專利名稱：鷹嘴豆殼二孢葉枯病環(huán)介導等溫擴增快速檢測方法
技術領域：
本發(fā)明設涉及一種利用環(huán)介導等溫擴增技術進行菌樣的快速檢測的方法，具體是一種鷹嘴豆殼二孢葉枯病病原菌Ascochyta rabiei的環(huán)介導等溫擴增快速檢測方法。
背景技術：
鷹嘴豆殼二孢葉枯病由鷹嘴豆殼二孢葉枯病病原菌Ascochyta rabiei引起,是一種毀滅性的病害。1911年，鷹嘴豆殼二孢葉枯病在巴基斯坦被首次發(fā)現(xiàn)，該病害的危害性很高，在鷹嘴豆的重要種植區(qū)巴基斯坦，年受害面積高達25-50%。冷涼的氣候非常適合病害發(fā)展，常造成100%的產(chǎn)量損失。2007年，該病害在新疆北部的鷹嘴豆主栽區(qū)昌吉州木壘縣、奇臺縣等地暴發(fā)，其中僅在木壘縣發(fā)病面積為4000hm2，平均為害株率46%，嚴重田塊為害株率達到100%，產(chǎn)量損失率為40% -50%。該病害主要危害葉片、葉柄、莖桿，也可侵染幼嫩的莢果。葉片被害后由葉緣向內(nèi)擴散，形成“U”形或“V”形淺褐色至深褐色病斑，潮濕時病斑上產(chǎn)生分散的細小黑點，葉柄和莖桿受害初期產(chǎn)生水浸狀病斑，隨后病斑逐漸變?yōu)樯詈稚?，病斑處凹陷并逐漸萎蔫干枯造成落葉斷枝，嚴重時整株枯萎死亡。豆莢受害初期產(chǎn)生水浸狀病斑，然后變成深褐色病斑，嚴重時豆莢干枯。雨水偏多年份，發(fā)病嚴重，產(chǎn)量損失極大。因此，開展鷹嘴豆殼二孢葉枯病菌檢測，防止其從發(fā)病區(qū)向未發(fā)病區(qū)傳播，以及在其發(fā)病初期進行診斷檢測，對鷹嘴豆殼二孢葉枯病的傳播與控制具有重要意義。自從發(fā)現(xiàn)鷹嘴豆殼二孢葉枯病以來，各國研究人員便對其檢測技術進行研究。傳統(tǒng)的檢測方法是從病殘體或帶病種子分離菌體，將其接種在相應培養(yǎng)基上，于適宜溫度培養(yǎng)數(shù)天，再對這些菌體的形態(tài)進行觀察。若產(chǎn)孢則繼續(xù)觀察分生孢子的形態(tài)特征，從菌落上挑片鏡檢，觀察菌絲、分生孢子、分生孢子梗等形態(tài)。從而確定是否存在鷹嘴豆殼二孢葉枯病病原菌Ascochyta rabiei，或者用肉眼和借助顯微鏡技術對發(fā)病癥狀進行判定是否由Ascochyta rabiei引起的病害。傳統(tǒng)的檢測方法不僅操作繁瑣、費時,而且要求有高度的專業(yè)知識，尤其不能滿足病害防治中快速診斷及海關進出境快速檢測和鑒定的需求。基因芯片技術雖然能夠同時進行多種真菌的鑒定，但成本高，制約了其發(fā)展；雜交方式固有的局限性影響了其特異性；質譜技術以其快速真確的優(yōu)點被用于微生物鑒定，由于質譜鑒定必須是培養(yǎng)后分純的單克隆菌落，而且設備昂貴，操作難度高，因此，限制了其應用。近年來，隨著分子生物學技術的迅速發(fā)展，出現(xiàn)了多種核酸擴增方法，如鏈替代擴增反應(Strand Displacement Amplification, SDA),滾環(huán)擴增(Rolling CircleAmplification, RCA),以及目前被廣泛使用的聚合酶鏈式反應(Polymerase ChainReaction, PCR)等。這些擴增方法都有其啟動新一輪核酸合成的創(chuàng)新之處。 其中，基于rDNA-1TS的長度多態(tài)性和序列多態(tài)性的序列分析，由于可以從不太長的核酸序列中獲得相對足夠的信息用來反應生物親緣關系與分類情況，因而成為真菌分類及鑒定研究的熱點，目前已廣泛應用于真菌的屬種間及種內(nèi)組群水平的系統(tǒng)學研究。因此，應用PCR技術對病原菌進行特異、靈敏快速分子檢測的成功例子已越來越多。國內(nèi)外有學者利用基于ITS堿基序列設計引物對真菌的分子檢測開展研究，但PCR方法需要昂貴的PCR儀，對設備要求較高，不適宜在基層進行推廣。環(huán)介導等溫擴增技術(Loop-mediatdIsothermal Amplification,簡稱 LAMP)，是2000年由日本的榮研株式會的Notomi T等人開發(fā)出來的一種新的核酸擴增方法。LAMP法是針對靶基因的6個區(qū)域設計4種特異的引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶在恒溫條件(65°C左右)保溫幾十分鐘，即可完成核酸擴增反應，具有高特異性和等溫快速擴增的特點，可以在Ih之內(nèi)，將靶DNA片段擴增IO9-1Oltl倍。