抗金葡菌藥物篩選系統(tǒng)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種以金黃色葡萄球菌調(diào)節(jié)蛋白（MgrA）為靶點(diǎn)的抗金黃色葡萄球菌感染藥物的篩選系統(tǒng)。它是通過(guò)將MgrA蛋白N端、MgrA蛋白C端與熒光蛋白連接成融合蛋白。本發(fā)明還提供了以該融合蛋白為基礎(chǔ)的、抗金黃色葡萄球菌感染藥物的高通量篩選系統(tǒng)。本發(fā)明為尋找抗金黃色葡萄球菌感染藥物前體提供了簡(jiǎn)捷，快速、準(zhǔn)確的方法。
【專利說(shuō)明】抗金葡菌藥物篩選系統(tǒng)

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及細(xì)胞標(biāo)靶篩選藥物系統(tǒng)，更具體地，本發(fā)明涉及建立金黃色葡萄球菌調(diào)節(jié)蛋白(MgrA)細(xì)胞靶標(biāo)快速篩選抗金黃色葡萄球菌感染藥物的系統(tǒng)和方法。

【背景技術(shù)】
[0002]金黃色葡萄球菌是引起人類感染性疾病的一種重要的病原菌，它能引起皮膚感染、心內(nèi)膜炎、肺炎和敗血癥等多種疾病?？股刂委熓瞧渲饕委熓侄?，但金黃色葡萄球菌已經(jīng)對(duì)幾乎所有已知的抗生素產(chǎn)生了耐藥性。日益嚴(yán)峻的耐藥性問(wèn)題迫使業(yè)界急需發(fā)現(xiàn)新的藥物作用靶點(diǎn)以及發(fā)展新的對(duì)抗金黃色葡萄球菌的方法。
[0003]新近出現(xiàn)了一種抗細(xì)菌感染治療的新模式一毒性蛋白(調(diào)節(jié)蛋白)靶向治療，即用藥物靶向遏制目標(biāo)菌的毒性蛋白的表達(dá)、傳遞和黏附，進(jìn)而靶向調(diào)節(jié)目標(biāo)菌的毒力表達(dá)，有效預(yù)防和治療多種感染性疾病。通過(guò)對(duì)患者施用針對(duì)病原菌毒性蛋白的藥物來(lái)降低其致病性使之無(wú)害而非將其殺滅，這樣就能大大降低耐藥菌株出現(xiàn)的幾率(CheungA.L.et al.1nfect Immun, 2005, 73:1423 ~1431, Clatworthy A.E., et al.Nat.Chem.B1l, 2007，3，541-548)。
[0004]金黃色葡萄球菌調(diào)節(jié)蛋白(MgrA)首次發(fā)現(xiàn)于2003年，是MarR (multipleantib1tic resistance regulator) /SarA (Staphylococcal accessory regulator A)蛋白家族的成員之一，調(diào)控350多個(gè)基因，并表現(xiàn)出多種生物活性，特別是在調(diào)節(jié)致病因子表達(dá)方面起著尤為重要的作用。mgrA基因位于金黃色葡萄球菌染色體中，包含444bp的堿基對(duì)，編碼147個(gè)氨基酸的MgrA蛋白。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析表明，MgrA含有螺旋-折疊-螺旋(helix-turn-helix, HTH)結(jié)構(gòu)，由2個(gè)α螺旋以一定角度的拐角構(gòu)成的結(jié)構(gòu)域,其中一個(gè)能插入并識(shí)別DNA大溝特異堿基序列的α螺旋稱為識(shí)別螺旋(recognit1n helix)；另一個(gè)α螺旋沒有堿基特異性，與DNA磷酸戊糖鏈骨架接觸。其三級(jí)結(jié)構(gòu)在與DNA特異結(jié)合時(shí)，以二聚體形式發(fā)揮作用。在這個(gè)二聚體中最要的是12位的半胱氨酸，它與113位的蘇氨酸和38位的酪氨酸形成氫鍵穩(wěn)定二聚體的結(jié)構(gòu)(Chen P.R.，et al, Nat ChemB1l,2006，2，591 - 595)。
[0005]理論上，有兩種途徑可通過(guò)抑制DNA與MgrA的結(jié)合來(lái)降低細(xì)菌的致病性。一種是找到合適的、可以選擇性地烷基化半胱氨酸殘基的烷化劑。另一種是利用高通量篩選來(lái)找到可以跟MgrA蛋白產(chǎn)生非共價(jià)鍵作用的小分子化合物。
