專利名稱：禽流感病毒n9型rt-pcr檢測試劑盒及檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及流感病毒N9型核酸熒光定量RT-PCR檢測試劑盒及檢測方法，可應(yīng)用于流感病毒N9型引起暴發(fā)疫情的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)急檢測。
背景技術(shù)：
禽流感病毒屬正粘病毒科甲型流感病毒屬。禽甲型流感病毒顆粒呈多形性，其中球形直徑80 120nm，有囊膜?；蚪M為分節(jié)段單股負(fù)鏈RNA。依據(jù)其外膜血凝素(H)和神經(jīng)氨酸酶(N)蛋白抗原性不同，目前可分為16個(gè)H亞型(Hl H16)和9個(gè)N亞型(NI N9)。禽甲型流感病毒除感染禽外，還可感染人、豬、馬、水貂和海洋哺乳動(dòng)物。以往研究發(fā)現(xiàn)可感染人的禽流感病毒亞型為H5N1、H9N2、H7N7、H7N2、H7N3。目前，全球首次發(fā)現(xiàn)人感染H7N9禽流感病毒。人感染H7N9禽流感是由H7N9亞型禽流感病毒引起的急性呼吸道傳染病。據(jù)報(bào)道，自2013年2月以來，我國上海市、安徽省、江蘇省先后發(fā)生不明原因重癥肺炎病例，其中確診人感染H7N9禽流感3例，2例死亡。3例均為散發(fā)病例，目前尚未發(fā)現(xiàn)3例病例間有流行病學(xué)關(guān)聯(lián)。此次報(bào)道的為人感染H7N9禽流感病毒。該病毒為新型重配病毒，其內(nèi)部基因來自于H9N2禽流感病毒。流行病學(xué)調(diào)查顯示H9N2禽流感病毒的傳染源目前尚不明確，根據(jù)以往經(jīng)驗(yàn)及本次病例流行病學(xué)調(diào)查，推測可能為攜帶H7N9禽流感病毒的禽類及其分泌物或排泄物。H7N9禽流感病毒經(jīng)呼吸道傳播，也可通過密切接觸感染的禽類分泌物或排泄物等被感染，直接接觸病毒也可被感染，現(xiàn)尚無人與人之間傳播的確切證據(jù)。根據(jù)流感的潛伏期及現(xiàn)有H7N9禽流感病毒感染病例的調(diào)查結(jié)果，潛伏期一般為7天以內(nèi)?；颊咭话惚憩F(xiàn)為流感樣癥狀，如發(fā)熱，咳嗽，少痰，可伴有頭痛、肌肉酸痛和全身不適。重癥患者病情發(fā)展迅速，表現(xiàn)為重癥肺炎，體溫大多持續(xù)在39°C以上，出現(xiàn)呼吸困難，可伴有咯血痰；可快速進(jìn)展出現(xiàn)急性呼吸窘迫綜合征、縱隔氣腫、膿毒癥、休克、意識(shí)障礙及急性腎損傷等。根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果發(fā)現(xiàn)，H7N9禽流感病毒感染致死率較高，且暫時(shí)并沒有相應(yīng)的保護(hù)性疫苗可供使用。因此，疾病防控機(jī)構(gòu)強(qiáng)烈需要快速、有效的H7N9禽流感病毒檢測方法來加強(qiáng)對(duì)禽流感感染疑似病例及相關(guān)禽類中的H7N9禽流感病毒檢測，從而提高我們對(duì)H7N9禽流感病毒感染的防制能力。目前，實(shí)驗(yàn)室病原學(xué)檢測方法主要是病毒分離:從患者呼吸道標(biāo)本中分離H7N9禽流感病毒。上述檢測方法的不足是檢測速度尚不能滿足要求(通常需要5天左右)；而且操作比較復(fù)雜。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種禽流感病毒N9型的熒光定量RT-PCR檢測試劑盒，該檢測試劑盒應(yīng)具有使用方便、檢測準(zhǔn)確的特點(diǎn)。本發(fā)明的另一目的是提供一種禽流感病毒N9型的熒光定量RT-PCR檢測方法，該方法應(yīng)具有檢測準(zhǔn)確性高、檢測簡單方便的特點(diǎn)。本發(fā)明采用的技術(shù) 方案是:
一種禽流感病毒N9型的熒光定量RT-PCR檢測試劑盒，包括脫氧三磷酸核苷、MgCl2, RT-PCR緩沖液、流感病毒N9基因標(biāo)準(zhǔn)品、RNA酶抑制劑、MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶以及DNA聚合酶；其特征在于所述熒光定量RT-PCR檢測試劑盒還包括上游引物、下游引物和特異性探針，所述上游引物、下游引物和特異性探針序列如下:上游引物N9-FP: 5，-ACAATACACGATAGRTCCCAGTA-3，；下游引物N9-RP: 5，-CTAGTACTTGACCACCCAATGC-3 ’ ；特異性探針N9-P: 5’-FAM-CTRTCATCACCRCCCACAGTGTA-BHQl-3’，其中 FAM-為熒光報(bào)告基團(tuán)，BHQl為熒光淬滅基團(tuán)；所述禽流感病毒N9基因標(biāo)準(zhǔn)品序列如下:GTTCTATGCTCTCAGCCAAGGAACAACAATCAGAGGGAAACACTCAAACG GAACAATACACGATAGGTCCCAGTATCGCGCCCTGATAAGCTGGCCACTAT CATCACCGCCCACAGTGTACAATAGCAGGGTGGAATGCATTGGGTGGTCA AGTACTAGTTGCCATGATGG。所述檢測試劑盒中各組分的含量是:
權(quán)利要求