反應完成后，直接在擴增產(chǎn)物中添加SYBR GREEN I染料后，可通過肉眼觀察有無熒光直接判定結果，體系呈綠色即為陽性，呈橙色即為陰性?；蛟贒NA延生合成時，從脫氧核酸三磷酸基質(dNTPs)中析出的焦磷酸離子與反應溶液中鎂離子結合，會產(chǎn)生一種焦磷酸鎂的衍生物，而高效擴增的LAMP法生成大量這樣的衍生物，并呈現(xiàn)白色沉淀?？梢园褱啙岫茸鳛殍b定指標，只要用肉眼觀察白色渾濁沉淀，就能鑒定擴增與否，而不需要繁瑣的電泳和紫外觀察等過程。具有高特異性、快速靈敏、高效、操作簡便等特點。已廣泛應用于臨床疾病的診斷、流行性細菌或病毒的定性及定量檢測。因為LAMP反應不需要PCR儀和昂貴的試劑，所以利于在一些基層機構的應用，有著極為廣泛的應用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種鷹嘴豆殼二孢葉枯病病原菌的環(huán)介導等溫擴增快速檢測方法，該方法包括真菌DNA的提取、真菌的環(huán)介導等溫擴增、顯示檢測步驟完成，以克服現(xiàn)有技術所需周期長、操作復雜等等問題，該方法優(yōu)點是快速、特異性強、靈敏度高，且成本低，可用于田間鷹嘴豆殼二孢葉枯病的早期診斷和病菌的監(jiān)測和鑒定。本發(fā)明所述的一種鷹嘴豆殼二孢葉枯病環(huán)介導等溫擴增快速檢測方法，按下列步驟進行:a、待檢樣品或真菌的DNA提取:
采用常規(guī)真菌DNA提取方法提取待檢樣品核酸，其中提取樣品DNA的0D26(l/0D28(l為
1.6-2.0，濃度為 IO-1OOng/ μ L ；b、進行鷹嘴豆殼二孢葉枯病真菌的環(huán)介導等溫擴增反應:在裝有22 μ L環(huán)介導等溫擴增反應液的反應管中加入2 μ L待檢樣品模板DNA和IyL Bst DNA聚合酶，于恒溫65 °C擴增反應30_60min，將溫度調(diào)到80°C終止反應，3_5min后取出待檢；C、顯色檢測:在每個反應管中加入I μ L顯色劑，直接用肉眼觀察顏色變化，反應液顏色變?yōu)榫G色，即為待檢樣品中含有或為鷹嘴豆殼二孢葉枯病真菌。步驟b中環(huán)介導等溫擴增反應液是由IOXThermopol反應緩沖液、1.0-1.4mmol/L脫氧核酸三磷酸基質、4-8mmol/L硫酸鎂、0.8-1.6 μ mol/L上游內(nèi)引物FIP、0.8-1.6 μ mol/L下游內(nèi)引物ΒΙΡ、0.2-0.3 μ mol/L上游外引物F3、0.2-0.3 μ mol/L下游外引物B3、
0.2-0.8 μ mol/L上游環(huán)引物LF和0.2-0.8 μ mol/L下游環(huán)引物LB組成，其中:上游外引物F3:5 ’ -CTTGGTATTCCATGGGGCAT-3，；下游外引物B3:5 ’ -ACTTTTGGACGTCGTCGTTAT-3 ’ ；上游內(nèi)引物FIP: 5 ’ -GAGGCGAGACAAACACCCAACA-GCCTGTTCGAGCGTCATT-3，；
下游外引物BIP:5’ -CGCCTTAAAACAATTGGCAGCCG-GAGTGCAAAGCGCGAGAT-3’ ；上游環(huán)引物LF:5，-CCAAGCAAAGCTTGAAGGTACA-3，；下游環(huán)引物 LB: 5 ’ -GCGTATTGATTTCGGAGCGCAGT-3 ’。步驟b環(huán)介導等溫擴增反應液中IOXThermopol反應緩沖液中含有200mmolpH8.8的三輕基甲基氨基甲燒-鹽酸、100mmol/L氯化鉀、100mmol/L硫酸銨、20mmol/L硫酸鎂和1%曲拉通X-100。步驟b環(huán)介導等溫擴增反應液中的脫氧核酸三磷酸基質由dUTP、dATP、dGTP和dCTP四種脫氧核糖核酸組成，其中四種脫氧核糖核酸的質量比為dUTP: dATP: dGTP: dCTP = 2:1:1:1。步驟b中Bst DNA聚合酶為8U/ μ L。步驟c中顯色劑為10%的熒光染料SYBR GREEN I。本發(fā)明所述的一種鷹嘴豆殼二孢葉枯病病原菌的環(huán)介導等溫擴增快速檢測方法，該方法的主要原理為:(1)特殊設計一組可以識別靶DNA六個不同序列的兩個內(nèi)引物(上游內(nèi)引物和下游內(nèi)引物)和兩個外引物(上游外引物和下游外引物)，內(nèi)引物包含靶DNA的正義鏈和反義鏈；(2)其中一個內(nèi)引物首先和靶DNA雜交，隨后的鏈置換DNA合成具有高度鏈置換活性的DNA聚合酶的參與下由一個外引物啟動，釋放出單鏈DNA，并作為由雜交到靶的另一端的一個內(nèi)弓I物和一個外引物啟動的DNA合成模板，產(chǎn)生一個原始的莖環(huán)DNA ； (3)內(nèi)引物以原始莖環(huán)D NA做模板，啟動鏈置換DNA的合成，產(chǎn)生一個原始的莖環(huán)DNA和一個新的由兩倍莖長度的莖環(huán)DNA ； (4)在等溫條件下，內(nèi)引物以莖環(huán)DNA為模板，通過鏈置換形成多個含有靶DNA重復序列的莖環(huán)DNA，在一小時內(nèi)該循環(huán)反應可使靶DNA積累到IO9拷貝，可通過熒光染料來觀察擴增結果。