[0006]高通量篩選是現(xiàn)代制藥的一個(gè)重要的工具，使用合適的篩選方法可以有效地找到可能的藥物分子結(jié)構(gòu)前體，大量簡(jiǎn)化藥物優(yōu)化過(guò)程的工作量。目前尚無(wú)關(guān)于建立在分子構(gòu)象基礎(chǔ)上的抗金黃色葡萄球菌感染的藥物的高通量篩選系統(tǒng)的報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于提供一種方便快速、操作簡(jiǎn)單且具有良好的特異性和敏感性的篩選抗金黃色葡萄球菌感染藥物的系統(tǒng)及其構(gòu)建方法。
[0008]在本發(fā)明的第一方面，提供一種融合蛋白，所述的融合蛋白由下列部分組成:
[0009](a) MgrA 蛋白 N 端；
[0010](b)熒光蛋白；
[0011](C)MgrA 蛋白 C 端;
[0012](d)位于(a)和(b)之間連接元件A以及位于(b)和(C)之間的連接元件B ;
[0013]所述的MgrA蛋白N端是MgrA蛋白的第I位到第110位的氨基酸序列，所述MgrA蛋白C端是MgrA蛋白的第110位到第146位的氨基酸序列。
[0014]在另一優(yōu)選例中，所述的MgrA蛋白N端的氨基酸序列如SEQ ID NOl所示，所述的MgrA蛋白C端的氨基酸序列如SEQ ID N02所示。
[0015]在另一優(yōu)選例中，所述的突光蛋白選自(但不限于)黃色突光蛋白:例如，cpVenus或 cpYFP。
[0016]在另一優(yōu)選例中，所述的連接元件(包括連接元件A和連接元件B)是長(zhǎng)度為3~8個(gè)氨基酸殘基的多肽。
[0017]在本發(fā)明的第二方面，提供了一種核酸分子，所述的核酸分子編碼所述的融合蛋白；或與所述的核酸分子互補(bǔ)。
[0018]在另一優(yōu)選例中，所述核酸分子的序列如SEQ ID N03所示。
[0019]在本發(fā)明的第三方面，提供了一種載體，它含有所述的核酸分子。
[0020]在本發(fā)明的第四方面，提供了一種基因工程化的細(xì)胞，所述的細(xì)胞含有所述的載體；或所述的細(xì)胞基因組中整合有所述的核酸分子。
[0021]在本發(fā)明的第五方面，提供了所述的融合蛋白的應(yīng)用，用于篩選抗金黃色葡萄球菌感染的物質(zhì)。
[0022]在另一優(yōu)選例中，所述的抗金黃色葡萄球菌感染的物質(zhì)能夠改變MgrA蛋白的構(gòu)象。
[0023]在本發(fā)明的第六方面，提供了一種篩選以MgrA蛋白為靶點(diǎn)的抗金黃色葡萄球菌感染的潛在物質(zhì)的方法，所述方法包括以下步驟:
[0024]( I)將候選物質(zhì)與所述的融合蛋白接觸；
[0025](2)觀察候選物質(zhì)對(duì)融合蛋白的熒光信號(hào)強(qiáng)度的影響；
[0026]其中，若所述候選物質(zhì)可使所述融合蛋白的熒光信號(hào)強(qiáng)度增強(qiáng)，則表明該候選物質(zhì)是抗金黃色葡萄球菌感染的潛在物質(zhì)。
[0027]在另一優(yōu)選例中，步驟(1)包括將候選物質(zhì)與所述的基因工程化的細(xì)胞接觸。
[0028]在另一優(yōu)選例中，步驟(1)包括:在測(cè)試組中，在所述的細(xì)胞的培養(yǎng)物中添加候選物質(zhì)；和/或
[0029]步驟(2)包括:檢測(cè)測(cè)試組的細(xì)胞的熒光信號(hào)強(qiáng)度，并與對(duì)照組比較，其中，所述的對(duì)照組是不添加所述候選物質(zhì)的所述的細(xì)胞。
[0030]在另一優(yōu)選例中，若所述候選物質(zhì)可使所述融合蛋白或基因工程化的細(xì)胞的熒光信號(hào)強(qiáng)度增強(qiáng)1.5倍以上，則表明該候選物質(zhì)是抗金黃色葡萄球菌感染的潛在物質(zhì)。
[0031]在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括步驟:對(duì)獲得的潛在物質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和/或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，以篩選出抗金黃色葡萄球菌感染有效的物質(zhì)。
