基于顏色的環(huán)介導逆轉錄等溫擴增技術檢測人感染甲型h7n9流感病毒基因的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物技術應用領域，涉及各級疾病預防控制機構，流感檢測網絡實驗室，哨點醫(yī)院等用于對發(fā)熱病人咽拭子等標本的人甲型H7N9流感病毒HA基因和NA基因的檢測和監(jiān)測。具體是應用基于顏色的環(huán)介導逆轉錄等溫擴增技術(RT-LAMP)，通過計算機軟件分析人甲型H7N9流感病毒H7基因和N9基因的保守序列，分別設計出六條引物完全與識別基因靶序列中八個結合區(qū)匹配，并于反應前加入HNB(羥基萘酚藍)染料，只需一步就可完成在63℃等溫環(huán)境中擴增1.5小時，最后用肉眼觀察顏色變化和管底的白色沉淀判定檢測結果，與傳統(tǒng)的RT-PCR方法比較，它具有更安全、特異、靈敏、便捷的優(yōu)勢。
【專利說明】基于顏色的環(huán)介導逆轉錄等溫擴增技術檢測人感染甲型 H7N9流感病毒基因 發(fā)明領域
[0001] 本發(fā)明是用基于HNB顏色的環(huán)介導逆轉錄等溫擴增技術檢測人感染甲型H7N9流 感病毒的H7基因和N9基因。用于各級疾病預防控制機構，流感檢測網絡實驗室，哨點醫(yī)院 對人感染甲型H7N9流感病毒的檢測和監(jiān)測。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] H7N9流感病毒是一種新型的重組甲型流感病毒，其基因是來自于東亞地區(qū)野鳥和 中國上海、浙江、江蘇雞群的基因重配型。該病毒之前僅發(fā)現(xiàn)于鳥禽間，但是2013年3月底 在上海和安徽兩地全球首次報道了人感染H7N9流感病毒病例。這種病毒的傳播途徑主要 經呼吸道傳播，也可通過接觸帶病毒禽類分泌物或排泄物等被感染，直接接觸病毒也可被 感染，但是目前還尚無人與人之間傳播的確切證據。易感人群以與禽類養(yǎng)殖、銷售、宰殺、力口 工以及在發(fā)病前1周內接觸過禽類的成年人為主。截止2013年5月6日，全國（含臺灣省） 已確診甲型H7N9流感130例，31人死亡，42人痊愈。病例分布于北京、上海、江蘇、浙江、安 徽、山東、河南、臺灣、福建等地。鑒于我國甲型H7N9流感疫情不斷擴大的局面，為有效阻止 疫情的更大范圍傳播和疫情及時應急處置，根據衛(wèi)生部應對甲型H7N9流感疫情防控要求， 我國已決定在各地增加病毒檢測實驗室和哨點醫(yī)院，擴大監(jiān)測網絡的覆蓋范圍。將網絡實 驗室擴大到整個地市一級，目標是使全國300多個地市都具備能夠進行病毒檢測的能力， 及早發(fā)現(xiàn)和確診甲型H7N9病例，尤其嚴密監(jiān)測其人傳人流行性調查，切實有效地做到早發(fā) 現(xiàn)、早報告、早處置。本專利成功建立的基于顏色的RT-LAMP檢測人甲型H7N9流感病毒基 因方法，將為提高我國流感監(jiān)測網絡實驗室和哨點醫(yī)院的監(jiān)測能力，實現(xiàn)對發(fā)熱病人的快 速篩查提供了有力的技術保障。
[0004] 與傳統(tǒng)基因分子診斷方法相比，基于顏色的RT-LAMP技術在RNA病毒檢測方面有 著無法比擬的優(yōu)勢，尤其在可操作性和設備要求方面。這種優(yōu)勢的存在主要是因為RT-LAMP 技術如下幾個方面的特點：第一，檢測時間短靈敏度高。整個檢測時間可縮短至1?1. 5小 時內，靈敏度可與實時熒光定量PCR媲美。第二，特異性高。所設計的六條特異性引物，只 在其與識別靶序列中八個結合區(qū)完全匹配的情況下擴增才能順利進行，因此這很大程度上 減少了非特異性擴增反應的可能，從而使檢測特異性更為可靠。