本發(fā)明涉及的鷹嘴豆殼二孢葉枯病病原菌環(huán)介導等溫擴增快速檢測方法，該方法中:鷹嘴豆殼二孢葉枯病病原菌Ascochyta rabiei的分離、純化，采用常規(guī)分離真菌的方法對其進行分離，采用單孢分離進行純化；鷹嘴豆殼二孢葉枯病病原菌Ascochyta rabiei的培養(yǎng):將鷹嘴豆殼二孢葉枯病病原菌Ascochyta rabiei接種到鷹嘴豆煎汁PDA平板上，置溫度26°C溫箱中培養(yǎng)15d，備用；鷹嘴豆殼二孢葉枯病病原菌Ascochyta rabiei的DNA提取和檢測:將50mg冷凍干燥后的菌絲和孢子粉至研缽內(nèi)加入液氮充分研磨，倒入離心管中，加入200yL2%十六烷基三甲基溴化銨裂解液(lOOmmol/L三羥基甲基氨基甲烷_鹽酸，PH8.0 ；20mmol/L乙二胺四乙酸，pH8.0, 1.4mol/L氯化鈉和少量石英砂充分研磨，再加入300 μ L2%十六烷基三甲基溴化銨裂解液，將樣品充分混勻，溫度65°C，水浴lh(5-10min混勻一次)取出放置室溫，加入等體積的氯仿/異戍醇(v/v)24: I,充分顛倒混勻，12000轉/分鐘離心IOmin,取上清液至新的離心管中，繼續(xù)抽提一次，取上清液至新的離心管中，加入等體積預冷異丙醇充分顛倒混勻，溫度4°C，放置l_2h促進DNA沉淀，12000轉/分鐘，溫度4°C，離心IOmin,棄上清液，加入500 μ L70%乙醇混勻，12000轉/分鐘，溫度4°C，離心5min，棄上清液，在超凈工作臺上自然晾干無酒精味后加入適量的lXTE(10mmOl/L三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸，0.lmmol/L乙二胺四乙酸，pH8.0)緩沖液進行溶解(TE中含5 μ g/ μ L核糖核酸酶(RNase))，得到DNA溶液待用；下載GenBank公布的多條鷹嘴豆殼二孢葉枯病病原菌Ascochyta rabiei ITS序列，其序列號分別為 AY152550，DQ822479, DQ822480, EU167600, FJ032643, HQ700312,JF714463，將下載序列與本實驗測序序列名為“ITS”進行比對，找出保守區(qū)，即ITS序列的l-440bp,并根據(jù)其利用在線軟件www.primerexplorer, jp設計一套特異的LAMP引物,包括兩條外引物:上游外引物(F3)/下游外引物(B3)，兩條內(nèi)引物:上游內(nèi)引物(FIP)/下游內(nèi)引物(BIP)，兩條環(huán)引物:上游環(huán)引物(LF)/下游環(huán)引物(LB);鷹嘴豆殼二孢葉枯病病原菌Ascochyta rabiei真菌環(huán)介導等溫擴增LAMP檢測引物的祀片段大小為181bp ；其中引物序列為:上游外引物F3:5’ -CTTGGTATTCCATGGGGCAT-3’ ；下游外引物B3:5 ’ -ACTTTTGGACGTCGTCGTTAT-3 ’ ；上游內(nèi)引物FIP: 5 ’ -GAGGCGAGACAAACACCCAACA-GCCTGTTCGAGCGTCATT-3，；下游外引物BIP:5，-CGCCTTAAAACAATTGGCAGCCG-GAGTGCAAAGCGCGAGAT-3，；上游環(huán)引物LF:5’ -CCAAGCAAAGCTTGAAGGTACA-3’ ；下游環(huán)引物LB: 5，-GCG TATTGATTTCGGAGCGCAGT-3，。