專利名稱：檢測葡萄黃斑類病毒的RT-qPCR檢測試劑盒及寡核苷酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測葡萄黃斑類病毒的實時熒光定量RT-PCR (RT-qPCR)檢測試劑盒及寡核苷酸，屬于檢驗檢疫領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
葡萄黃斑類病毒(Grapevineyellow speckle viroidl, GYSVd-1)屬于馬鈴薯紡錘塊莖類病毒科(Pospiviroidae),蘋果銹皮類病毒屬(Apscaviroid)。GYSVd-1為單鏈環(huán)狀的RNA分子，長367個核苷酸殘基，能形成類病毒典型的桿狀二級結(jié)構(gòu)。GYSVd-1與蘋果銹皮類病毒(ASSVd)有37%的序列同源性，與馬鈴薯紡錘塊莖類病毒科的其它類病毒也有一定的同源性。GYSVd-1缺乏該科大多數(shù)類病毒具有的中央保守區(qū)，但與ASSVd中央?yún)^(qū)序列保守，且都含有穩(wěn)定的回文結(jié)構(gòu) 。該類病毒可能通過嫁接傳播和機械傳播，Wah等發(fā)現(xiàn)其可以通過種子傳播。自然條件下侵染葡萄(Vitis vinifera)。該病于1972年在澳大利亞首次發(fā)現(xiàn)，病原很長時間未能分離出來，病葡萄組織中也未觀察到病毒粒子。直到1988年，澳大利亞研究表明其病原為葡萄黃斑類病毒(GYSVd-1和GYSVd-2)。之后，美國、法國、意大利、西班牙、日本相繼報道有此病。我國遼寧、山東等地也見有此病發(fā)生。目前，國內(nèi)外已報道檢測類病毒的方法有指示植物法、聚丙烯酰胺凝膠電泳法、分子雜交、RT-PCR和基因芯片技術(shù)等，這些技術(shù)有的操作步驟繁瑣，檢測周期長，靈敏度低，有的易于造成交叉污染，出現(xiàn)假陽性結(jié)果。RT-qPCR技術(shù)是在常規(guī)PCR定性技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的核酸定量技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入引物對的同時加入特異性熒光探針(TaqMan探針)，探針與模板特異性結(jié)合，其結(jié)合位點位于引物對之間，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR過程。該技術(shù)可以采用絕對定量和相對定量兩種方式實現(xiàn)定量檢測，其中絕對定量是目前采用最多的一種，但是需要采用外標(biāo)準(zhǔn)品的定量制備來實現(xiàn)。在RT-qPCR定量檢測中，這些外標(biāo)準(zhǔn)品的制備成為其能否準(zhǔn)確定量的關(guān)鍵。RT-qPCR整個過程在全封閉的狀態(tài)下進(jìn)行片段擴增及產(chǎn)物分析，有效地減少了污染及對人體的危害。該技術(shù)具有特異性強、靈敏度高、自動化程度高、檢測簡單快速、技術(shù)易于掌握等特點，是快速分子診斷的發(fā)展趨勢。目前RT-qPCR技術(shù)已廣泛用于病毒檢測、細(xì)菌檢測、植原體檢測、轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測、線蟲檢測等諸多領(lǐng)域，但對葡萄黃斑類病毒的RT-qPCR檢測尚未見公開報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的第一個技術(shù)問題是提供一組特異性強、靈敏度高的檢測葡萄黃斑類病毒的寡核苷酸，包括引物和探針。本發(fā)明要解決的第二個技術(shù)問題是提供一種特異、靈敏、高效的檢測葡萄黃斑類病毒的RT-qPCR檢測試劑盒。本發(fā)明要解決的第三個技術(shù)問題是提供一種檢測葡萄黃斑類病毒的RT-qPCR檢測方法。
為解決第一個技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:一組檢測葡萄黃斑類病毒的寡核苷酸，為序列表SEQ ID No:1至SEQ ID No:3所示的寡核苷酸，其中序列SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2分別為檢測葡萄黃斑類病毒的正義引物和反義引物，序列SEQ ID NO:3為檢測葡萄黃斑類病毒的熒光探針，具體為:引物GYSVd-1-FP:5，-CTTGTGGTTCCTGTGGTTTCAC-3，，(SEQ ID NO:1)；引物GYSVd-1-RP:5，-CCTCTGCCCCTATCTTCTTCTTT-3，，(SEQ ID NO:2)；探針GYSVd-1-P:5’ -AAGGCCGCCGCGGACCTG-3’，(SEQ ID NO:3);該探針的 5’ 端標(biāo)記報告熒光基團FAM，3’端標(biāo)記淬滅熒光基團BHQ1。上述引物和探針擴增的目標(biāo)片段長度為 69bp。