抗人sST2單克隆抗體及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及抗人sST2單克隆抗體及其應用。本發(fā)明人第一次采用基因工程手段將編碼人sST2蛋白的基因導入到適當的果蠅表達系統(tǒng)中，制備出一種在活性上與天然的人sST2蛋白非常接近的重組人sST2蛋白，用該蛋白免疫動物可獲得靈敏地識別人體中天然的sST2蛋白的抗體，從而用于對相關疾病的診斷或檢測。
【專利說明】抗人sST2單克隆抗體及其應用

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術和免疫學領域；更具體地，本發(fā)明涉及抗人sST2單克隆抗體 及其應用。

【背景技術】
[0002] ST2(IL1RL1，DER4，T1和FIT-1)是Toll樣/白介素受體超家族的一員，屬于IL-1 受體亞家族。在人體內ST2基因編碼3種亞型的蛋白質：分泌到細胞外的可溶型蛋白sST2， 膜結合型受體蛋白ST2L和主要在人腸組織中表達的ST2V[1]。ST2L由細胞膜外3個串聯(lián) 的免疫球蛋白結構域、跨膜結構域和細胞內的TIR(Toll/Interleukin-lreceptor)結構域 3部分組成[2]。ST2L廣泛表達于多種造血細胞和非造血細胞[3]，在造血細胞中，ST2L 選擇性的的表達在Th2淋巴細胞表面，而不表達在Thl淋巴細胞表面，因此ST2L可以作為 Th2細胞表面標記分子[4]。ST2L可以與胞外配體分子白介素-33(IL-33)及細胞膜上的 白介素-1受體輔助蛋白（IL-lRAcP)形成復合物，招募接頭分子Myd88,激活細胞內多條信 號通路，促進Th2相關的炎癥因子的表達[5,6]。IL-33/ST2L/IL-lRAcP信號通路在體內銜 接先天性免疫和適應性免疫進程，參與多種免疫相關疾病的調控過程，具體包括抗感染免 疫，肝炎，過敏及哮喘，自身免疫病，抗腫瘤免疫，中樞神經系統(tǒng)炎癥，糖尿病,心血管疾病等 [7-10]。因此IL-33/ST2L信號通路可以作為多種疾病的潛在治療靶點，在疾病治療和診斷 中具有重要價值。
[0003] sST2為分泌性的可溶型蛋白，缺少ST2L的跨膜結構域和胞內結構域，在C段與 ST2L相比，存在9個不同的氨基酸片段[11]。sST2可作為誘騙受體，在細胞外與游離的 IL-33結合，抑制IL-33/ST2L/IL-lRAcP復合物的形成，起到負調控作用，抑制Th2相關的炎 癥因子IL-4, IL-5, IL-13等的表達[12]。正常人體內，血清sST2濃度維持在非常低的水平， 但是在病毒感染[13]、自身免疫性疾病[14]、哮喘[15]、肺纖維化[16]、心衰[17]、呼吸衰 竭[18]、糖尿病[19]等多種病人體內，血清sST2水平明顯升高。2004年，Shimpo，M.et al 等發(fā)現(xiàn)血清sST2水平可作為心衰標志物，預測心衰病人的死亡率，具有極其重要的預后診 斷價值[20]，隨后的多項研究證明（[7]TablelStudies examining sST2in serum/plasma of patients with CV disease), sST2可以作為一種新型的心衰標志物，可用于預測急性 心肌梗死[20]，急性呼吸衰竭[18, 21]、非穩(wěn)定的心力衰竭[22]，代償性心力衰竭[23]，慢 性心力衰竭和左心室收縮功能不全[24]等多種心血管相關疾病的死亡率。而且sST2與現(xiàn) 有的心衰標志物CRP，BNP，ANP等具有功能互補作用，可以顯著提高疾病預測的準確性[25， 26]。因此sST2, IL-33及相關抗體等具有極其重要的臨床應用價值[2, 27]。
[0004] 獲取特異性的抗人SST2的單克隆抗體，不僅可以應用于科學研究，還可以用于臨 床診斷及治療，具有極其巨大的應用前景，也越來越受到國際研究同行的重視。目前市面上 現(xiàn)有的檢測sST2的抗體主要來自R&D，MBL，Santa Cruz，Abcam，sinobiological等公司，使 用的抗原來源于大腸桿菌表達或者哺乳動物細胞如293等的表達。由于sST2是一個高度 糖基化的蛋白，在大腸桿菌中缺乏糖基化修飾，因此使用大腸桿菌表達的重組蛋白在蛋白 活性和構象上與天然蛋白具有極大的差異；使用哺乳動物細胞如293等表達的重組人sST2 蛋白，雖然具有與人相似或者相同的糖基化修飾系統(tǒng)，但存在成本高產量低等缺陷。為了解 決上述問題，本發(fā)明人采用昆蟲細胞（果蠅S2細胞），篩選得到了穩(wěn)定表達重組人sST2蛋 白的細胞株，所得到的重組蛋白不僅具有與人的sST2蛋白相似的天然構象和活性，也具有 與哺乳動物表達系統(tǒng)類似的糖基化修飾。不僅避免了大腸桿菌表達系統(tǒng)中沒有糖基化修飾 的缺陷，也彌補了哺乳動物細胞表達重組蛋白成本高產量低的劣勢，具有極大的新穎性。