[0032]本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0033]圖1:突光蛋白探針構(gòu)建思路圖。
[0034]圖2:基于MgrA構(gòu)象變化的熒光篩選方法。
[0035]圖3:MgrA-cpYFP對(duì)MDSA的選擇性熒光響應(yīng)，
[0036]其中，縱坐標(biāo)為相對(duì)熒光強(qiáng)度，
[0037]A) BL21 (DE3) /pET28-MgrA_cpYFP 對(duì) MDSA 的選擇性熒光響應(yīng)，
[0038]B)融合蛋白對(duì)MDSA的選擇性熒光響應(yīng)。
[0039]圖4 =MgrA熒光融合蛋白的構(gòu)建以及其對(duì)小分子抑制劑的選擇性響應(yīng)。
[0040]圖5:熒光倍增值在1.5倍以上的中草藥提取物。
[0041]圖6:基于目標(biāo)蛋白構(gòu)象改變篩選體系。
[0042]圖7 =EMAS驗(yàn)證高通量篩選出的中草藥提取物對(duì)MgrA-DNA結(jié)合的影響。
[0043]圖8:篩選出的中草藥提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的正常生長(zhǎng)影響。
[0044]圖9:EMSA第二輪篩選出的部分中草藥提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的抗藥性及對(duì)MgrA所調(diào)控的主動(dòng)外排基因啟動(dòng)子DNA的影響。
[0045]圖10:二輪篩選出的332號(hào)中草藥提取物對(duì)MgrA-DNA結(jié)合的劑量效應(yīng)。
[0046]圖11:小鼠感染模型實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
[0047]圖12:PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分析
[0048]A.Vector PCR, I:SN-MgrA ；2:AS-MgrA ；3:SP-MgrA ；4:DK_MgrA。
[0049]B.1nsert PCR (cpYFP 及 cpVenus)。
[0050]圖13:pET28b-MgrA-cpYFP 雙酶切鑒定。
[0051]其中，VT，SD，SN，AS，SP，DK。
[0052]圖14:基于熒光各向異性的高通量篩選原理。

【具體實(shí)施方式】
[0053]本發(fā)明人通過(guò)研究金黃色葡萄球菌中調(diào)節(jié)蛋白MgrA的工作機(jī)理和功能,經(jīng)紅外圓二色譜檢測(cè)證實(shí)了小分子與MgrA蛋白結(jié)合時(shí)會(huì)引起該蛋白質(zhì)本身的三級(jí)結(jié)構(gòu)改變。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明人設(shè)想構(gòu)建一種基于靶標(biāo)蛋白MgrA本身構(gòu)象響應(yīng)的熒光蛋白質(zhì)探針以用于藥物的高通量篩選，即小分子與MgrA —旦相互作用，就會(huì)改變與MgrA相融合的熒光基團(tuán)的熒光強(qiáng)度。為此，本發(fā)明人設(shè)計(jì)了一系列黃色熒光蛋白探針用于檢測(cè)靶標(biāo)蛋白MgrA與DNA的結(jié)合，經(jīng)過(guò)了一系列的試驗(yàn)和參數(shù)優(yōu)化，終于成功構(gòu)建了抗金黃色葡萄球菌感染藥物的高通量篩選系統(tǒng)。
[0054]融合蛋白
[0055]本發(fā)明以MgrA靶點(diǎn)蛋白作為感應(yīng)分子，并連接融合對(duì)外界因素敏感的熒光基團(tuán)。當(dāng)小分子與MgrA結(jié)合之后會(huì)導(dǎo)致MgrA效應(yīng)蛋白的構(gòu)象發(fā)生變化，同時(shí)構(gòu)象變化信號(hào)可以被熒光報(bào)告基團(tuán)接受，最終達(dá)到通過(guò)熒光強(qiáng)度的變化進(jìn)行檢測(cè)的目的(圖1)。