第三，設備要求簡單。擴增 反應在60?65°C恒溫條件下進行，無核酸變復性過程，除了應用一些常用聚合酶外，對硬 件設備基本無特殊要求，普通級別下的生物實驗室即可完成檢測和結果判斷。第四，污染機 會低。在實施過程中只需一步就可完成實驗操作，減少了污染機會并方便了實驗過程中的 質控工作。同時，該技術于反應前加入顯色染料，避免了常規(guī)RT-LAMP的后續(xù)開蓋行為，有 效地防止了氣溶膠污染。第五，結果可視化。RT-LAMP擴增反應過程中可產生大量副產物焦 磷酸鎂白色沉淀，或在擴增前加入一定量羥基萘酚藍（HNB)，使得陽性反應管中出現(xiàn)可視的 白色混濁物或反應管內顏色變化，從而實現(xiàn)檢測結果的直接可視化判定。


【發(fā)明內容】
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[0005] 1.本發(fā)明是對目前對RNA病毒檢測技術手段的改進和補充，它具有安全、特異、靈 敏、便捷的優(yōu)勢。這主要體現(xiàn)在以下幾個方面。首先，檢測時間短靈敏度高。整個檢測時間 可縮短至1?1.5小時內，靈敏度可與實時熒光定量PCR媲美。其次，特異性高。所設計 的六條特異性引物，只在其與識別靶序列中八個結合區(qū)完全匹配的情況下擴增才能順利進 行。然后，所有的擴增過程都可在63°C等溫下完成，無需PCR儀，降低了對實驗硬件的要求。 最后，污染機會低和結果可視化。。
[0006] 2.選擇人感染甲型H7N9流感HA基因 （GISAID :EPI439507)的288?483位和NA 基因 （GISAID :EPI439509)的151?352位的相對保守區(qū)設計相應的RT-LAMP引物，針對每 個基因分別包括兩條外引物（F3、B3)和兩條內引物（FIP、BIP)，兩條環(huán)結合引物（Loopl、 Loop2)。所有引物的具體序列見表1和表2。
[0007] 表1 :RT-LAMP檢測人感染甲型H7N9流感H7基因的引物序列
[0008]

【權利要求】
1. 一種用于人感染甲型H7N9流感病毒HA基因和ΝΑ基因檢測的基于HNB (羥基萘酚 藍）顏色的環(huán)介導逆轉錄等溫擴增技術（RT-LAMP)，其中包括：用于人感染H7N9流感病毒 H7基因檢測的6條寡核苷酸引物、N9基因檢測的6條寡核苷酸引物和HNB (羥基萘酚藍） 染料。
2. 權力要求1所述的人感染甲型H7N9流感病毒檢測的環(huán)介導逆轉錄等溫擴增技術 (RT-LAMP)的引物包括表1所列的基因序列及其每種序列的互補序列或變體。
3. 權力要求1所述的人感染甲型H7N9流感病毒檢測的環(huán)介導逆轉錄等溫擴增技術 (RT-LAMP)包括人感染甲型H7N9流感病毒及其變異株。
4. 權力要求3所述的本發(fā)明的應用范圍包括各級疾病預防控制機構，流感檢測網絡實 驗室，哨點醫(yī)院用于人感染甲型H7N9流感病毒H7基因和N9基因的檢測和監(jiān)測。
5. 權力要求1所述的人感染甲型H7N9流感病毒H7基因和N9基因檢測的基于HNB顏 色的環(huán)介導逆轉錄等溫擴增技術（RT-LAMP)的反應程序和檢測程序。
【文檔編號】C12Q1/68GK104152577SQ201310178859
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2013年5月15日 優(yōu)先權日:2013年5月15日
【發(fā)明者】馬學軍, 舒躍龍, 聶凱, 王大燕, 丁雄 申請人:中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所