【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供高效表達和純化人sST2蛋白的方法；以及抗人sST2蛋白 的單克隆抗體及其應用。
[0006] 在本發(fā)明的第一方面，提供一種制備人sST2蛋白的方法，包括以下步驟：
[0007] (a)將人sST2基因序列插入表達載體的多克隆位點中，獲得插入了人sST2基因序 列的表達載體；所述的表達載體是果蠅S2表達系統(tǒng)使用的誘導分泌型表達載體；
[0008] (b)使（a)獲得的插入了人sST2基因序列的表達載體轉入宿主細胞，獲得轉化的 宿主細胞；所述的宿主細胞是果蠅S2細胞；
[0009] (c)培養(yǎng)轉化的宿主細胞，從而表達出人sST2蛋白；
[0010] (d)分離獲得人sST2蛋白。
[0011] 在一個優(yōu)選例中，所述的表達載體為pMT/BiP/V5-His A載體。
[0012] 在另一優(yōu)選例中，在步驟（d)中，還包括用5±2μΜ CdCl2誘導表達。
[0013] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種通過所述的方法制備的人sST2蛋白。
[0014] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種單克隆抗體，所述的單克隆抗體特異性地抗所述 的人sST2蛋白。
[0015] 在一個優(yōu)選例中，所述的單克隆抗體的亞型為IgG，κ。
[0016] 在另一優(yōu)選例中，所述單克隆抗體由選自下組的雜交瘤細胞株產生：8D9,7C11， 11E2,9B3 或 1A11。
[0017] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種制備抗人sST2蛋白單克隆抗體的方法，所述的方 法包括步驟：培養(yǎng)雜交瘤細胞809、7(：11、1巧2、983或認11，使用上述雜交瘤細胞制備腹水， 以及從腹水中分離純化上述細胞分泌的單克隆抗體。
[0018] 在本發(fā)明的另一方面，提供抗人SST2特異性單克隆抗體的雜交瘤細胞，其選自： 8D9,7C11，11E2,9B3 或 1A11。
[0019] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種試劑盒，含有前面所述的抗體。
[0020] 本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見 的。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021] 圖1、采用PCR擴增人SST2蛋白編碼序列的電泳結果。
[0022] 各泳道樣品依次為：1，2, 3 :人sST2蛋白編碼序列，Marker :DL2, 000DNA Marker(Takara)，
[0023] 圖2、插入人sST2蛋白編碼序列的表達載體菌液PCR鑒定的電泳結果。
[0024] 圖3、使用親和層析方法純化重組人sST2蛋白的SDS-PAGE圖。
[0025] 各泳道樣品依次為：泳道1 :hsST2蛋白純化后使用Amicon Ultra_4Centrifugal Filter(30KD)濃縮后樣品；泳道2 :PageRuler Prestained Protein Ladder (10_170kDa); 泳道3 :HisCiraviTrap?親和層析柱純化處理的穿透液；泳道4 :使用Washing Buffer清洗 的流穿液；泳道5-7 :洗脫液（每管收集lml樣品）
[0026] 圖4、使用親和層析方法純化重組人sST2蛋白免疫印跡（WB)分析結果。所用 抗體為 His_Tag(2A8) Mouse mAb(Abmart),二抗使用抗體為 Anti-Mouse IgG(H+L), AP Conjugate(Promega， S3721)
[0027] 各泳道樣品上樣順序與圖3相同。