為解決第二個技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:本發(fā)明提供了一種檢測葡萄黃斑類病毒的RT-qPCR檢測試劑盒，包括以下組分:(I) RT-qPCR反應(yīng)液，其包括序列表SEQ ID N0.1所示的正義引物，序列表SEQIDN0.2所示的反義引物，序列表SEQ ID N0.3所示的熒光探針，該探針的5’端標(biāo)記報告熒光基團FAM，3’端標(biāo)記淬滅熒光基團BHQl ；(2)陰性對照:采用無葡萄黃斑類病毒感染葡萄葉片，液氮研磨后，加入DEPC水充分研磨，然后5000rpm離心3min,取上清液提取RNA,溶解于DEPC水；(3)RNA標(biāo)準(zhǔn)品:為體外轉(zhuǎn)錄的非感染性RNA片段，其對應(yīng)的DNA序列為序列表SEQID N0.4所示的核苷酸序列。進(jìn)一步地，上述RT-qPCR反應(yīng)液還包括常規(guī)RT-qPCR反應(yīng)所需的試劑和酶，優(yōu)選地，本發(fā)明所述的RT-qPCR反應(yīng)液還包括:10XPCR緩沖液(含Mg2+)，dNTP混合物，反轉(zhuǎn)錄酶，RNA酶抑制劑，Taq DNA聚合酶和DEPC水，均購自TaKaRa公司。為解決第三個技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了檢測葡萄黃斑類病毒的RT-qPCR檢測方法，包括如下步驟:I)提取樣品RNA;取攜帶葡萄黃斑類病毒的葡萄葉片，經(jīng)RNA提取試劑盒(購自Qiagen公司)提取植物總RNA，也可以使用現(xiàn)有技術(shù)中已知的提取RNA的方法進(jìn)行提?。? )對提取的樣品RNA進(jìn)行RT-qPCR擴增:表I RT-qPCR反應(yīng)體系
權(quán)利要求
1.一組檢測葡萄黃斑類病毒的寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸如序列表SEQ IDN0.1至序列表SEQ ID N0.3所示；其中序列SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2分別為檢測葡萄黃斑類病毒的正義引物和反義引物，序列SEQ ID N0.3為檢測葡萄黃斑類病毒的熒光探針。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測葡萄黃斑類病毒的寡核苷酸，其特征在于，所述熒光探針序列SEQ ID NO:3的5’端標(biāo)記報告熒光基團FAM，3’端標(biāo)記淬滅熒光基團BHQ1。
3.權(quán)利要求1或2所述的檢測葡萄黃斑類病毒的寡核苷酸在制備檢測葡萄黃斑類病毒試劑盒中的應(yīng)用。
4.一種葡萄黃斑類病毒的RT-qPCR檢測試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括以下組分: (1)RT-qPCR反應(yīng)液，其包括:序列表SEQID N0.1所示的正義引物，序列表SEQ ID N0.2所示的反義引物，序列表SEQ ID N0.3所示的熒光探針，所述熒光探針的5’端標(biāo)記報告熒光基團FAM，3’端標(biāo)記淬滅熒光基團BHQl ； (2)陰性對照； (3)RNA標(biāo)準(zhǔn)品:為體外轉(zhuǎn)錄的非感染性RNA片段，其對應(yīng)的DNA序列為序列表SEQIDN0.4所示的核苷酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述RT-qPCR反應(yīng)液還包括:含Mg2+的PCR緩沖液，dNTP混合物，反轉(zhuǎn)錄酶，RNA酶抑制劑，Taq DNA聚合酶和DEPC水。
6.一種葡萄黃斑類病毒的RT-qPCR檢測方法，其特征在于，該方法包括以下步驟: 1)提取樣品RNA； 2)對提取的樣品RNA進(jìn)行RT-qPCR擴增；其中，使用序列表SEQID N0.1所示的正義引物，序列表SEQ ID N0.2所示的反義引物，序列表SEQ ID N0.3所示的熒光探針，所述熒光探針的5’端標(biāo)記報告熒光基團FAM，3’端標(biāo)記淬滅熒光基團BHQl ； 3)根據(jù)RT-qPCR反應(yīng)體系的熒光強度進(jìn)行結(jié)果判定。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測葡萄黃斑類病毒的RT-qPCR檢測試劑盒及寡核苷酸。具體地，本發(fā)明提供了一組檢測葡萄黃斑類病毒的寡核苷酸，為序列表SEQ ID No1和序列表SEQ ID No3所示，其中序列SEQ ID No.1和SEQ ID No.2分別為檢測葡萄黃斑類病毒的正義引物和反義引物，序列SEQ ID No.3為檢測葡萄黃斑類病毒的熒光探針。本發(fā)明還提供了含有上述引物和探針的檢測試劑盒及其檢測方法，可達(dá)到準(zhǔn)確定量待測樣品中GYSVd-1的目的。
文檔編號C12Q1/70GK103225002SQ201310177809
公開日2013年7月31日 申請日期2013年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月14日
發(fā)明者鄧叢良, 趙曉麗, 劉若思, 呂玉峰, 梁新苗, 邊勇 申請人:中華人民共和國北京出入境檢驗檢疫局