[0056]在前期試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,本發(fā)明人將cpVenus/cpYFP插入到MgrA的SllO與Nlll之間形成MgrA-cpYFP融合蛋白，與本發(fā)明通過(guò)基于熒光各向異性高通量篩選得到的針對(duì)性化合物 MDSA 即 5，5’ -亞甲基二水楊酸(參見 Li, Z.，et al, Chem B1l.2011August26; 18 (8):1032 - 1041.)作用，發(fā)現(xiàn)MDSA使得融合蛋白的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)到1.9倍左右(圖3)，并表現(xiàn)一定濃度效應(yīng)和選擇特異性；在隨后的活體細(xì)菌實(shí)驗(yàn)中也得到了相應(yīng)的結(jié)果，證實(shí)了本發(fā)明的抗金黃色葡萄球菌感染藥物的高通量篩選系統(tǒng)是可行的。研究表明，cpVenus/cpYFP插入到這段區(qū)域中，形成融合蛋白時(shí)，一旦小分子化合物與MgrA發(fā)生作用即會(huì)引起這個(gè)區(qū)域的α 5螺旋斷裂成兩段,從而拉動(dòng)cpVenus/cpYFP的發(fā)色團(tuán)更加靠近,使cpVenus/cpYFP的熒光信號(hào)倍增(圖2)。在此基礎(chǔ)上，通過(guò)插入位點(diǎn)的進(jìn)一步篩選和關(guān)鍵位點(diǎn)的突變，可以提高這種檢測(cè)方法的靈敏度、特異性。
[0057]本發(fā)明人以MDSA為模式化合物的研究結(jié)果表明，有些融合熒光探針，如SP-MgrA-cpYFP 和 VT-MgrA-cpYFP 等對(duì) MDSA 無(wú)響應(yīng)或者效果差，SN-MgrA-cpYFP 或者SN-MgrA-cpVenus效果明顯。而SN-MgrA_cpYFP (C12S)則是活性最好的一個(gè)探針，對(duì)MDSA的響應(yīng)最明顯，而且表現(xiàn)出顯著特異性。經(jīng)過(guò)反復(fù)探索，本發(fā)明人終于獲得熒光探針融合蛋白探針SN-MgrA-cpYFP，此融合蛋白在大腸桿菌中可以有效表達(dá)并用作小分子對(duì)MgrA-DNA相互作用的特異性的監(jiān)測(cè)探針(圖4)。
[0058]進(jìn)而,本發(fā)明提供了一種融合蛋白，其包括MgrA蛋白N端、突光蛋白和MgrA蛋白C端以及位于MgrA蛋白N端(C端)和熒光蛋白之間的連接元件。它們的組裝是通過(guò)基因編碼的形式，把熒光蛋白的基因序列整體插入到MgrA的基因序列中。這樣MgrA蛋白被分成了二個(gè)部分即N端蛋白和C端蛋白。
[0059]其中，MgrA即金黃色葡萄球菌調(diào)節(jié)蛋白，其蛋白序列登錄號(hào)為YP_001441273。MgrA編碼基因的堿基序列登錄號(hào)為RefSeq:NC_009782.1。
[0060]如本發(fā)明所用，“MgrA蛋白N端”是指與SEQ ID NOl的氨基酸序列相比，有至多10個(gè)，較佳地至多8個(gè)，更佳地至多5個(gè)，最佳地至多3個(gè)氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成的多肽。這些保守性變異多肽可以根據(jù)表1進(jìn)行氨基酸替換而產(chǎn)生。
[0061]如本發(fā)明所用，“MgrA蛋白C端”是指與SEQ ID N02的氨基酸序列相比，有至多10個(gè)，較佳地至多8個(gè)，更佳地至多5個(gè)，最佳地至多3個(gè)氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成的多肽。這些保守性變異多肽可以根據(jù)表1進(jìn)行氨基酸替換而產(chǎn)生。
[0062]表1性質(zhì)相近的氨基酸取代
[0063]

【權(quán)利要求】
1.一種融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白由下列部分組成: (a)MgrA蛋白N端； (b)熒光蛋白； (c)MgrA蛋白C端； (d)位于(a)和(b)之間的連接元件A以及位于(b)和(c)之間的連接元件B； 所述的MgrA蛋白N端是MgrA蛋白的第I位到第110位的氨基酸序列,所述MgrA蛋白C端是MgrA蛋白的第110位到第146位的氨基酸序列。