[0028] 圖5、Balb/c小鼠第二次免疫后血清抗體效價圖，使用間接ELISA方法測定。從結 果可以顯示經過兩次免疫后4只小鼠血清抗體效價都超過1:32000。
[0029] 圖6、為使用ProteinG親和層析柱純化腹水中抗體SDS-PAGE分析圖。
[0030] 各泳道樣品依次為：泳道1 :經結合緩沖液稀釋處理后的腹水；泳道2 :HiTrap PtoteinG HP親和層析柱處理后的穿透液；泳道3 :經結合緩沖液清洗柱子后的流穿液；泳 道4-7 :經洗脫緩沖液處理后的洗脫液。左圖為使用濃度為7. 5%的SDS-PAGE進行非還原 性電泳結果；右圖為使用濃度為10%的SDS-PAGE進行還原性電泳結果。從電泳結果可以看 到純化的抗體條帶單一，沒有其它的雜帶。
[0031] 圖7、使用本發(fā)明中的單克隆抗體和R&D公司的商業(yè)化抗體MAB523進行免疫印跡 分析結果及分析靈敏度的定量比較。
[0032] 左圖顯示分別使用雜交瘤細胞株8D9,7C11，9B3, 11E2，1A11，7F9，1A1分泌純化的 抗體與R&D公司的商業(yè)化抗體MAB523檢測1 μ g重組人sST2蛋白結果，右圖顯示雜交瘤細 胞株8D9, 7C11與R&D公司的商業(yè)化抗體MAB523檢測一系列濃度梯度的重組人sST2蛋白 的檢測結果。
[0033] 經過定量WB分析，可以發(fā)現(xiàn)在本實施例中使用相同濃度的抗體檢測相同量的重 組人sST2蛋白時，經雜交瘤細胞株8D9和7C11分泌純化的抗體比R&D公司的商業(yè)化抗體 MAB523具有更加靈敏的檢測效果。
[0034] 圖8、使用本發(fā)明中的單克隆抗體和R&D公司的商業(yè)化抗體MAB523進行免疫沉淀 分析結果。
[0035] 分別使用雜交瘤細胞株8D9，7C11，9B3, 11E2，1A11，7F9，1A1分泌純化的抗體與 R&D公司的商業(yè)化抗體MAB523,對果蠅S2細胞穩(wěn)轉細胞株無血清培養(yǎng)液（Serum free medium)和含有10%FBS培養(yǎng)液經CdCl2誘導72h后收集樣品進行免疫沉淀分析。檢測過程 中使用的一抗為 His_Tag(2A8)Mouse mAb (Abmart)，二抗為 IRDye800CW Goat anti-Mouse IgG(H+L)抗體。
[0036] 從分析結果可以看出上述抗體均可以結合培養(yǎng)液中游離的重組人sST2蛋白。
[0037] 圖9、使用本發(fā)明中的單克隆抗體和R&D公司的商業(yè)化抗體MAB523進行流式細胞 術分析結果。
[0038] 分別使用雜交瘤細胞株8D9，7C11，9B3, 11E2，1A11，7F9，1A1分泌純化的抗體與 R&D公司的商業(yè)化抗體MAB523對人的PBL細胞進行染色分析。
[0039] 從分析結果可以看出，雜交瘤細胞株7C11分泌純化的抗體比R&D公司的商業(yè)化抗 體MAB523具有更好的分析效果，在相同的細胞群中更多表達ST2L的細胞被染色標記。
[0040] 圖10、使用本發(fā)明中提供的雙夾心酶聯(lián)免疫法分析純化的SST2重組蛋白和來源 于商業(yè)化試劑盒中的sST2蛋白標準品的標準曲線。
[0041] 分別使用抗體8D9,7C11，9B3作為包被抗體，生物素標記的抗體11E2和1A11作為 檢測抗體進行雙夾心ELISA分析。

【具體實施方式】
[0042] 本發(fā)明人經過廣泛的研究，發(fā)現(xiàn)通過基因工程手段，將編碼人sST2蛋白的基因重 組插入誘導分泌型表達載體pMT-BIP-V5/His A，將表達載體和篩選載體（pCoBlast)共同 轉染果蠅S2細胞，通過有限稀釋法可篩選得到穩(wěn)定表達人sST2重組蛋白的穩(wěn)轉細胞株，分 離純化可獲取高純度的人sST2重組蛋白，該蛋白具有與人的sST2蛋白類似的糖基化修飾 和天然構象。利用果蠅S2細胞表達純化的人sST2蛋白作為抗原，可以獲得特異性的識別 人sST2的高親和力單克隆抗體，可以應用于WB，IP，F(xiàn)ACS和ELISA分析。與R&D公司的商 業(yè)化抗體MAB523相比，本發(fā)明的抗體應用于WB和FACS分析時，具有更好的分析效果，在臨 床診斷或治療中具有重要的應用前景。
