專利名稱：鷹嘴豆殼二孢葉枯病真菌分子檢測引物及其應(yīng)用的制作方法
鷹嘴豆殼二孢葉枯病真菌分子檢測引物及其應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于農(nóng)作物病害檢測、鑒定及防治技術(shù)的領(lǐng)域，更具體涉及一種鷹嘴豆殼二孢葉枯病菌分子檢測引物及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
由鷹嘴豆殼二孢葉枯病病原菌Ascochyta rabiei引起的鷹嘴豆殼二孢葉枯病是一種毀滅性的病害，該病于2007年首次在新疆木壘縣發(fā)現(xiàn)，一旦發(fā)病會造成大面積的減產(chǎn)。目前該病害已對我國鷹嘴豆生產(chǎn)構(gòu)成了威脅。病菌主要以土壤、種子帶菌，并以菌絲體和分生孢子在落葉上越冬，翌年初夏產(chǎn)生新的分生孢子。分生孢子借風(fēng)雨傳播，到達(dá)葉面后由氣孔侵入，引起初侵染。病菌侵入寄主后，經(jīng)過一定時(shí)期，可以產(chǎn)生新的分生孢子，引起再次侵染。植株生長茂密，當(dāng)天氣潮濕或田間濕度大時(shí)易發(fā)病，基部接近地面葉片發(fā)病尤為嚴(yán)重。因此，開展鷹嘴豆殼二孢葉枯病菌檢測，防止其從發(fā)病區(qū)向未發(fā)病區(qū)傳播，以及在其發(fā)病初期進(jìn)行診斷檢測，對鷹嘴豆殼二孢葉枯病的傳播與控制具有重要意義。
自從發(fā)現(xiàn)鷹嘴豆殼二孢葉枯病以來，各國研究人員便對其檢測技術(shù)進(jìn)行研究。傳統(tǒng)的檢測方法是從病殘?bào)w或帶病種子分離菌體，將其接種在相應(yīng)培養(yǎng)基上，于適宜溫度培養(yǎng)數(shù)天，再對這些菌體的形態(tài)進(jìn)行觀察。若產(chǎn)孢則繼續(xù)觀察分生孢子的形態(tài)特征，從菌落上挑片鏡檢，觀察菌絲、分生孢子、分生孢子梗等形態(tài)。從而確定是否存在鷹嘴豆殼二孢葉枯病病原菌Ascochyta rabiei，或者用肉眼和借助顯微鏡技術(shù)對發(fā)病癥狀進(jìn)行判定是否由鷹嘴豆殼二孢葉枯病病原菌Ascochyta rabiei引起的病害。傳統(tǒng)的檢測方法不僅費(fèi)時(shí)、準(zhǔn)確度低，而且要求檢測人員要有豐富的經(jīng)驗(yàn)，最重要一點(diǎn)是它不能滿足病害防治中制定最佳防治時(shí)期及海關(guān)進(jìn)出境快速檢測和鑒定的需求，因此傳統(tǒng)病原學(xué)檢測方法已不能滿足現(xiàn)代植物病理學(xué)研究的需要。
現(xiàn)在部分病原菌免疫血清學(xué)鑒定方法已經(jīng)建立，但是特異性差，常常受到相似種的干擾，也受到抗血清質(zhì)量的影響，血清學(xué)檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性取決于抗血清的質(zhì)量，單克隆抗體的?；蕴珡?qiáng)，主要用于流行學(xué)中檢測菌系，通常將多種單克隆抗體混合使用，已消除過度?；膯栴}。目前認(rèn)為在檢測應(yīng)用方面，多克隆抗體要優(yōu)于單抗，而多克隆抗體又易與親緣關(guān)系相近的細(xì)菌發(fā)生交叉反應(yīng)。因此，常規(guī)血清學(xué)方法的應(yīng)用受到了一定的限制。隨著生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，應(yīng)用PCR技術(shù)對病原菌進(jìn)行特異、靈敏快速分子檢測的成功例子已越來越多。國內(nèi)外有學(xué)者利用基于ITS堿基序列設(shè)計(jì)引物對真菌的分子檢測開展研究，但針對鷹嘴豆殼二孢葉枯病病原菌Ascochyta rabiei的研究尚少。因此要對鷹嘴豆殼二孢葉枯病病原菌Ascochyta rabiei進(jìn)行高特異性檢測，從病原菌ITS堿基序列設(shè)計(jì)高特異引物是非常必要的。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中鷹嘴豆殼二孢葉枯病菌的生物學(xué)檢測方法所需周期長、準(zhǔn)確度低等問題，提供一種鷹嘴豆殼二孢葉枯病菌分子檢測引物 及其應(yīng)用，該特異引物:上游引物 7-5f (25bp): 5 ' -CCCGCTACCTCTTACCCATGTCTTT-3 ';下游引物 7-5r(23bp):5/ -GTCGTTATGAGTGCAAAGCGCGA-3'。經(jīng)過 PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳，可在鷹嘴豆殼二孢葉枯病病原菌純DNA，發(fā)病組織、土壤及帶病種子中特異地?cái)U(kuò)增出片段長度為 440bp的特異擴(kuò)增產(chǎn)物，對鷹嘴豆殼二孢葉枯病病原菌的快速檢測。本發(fā)明所述的特異分子檢測引物可被用于生產(chǎn)實(shí)踐中感染鷹嘴豆殼二孢葉枯病的植物組織、土壤和種子中的快速、，靈敏、特異的檢測，同時(shí)可用于田間病害的早期診斷和病菌的監(jiān)測和鑒定，為鷹嘴豆殼二孢葉枯病菌引起的病害的防治提供可靠的技術(shù)和理論依據(jù)。
本發(fā)明所述的一種鷹嘴豆殼二孢葉枯病真菌分子檢測引物，該引物序列為:
上游引物7-5f25bp:5' -CCCGCTACCTCTTACCCATGTCTTT-3'