1.一種禽流感病毒N9型的熒光定量RT-PCR檢測試劑盒，包括脫氧三磷酸核苷、MgCl2、RT-PCR緩沖液、禽流感病毒N9基因標(biāo)準(zhǔn)品、RNA酶抑制劑、MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶以及DNA聚合酶；其特征在于所述熒光定量RT-PCR檢測試劑盒還包括上游引物、下游引物和特異性探針，所述上游引物、下游引物和特異性探針序列如下: 上游引物 N9-FP: 5，-ACAATACACGATAGRTCCCAGTA-3，； 下游引物 N9-RP: 5，-CTAGTACTTGACCACCCAATGC-3，； 特異性探針 N9-P: 5’-FAM-CTRTCATCACCRCCCACAGTGTA-BHQl-3’，其中 FAM-為熒光報(bào)告基團(tuán)，BHQl為熒光淬滅基團(tuán)； 所述禽流感病毒N9基因標(biāo)準(zhǔn)品序列如下:GTTCTATGCTCTCAGCCAAGGAACAACAATCAGAGGGAAACACTCAAACG GAACAATACACGATAGGTCCCAGTATCGCGCCCTGATAAGCTGGCCACTAT CATCACCGCCCACAGTGTACAATAGCAGGGTGGAATGCATTGGGTGGTCA AGTACTAGTTGCCATGATGG。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的禽流感病毒N9型的熒光定量RT-PCR檢測試劑盒，其特征在于:所述檢測試劑盒中各組分的含量是: 脫氧三磷酸核苷>5 Ul
3.一種禽流感病毒N9型的熒光定量RT-PCR檢測方法，按以下步驟進(jìn)行: (1)提取待測樣品RNA; (2)以待測樣品RNA為模板，與下列物質(zhì)混合配制成反應(yīng)體系進(jìn)行RT- PCR反應(yīng):上游引物、下游引物、特異性探針、RT-PCR緩沖液、脫氧三磷酸核苷、MgCl2,RNA酶抑制劑、MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶、DNA聚合酶； 所述特異性引物和熒光探針序列如下: 上游引物 N9-FP: 5，-ACAATACACGATAGRTCCCAGTA-3， 下游引物 N9-RP: 5，-CTAGTACTTGACCACCCAATGC-3， 特異性探針 N9-P:5’ -FAM-CTRTCATCACCRCCCACAGTGTA-BHQ1-3’(3)對(duì)RT-PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行熒光檢測，根據(jù)熒光檢測的最低Ct值和最高熒光強(qiáng)度判斷結(jié)果；若RT-PCR反應(yīng)產(chǎn)物的熒光檢測結(jié)果呈陽性，則待測樣品含有禽流感H7型病毒。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的禽流感病毒N9型的熒光定量RT-PCR檢測方法，其特征在于:所述步驟(2)中PCR反應(yīng)體系中各成分含量如下: RT-PCR緩沖液終濃度為Ix 脫氧三磷酸核苷5 ul MgC I21.25xl0_4mmolI OjimolZL上游引物Iul lOpmol/L下游引物IulIOj^inolZL特異性探針I(yè) ul DNA聚合酶4U MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶200U RNA酶抑制劑20U 模板 RNA2-3\iL 其余是DEPC水，將反應(yīng)體系補(bǔ)足至25iU。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的禽流感病毒N9型的熒光定量RT-PCR檢測方法，其特征在于:所述熒光定量RT-PCR反應(yīng)條件為:50°C 40min,95°C 2min進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，然后95°C 10s，55°C 35s，在55°C進(jìn)行單點(diǎn)熒光檢測，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。
全文摘要
本發(fā)明涉及禽流感病毒N9型RT-PCR檢測試劑盒及檢測方法。目的是提供的檢測試劑盒應(yīng)具有使用方便、檢測準(zhǔn)確的特點(diǎn)，提供的方法應(yīng)具有檢測準(zhǔn)確性高、檢測簡單方便的特點(diǎn)。技術(shù)方案是一種禽流感病毒N9型的熒光定量RT-PCR檢測試劑盒，包括脫氧三磷酸核苷、MgCl2、RT-PCR緩沖液、流感病毒N9基因標(biāo)準(zhǔn)品、RNA酶抑制劑、MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶以及DNA聚合酶；其特征在于熒光定量RT-PCR檢測試劑盒還包括上游引物、下游引物和特異性探針；一種禽流感病毒N9型的熒光定量RT-PCR檢測方法，按以下步驟進(jìn)行(1)提取RNA；(2)進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)；(3)對(duì)RT-PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行熒光檢測。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK103255233SQ20131017631
公開日2013年8月21日 申請(qǐng)日期2013年5月10日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月10日
發(fā)明者陳直平, 張嚴(yán)峻, 李輝 申請(qǐng)人:浙江省疾病預(yù)防控制中心