[0043] 本發(fā)明人第一次采用基因工程手段將編碼人sST2蛋白的基因導入到適當的果蠅 表達系統(tǒng)中，制備出一種在活性上與天然的人sST2蛋白非常接近的重組人sST2蛋白，用該 蛋白免疫動物可獲得靈敏地識別人體中天然的sST2蛋白的抗體，從而用于對相關疾病的 診斷或檢測。
[0044] 本發(fā)明的提供一種使用果蠅S2細胞高效表達和快速純化人sST2蛋白的方法，所 述方法包括以下步驟：
[0045] (a) PCR擴增得到編碼人sST2蛋白編碼序列
[0046] (b)將（a)所述的人sST2蛋白編碼序列插入到果蠅S2細胞表達系統(tǒng)使用表達載 體的多克隆位點，獲得了插入人sST2蛋白編碼序列的表達載體。
[0047] (c)使用（b)獲得的插入人sST2蛋白編碼序列的表達載體和篩選載體一起，利用 磷酸鈣轉染方法共同轉染S2細胞。
[0048] (d)使用抗生素篩選轉染細胞，得到穩(wěn)定轉染篩選載體或篩選載體與表達載體共 轉染的穩(wěn)定細胞株。
[0049] (e)使用有限稀釋技術結合Western blot分析方法，篩選篩選載體與表達載體共 轉染的穩(wěn)轉單克隆細胞株。
[0050] (f)擴大培養(yǎng)（e)中獲取的穩(wěn)轉單克隆細胞細胞株，加入誘導劑CdCl2誘導重組人 sST2蛋白表達。
[0051] (g)分離純化獲取人sST2重組蛋白。
[0052] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，使用的表達載體為誘導分泌型表達載體 pMT-BiP-V5/His A，使用的篩選載體為pCoBlast，表達載體與篩選載體共轉時比例為19:1.
[0053] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，使用的誘導劑CdCl2濃度為5 μ M。
[0054] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，洗脫緩沖液中使用的咪唑濃度為250mM
[0055] 本發(fā)明提供一種使用（g)中純化的人sST2重組蛋白作為抗原，制備抗人sST2蛋 白的的單克隆抗體的制備方法，所述方法包括以下步驟：
[0056] (a)免疫動物
[0057] (b)雜交瘤細胞株制備和篩選
[0058] (c)抗體亞型鑒定
[0059] (d)腹水制備和抗體純化
[0060] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，抗體亞型鑒定用雜交瘤細胞培養(yǎng)上清液稀釋比例 為 1:50
[0061] 本發(fā)明提供一種抗人sST2蛋白的抗體，其特征在于所述抗體為IgG類，κ亞型。
[0062] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，所述單克隆抗體由8D9和7C11雜交瘤細胞株產 生。
[0063] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，所述單克隆抗體由7C11雜交瘤細胞株產生。
[0064] 本發(fā)明提供一種免疫偶聯(lián)物，其特點在于該免疫偶聯(lián)物含有：
[0065] (a)本發(fā)明的單克隆抗體或人sST2重組蛋白；和
[0066] (b)選自下組的偶聯(lián)物部分：藥物，毒素，細胞因子，酶，生物素或放射性核素。
[0067] 本發(fā)明提供一種夾心酶聯(lián)免疫方法，可以定量檢測血清，組織液及細胞培養(yǎng)液中 的sST2濃度，其含有本發(fā)明的人sST2重組蛋白，單克隆抗體或免疫偶聯(lián)物，或所述抗體或 免疫偶聯(lián)物的組合。
[0068] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，所述包被抗體由8D9、7C11或9B3雜交瘤細胞株分 泌。
[0069] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，所述抗體免疫偶聯(lián)物含有由11E2或1A11雜交瘤 細胞株分泌的抗體。
[0070] 下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條 件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實驗指南，第三版，科學出版社，2002中所述的條件， 或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。