下游引物7-5r23bp:5' -GTCGTTATGAGTGCAAAGCGCGA-3'。
所述鷹嘴豆殼二孢葉枯病真菌分子檢測引物的用途，利用上游引物 7-5f25bp:5 ' -CCCGCTACCTCTTACCCATGTCTTT-3 '，下游引物 7_5r23bp:-GTCGTTATGAGTGCAAAGCGCGA-3'從鷹嘴豆殼二孢葉枯病真菌上特異擴(kuò)增出440bp的產(chǎn)物。
本發(fā)明所述的鷹嘴豆殼二孢葉枯病真菌分子檢測引物及其應(yīng)用，包括下列步驟:
(I)鷹嘴豆殼二孢葉枯病病原菌Ascochyta rabiei的分離、純化，采用常規(guī)分離真菌的方法對其進(jìn)行分離，采用單孢分離進(jìn)行純化；
(2)鷹嘴豆殼二孢葉枯病病原菌Ascochyta rabiei的培養(yǎng):將鷹嘴豆殼二孢葉枯病病原菌Ascochyta rabiei接種到鷹嘴豆煎汁PDA平板上，置溫度26°C溫箱中培養(yǎng)15d， 備用;
(3)鷹嘴豆殼二孢葉枯病病原菌Ascochyta rabiei的DNA提取和檢測:將50mg冷凍干燥后的菌絲和孢子粉至研缽內(nèi)加入液氮充分研磨，倒入離心管中，加入200μ L2%十六烷基三甲基溴化銨裂解液(lOOmmol/L三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸，pH8.0 ；20mmol/L乙二胺四乙酸，pH8.0 ；1.4mol/LNaCl)和少量石英砂充分研磨，再加入300 μ L2%十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)裂解液，將樣品充分混勻，溫度65°C，水浴lh(5-10min混勻一次)取出放置室溫，加入等體積的氯仿/異戊醇(v/v) (24: I)，充分 顛倒混勻，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心 lOmin，取上清液至新的離心管中，繼續(xù)抽提一次，取上清液至新的離心管中，加入等體積預(yù)冷異丙醇充分顛倒混勻，溫度4°C，放置l_2h促進(jìn)DNA沉淀，12000轉(zhuǎn)/分鐘，溫度4°C，離心 IOmin ;棄上清加入500 μ L濃度70%乙醇混勻，12000轉(zhuǎn)/分鐘，溫度4°C，離心5min ;棄上清，在超凈工作臺上自然晾干無酒精味后加入適量的lXTE(10mmOl/L三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸，0.lmmol/L乙二胺四乙酸，pH8.0)緩沖液進(jìn)行溶解(TE中含5 μ g/ μ L核糖核酸酶RNase)，得到DNA溶液，用紫外分光光度計(jì)檢測DNA濃度并稀釋至50ng/ μ L待用；
(4)鷹嘴豆殼二孢葉枯病病原菌Ascochyta rabiei的ITS序列擴(kuò)增及電泳檢測:采用通用弓丨物ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和 ITS4(5，-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’ )對鷹嘴豆殼二孢葉枯病病原菌 Ascochyta rabiei的DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增目的片段5.8S rDNA, PCR反應(yīng)體系(25 μ L) 含 IOXbuffer2.5 μ L，脫氧核酸三磷酸基質(zhì)(dNTPs) (2.5mM each) 2.5 μ L，引物 ITSl/ ITS4 (10 μ Μ)各 0.5 μ L，Taq DNA 聚合酶(Takara) 0.5 μ L，DNA 模板 2 μ L,無菌去離子水補(bǔ)足至25 μ L，反應(yīng)條件:溫度94°C預(yù)變性5min，溫度94°C變性50s，溫度51°C退火50s，72延伸2min，共30各循環(huán)，最后溫度72°C lOmin，溫度4°C保存；PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用I. 0%瓊脂糖凝 膠電泳檢測，于凝膠成像系統(tǒng)中觀察；將條帶單一清晰明亮的PCR產(chǎn)物直接送去生物公司 進(jìn)行測序，所得序列與GenBank中Ascochyta rabiei屬的ITS序列進(jìn)行BLAST比對,確定 其種屬關(guān)系；(5)下載GenBank已公開報(bào)道鷹嘴豆殼二孢葉枯病病原菌Ascochyta rabiei的 同屬其它 ITS 序列，登錄號分別為 AY152550，DQ822479, DQ822480, EU167600, FJ032643, HQ700312, JF714463，將其與測得的鷹嘴豆殼二孢葉枯病病原菌Ascochyta rabiei的ITS 序列利用DNAMAN軟件進(jìn)行比較(圖I)，選定特有的一段保守序列，即ITS序列的l_440bp， 并根據(jù)其利用primer5. O軟件設(shè)計(jì)一對針對Ascochyta rabiei的特異引物即特異分子檢 測引物7-5f/7-5r，引物序列為上游引物7-5f(25bp) 5/ -CCCGCTACCTCTTACCCATGTCTTT-3'下游引物7-5r(23bp) 5/ -GTCGTTATGAGTGCAAAGCGCGA-3'；序列比對AY152550 .....ATCATTACCTAGAGTTTGTGGGCTTTGCCCGCTAC 35DQ822479 ____g----------------------------------- 36DQ822480 ____g----------------------------------- 36EU167600 gaagg----------------------------------- 1720FJ032643 gaagg----------------------------------- 58HQ700312 gaagg-------------------------------1--- 59JF714463 .......ggggct----c_g_a------------------ 33ITS........................................ 8AY152550 CTCTTACCCATGTCTTTTGAGTACTTACGTTTCCTCGGCG 75DQ822479 ---------------------------------------- 76DQ822480 ---------------------------------------- 76EU167600 ---------------------------------------- 1760FJ032643 ---------------------------------------- 98HQ700312 ---------------------------------------- 99JF714463 --------------------------------------------------------------------------------3ITS---------------------------------------- 48AY152550 GGTCCGCCCGCCGATTGGACAAAATCAAACCCTTTGCAGT 115DQ822479 ---------------------------------------- 116DQ822480 ---------------------------------------- 116EU167600 ---------------------------------------- 1800FJ032643 ---------------------------------------- 138HQ700312 ---------------------------------------- 139JF714463 ---------------------------------------- 113ITS---------------------------------------- 88AY152550 TGCAATCAGCGTCTGAAAAACATAATAGTTACAACTTTCA 155DQ822479 ----------------------------------------
權(quán)利要求
1.一種鷹嘴豆殼二孢葉枯病真菌分子檢測引物，其特征在于該引物序列為上游引物 7-5f25bp 5/ -CCCGCTACCTCTTACCCATGTCTTT-3'下游引物 7-5r23bp :5' -GTCGTTATGAGTGCAAAGCGCGA-3'。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的鷹嘴豆殼二孢葉枯病真菌分子檢測引物的用途，其特征在于利用上游引物 7-5f25bp 5 ' -CCCGCTACCTCTTACCCATGTCTTT-3 '，下游引物 7_5r23bp 5' -GTCGTTATGAGTGCAAAGCGCGA-3'從鷹嘴豆殼二孢葉枯病真菌上特異擴(kuò)增出440bp的產(chǎn)物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種鷹嘴豆殼二孢葉枯病真菌分子檢測引物及其應(yīng)用，該特異引物上游引物7-5f(25bp)5′-CCCGCTACCTCTTACCCATGTCTTT-3′；下游引物7-5r(23bp)5′-GTCGTTATGAGTGCAAAGCGCGA-3′。經(jīng)過PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳，可在鷹嘴豆殼二孢葉枯病病原菌純DNA，發(fā)病組織、土壤及帶病種子中特異地?cái)U(kuò)增出片段長度為440bp的特異擴(kuò)增產(chǎn)物，對鷹嘴豆殼二孢葉枯病病原菌的快速檢測。本發(fā)明的特異分子檢測引物及其用法可被用于生產(chǎn)實(shí)踐中感染鷹嘴豆殼二孢葉枯病的植物組織、土壤和種子中的快速、，靈敏、特異的檢測，同時(shí)可用于田間病害的早期診斷和病菌的監(jiān)測和鑒定，為鷹嘴豆殼二孢葉枯病菌引起的病害的防治提供可靠的技術(shù)和理論依據(jù)。
文檔編號C12R1/645GK103255221SQ20131018628
公開日2013年8月21日 申請日期2013年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月20日
發(fā)明者羌松, 馬麗娟, 馬德英 申請人:新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)