2.如權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的MgrA蛋白N端的氨基酸序列如SEQ ID NOl所示，所述的MgrA蛋白C端的氨基酸序列如SEQ ID N02所示。
3.如權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的熒光蛋白是黃色熒光蛋白。
4.如權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的連接元件A和連接元件B是長(zhǎng)度為3~8個(gè)氨基酸殘基的多肽。
5.—種核酸分子,其特征在于， (i)所述的核酸分子編碼如權(quán)利要求1所述的融合蛋白；或者 (?)所述的核酸分子與(i)所述的核酸分子互補(bǔ)。
6.如權(quán)利要求5所述的核酸分子，其特征在于，所述的核酸分子的序列如SEQID N03所示。
7.—種載體，其特征在于，它含有如權(quán)利要求5所述的核酸分子。
8.一種基因工程化的細(xì)胞，其特征在于，所述的細(xì)胞含有如權(quán)利要求7所述的載體；或者 所述的細(xì)胞基因組中整合有如權(quán)利要求5所述的核酸分子。
9.權(quán)利要求1所述的融合蛋白的應(yīng)用，其特征在于，用于篩選抗金黃色葡萄球菌感染的潛在物質(zhì)。
10.如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的抗金黃色葡萄球菌感染的潛在物質(zhì)能夠改變MgrA蛋白的構(gòu)象。
11.一種篩選以MgrA蛋白為靶點(diǎn)的抗金黃色葡萄球菌感染的潛在物質(zhì)的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟: (1)將候選物質(zhì)與權(quán)利要求1所述的融合蛋白接觸； (2)觀察候選物質(zhì)對(duì)融合蛋白的熒光信號(hào)強(qiáng)度的影響； 其中，若所述候選物質(zhì)可使所述融合蛋白的熒光信號(hào)強(qiáng)度增強(qiáng)，則表明該候選物質(zhì)是抗金黃色葡萄球菌感染的潛在物質(zhì)。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，步驟(1)包括將候選物質(zhì)與權(quán)利要求8所述的細(xì)胞接觸。
13.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于， 步驟(1)包括:在測(cè)試組中，在權(quán)利要求8所述的細(xì)胞的培養(yǎng)物中添加候選物質(zhì)；和/或 步驟(2)包括:檢測(cè)測(cè)試組的細(xì)胞的熒光信號(hào)強(qiáng)度，并與對(duì)照組比較； 其中，所述的對(duì)照組是不添加所述候選物質(zhì)的權(quán)利要求8所述的細(xì)胞。
14.如權(quán)利要求11~13所述的任一方法，其特征在于，若所述候選物質(zhì)可使所述融合蛋白或細(xì)胞的熒光信號(hào)強(qiáng)度增強(qiáng)1.5倍以上，則表明該候選物質(zhì)是抗金黃色葡萄球菌感染的潛在物質(zhì)。
15.如權(quán)利要求11~13所述的任一方法，，其特征在于，所述方法還包括步驟(3):對(duì)獲得的潛在物質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和/或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，以篩選出抗金黃色葡萄球菌感染有效的 物質(zhì)。
【文檔編號(hào)】C12N15/62GK104163868SQ201310185248
【公開日】2014年11月26日 申請(qǐng)日期:2013年5月17日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月17日
【發(fā)明者】徐宏喜, 李子剛, 譚紅勝, 梁宇杰, 胡冬冬, 勞遠(yuǎn)至, 王雨潔 申請(qǐng)人:上海中醫(yī)藥大學(xué)