[0071] 實施例1、人SST2蛋白編碼基因的獲取
[0072] 通過檢索GenBank數據庫，查找得到關于人sST2基因的基本信息：NCBI Reference Sequence:NM_003856. 2, ORF Size:987nt Protein_id=//NP_003847. 2, 328aa〇 人sST2基因具有SEQIDN0:l所示的核苷酸序列，編碼SEQIDN0:2所示的蛋白。
[0073] 從北京義翹神州生物技術有限公司購買包含有此基因 ORF的T載體（Human IL1R4 ORF，Catalog Number :HG10105-M)以此T載體為模板，設計特異性引物，在目的片段兩端分 別引入兩個酶切位點：Kpn I和ApaL I，通過PCR方法將sST2cDNA序列插入到果蠅S2表達 系統(tǒng)（Drosophial Expression System,周保羅研究員惠贈，購自Invitrogen公司）使用的 表達載體pMT/BiP/V5-His A(周保羅研究員惠贈，購自Invitrogen公司）中，使用引物序 列如下：
[0074] Forward Primer ：5, -CCGGGTACCTGGGTTTTGGATCTTAGC-3' (SEQ ID N0:3)
[0075] Reverse Primer ：5, ~CGCGGGCCCGAAACACTCCTTAC~3' (SEQ ID NO:4)
[0076] 注：下劃線分別表示Κρη I和ApaL I酶切位點
[0077] 參照《分子克隆實驗指南》方法使用上述特異性引物對人sST2cDNA進行擴增：
[0078] PCR 體系：50μ1
[0079] 5x Phusion? HF Buffer 10μ1 10 mM dNTPs ?μ? 50 mM MgC：l2 1 μ? Forward Primer 1 μ I Reverse Primer 1 μ? Phusion DNA 聚合嚼 0.5μ1 ddH20 34.5 μ! 模板 Ιμ?
[0080] PCR 程序：
[0081]

【權利要求】
1. 一種制備人SST2蛋白的方法，其特征在于，包括以下步驟： (a) 將人sST2基因序列插入表達載體的多克隆位點中，獲得插入了人sST2基因序列的 表達載體；所述的表達載體是果蠅S2表達系統(tǒng)使用的誘導分泌型表達載體； (b) 使（a)獲得的插入了人sST2基因序列的表達載體轉入宿主細胞，獲得轉化的宿主 細胞；所述的宿主細胞是果蠅S2細胞； (c) 培養(yǎng)轉化的宿主細胞，從而表達出人sST2蛋白； (d) 分離獲得人sST2蛋白。
2. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的表達載體為pMT/BiP/V5-His A載體。
3. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟（d)中，還包括用5±2yMCdCl2誘導 表達。
4. 一種通過權利要求1所述的方法制備的人sST2蛋白。
5. -種單克隆抗體，其特征在于，所述的單克隆抗體特異性地抗權利要求4所述的人 sST2蛋白。
6. 如權利要求5所述的單克隆抗體，其特征在于，所述的單克隆抗體的亞型為IgG，κ。
7. 如權利要求6所述的單克隆抗體，其特征在于，所述單克隆抗體由選自下組的雜交 瘤細胞株產生：8D9,7C11，11E2,9B3 或 1A11。
8. -種制備抗人sST2蛋白單克隆抗體的方法，所述的方法包括步驟：培養(yǎng)雜交瘤細胞 809、7(：11、1巧2、983或認11，使用上述雜交瘤細胞制備腹水，以及從腹水中分離純化上述 細胞分泌的單克隆抗體。
9. 抗人sST2特異性單克隆抗體的雜交瘤細胞，其選自：8D9,7C11，11E2,9B3*1A11。
10. -種試劑盒，其特征在于，含有權利要求5-7任一所述的抗體。
【文檔編號】C12R1/91GK104151416SQ201310180447
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2013年5月15日 優(yōu)先權日:2013年5月15日
【發(fā)明者】藍柯, 何志祥, 李康, 張弛宇, 崔盟, 馬新蕾, 朱寅霜 申請人:中國科學院上海巴斯德研究所, 重慶凱聯(lián)投資有限公司