quán)利要求3所述用途，其特征在于，所述篩選方法包括步驟： (1) 建立SLE相關(guān)免疫異常細(xì)胞模型： 采用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：正常對(duì)照鼠、佐劑對(duì)照鼠、CJ-S131誘導(dǎo)的SLE樣模型小鼠；常規(guī)方法處 理實(shí)驗(yàn)小鼠，無(wú)菌操作將獲得的實(shí)驗(yàn)小鼠脾臟放入盛有預(yù)冷的1640培養(yǎng)液的表面皿中，制 得脾單細(xì)胞懸液并調(diào)節(jié)脾細(xì)胞濃度，取細(xì)胞培養(yǎng)板，分別加入CJ-S131和脾細(xì)胞懸液，加板 后，混勻，置于37°C、5% C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h ;培養(yǎng)結(jié)束后，離心，吸取每孔的細(xì)胞上清液，分 裝，放入-80°C冰箱保存，備用； (2) 采用SLE樣細(xì)胞模型篩選藥物 采用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：CJ-S131誘導(dǎo)的SLE樣模型小鼠；常規(guī)方法處理實(shí)驗(yàn)小鼠，無(wú)菌操作將 獲得的實(shí)驗(yàn)小鼠脾臟放入盛有預(yù)冷的1640培養(yǎng)液的表面皿中，制得脾單細(xì)胞懸液并調(diào)節(jié) 脾細(xì)胞濃度，取細(xì)胞培養(yǎng)板，分別加入待測(cè)藥物，CJ-S131和脾細(xì)胞懸液，加板后，混勻，置于 37°C、5% C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h后，離心，吸取每孔的細(xì)胞上清液，分裝后放入-80°C冰箱保存， 檢測(cè)抗dsDNA抗體、IgG、IFN- γ和IL-10指標(biāo)； (3 )抗dsDNA抗體測(cè)定： 50. g/ml dsDNA 包被酶標(biāo)板，4°C過(guò)夜；PBS-1%BSA 封閉，100 μ 1/ 孔，37°C 孵育 2h ; PBS-T洗滌，加待測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清原液，100ul/孔，35C孵育2h ;加1:1000稀釋的羊抗小鼠 IgG-HRP，37°C孵育2h ;加1/1000稀釋的羊抗兔IgG-HRP酶標(biāo)抗體，37°C孵育lh ;加入0PD 底物溶液，37°C避光孵育20min ;加入2M H2S04終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀492nm測(cè)定0D ; (4) 總IgG測(cè)定： 10. g/ml羊抗小鼠 IgG包被酶標(biāo)板，4°C過(guò)夜；配制純小鼠 IgG標(biāo)準(zhǔn)曲線；取出酶標(biāo) 板，傾去其上清，PBS-1%BSA封閉，100μ 1/孔，37°C孵育2h ;分別加入各濃度的純小鼠 IgG 或待測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清原液，100 μ 1/孔，35C孵育2h，PBS-T洗滌5次，250 μ 1/孔；加1:1000 稀釋的羊抗小鼠 IgG-HRP，100ul/孔，37°C孵育2h ;PBS-T洗滌5次，300 μ 1/孔；加1:5000 稀釋的羊抗小鼠 IgG-HRP酶標(biāo)抗體，100μ 1/孔，37°C孵育2h ;PBS-T洗滌4次，300μ 1/孔； 加入0PD底物溶液，100 μ 1/孔，37°C避光孵育20min ;加入2Μ H2S04終止反應(yīng)，50 μ 1/孔， 酶標(biāo)儀492nm測(cè)定0D ; (5) 測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清IFN- γ ; (6) 測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清IL-10 ;篩選得到防治系統(tǒng)性紅斑狼瘡的藥物。
【文檔編號(hào)】C12N5/071GK104152397SQ201310174624
【公開(kāi)日】2014年11月19日 申請(qǐng)日期:2013年5月13日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月13日
【發(fā)明者】力弘, 李雯, 歐穎曄, 章蘊(yùn)毅, 陳道峰 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)