序列比對結果:AY152550.....ATCATTACCTAGAGTTTGTGGGCTTTGCCCGCTAC 35DQ822479 ____g----------------------------------- 36DQ822480 ____g----------------------------------- 36EU167600 gaagg----------------------------------- 1720FJ032643 gaagg----------------------------------- 58HQ700312 gaagg-------------------------------1--- 59JF714463.......ggggct----c_g_a------------------ 33ITS................................................8AY152550 CTCTTACCCATGTCTTTTGAGTACTTACGTTTCCTCGGCG 75DQ822479 ---------------------------------------- 76DQ822480 ---------------------------------------- 76EU167600 ---------------------------------------- 1760FJ032643 ---------------------------------------- 98HQ700312 ---------------------------------------- 99JF714463 ---------------------------------------- 73ITS---------------------------------------- 48AY152550 GGTCCGCCCGCCGATTGGACAAAATCAAACCCTTTGCAGT 115DQ822479 ---------------------------------------- 116DQ822480 ---------------------------------------- 116EU167600 ---------------------------------------- 1800FJ032643 ---------------------------------------- 138HQ700312 ---------------------------------------- 139JF714463 ---------------------------------------- 11權利要求
1.一種鷹嘴豆殼二孢葉枯病環(huán)介導等溫擴增快速檢測方法，其特征在于按下列步驟進行: a、待檢樣品或真菌的DNA提取: 采用常規(guī)真菌DNA提取方法提取待檢樣品核酸，其中提取樣品DNA的OD26(i/OD28Q為1.6-2.0，濃度為 IO-1OOng/ μ L ； b、進行鷹嘴豆殼二孢葉枯病真菌的環(huán)介導等溫擴增反應: 在裝有22 μ L環(huán)介導等溫擴增反應液的反應管中加入2 μ L待檢樣品模板DNA和I μ LBst DNA聚合酶，于恒溫65°C擴增反應30-60min，將溫度調(diào)到80°C終止反應，3-5min后取出待檢； C、顯色檢測:在每個反應管中加入IuL顯色劑，直接用肉眼觀察顏色變化，反應液顏色變?yōu)榫G色，即為待檢樣品中含有或為鷹嘴豆殼二孢葉枯病真菌。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于步驟b中環(huán)介導等溫擴增反應液是由IOXThermopol反應緩沖液、1.0-1.4mmol/L脫氧核酸三磷酸基質、4-8mmol/L硫酸鎂、 0.8-1.6ymol/L上游內(nèi)引物FIP、0.8-1.6 μ mol/L下游內(nèi)引物ΒΙΡ、0.2_0.3 μ mol/L上游外引物 F3、0.2-0.3 μ mol/L 下游外引物 B3、0.2-0.8 μ mol/L 上游環(huán)引物 LF 和 0.2-0.8ymol/L下游環(huán)引物LB組成，其中: 上游外引物 F3:5’ -CTTGGTATTCCATGGGGCAT-3’ ； 下游外引物 B3:5，-ACTTTTGGACGTCGTCGTTAT-3，；上游內(nèi)引物 FIP:5’ -GAGGCGAGACAAACACCCAACA-GCCTGTTCGAGCGTCATT-3’ ；下游外引物 BIP:5’ -CGCCTTAAAACAATTGGCAGCCG-GAGTGCAAAGCGCGAGAT-3’ ； 上游環(huán)引物 LF:5’ -CCAAGCAAAGCTTGAAGGTACA-3’ ； 下游環(huán)引物 LB:5’ -GCGTATTGATTTCGGAGCGCAGT-3’。
3.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于步驟b環(huán)介導等溫擴增反應液中10 X Thermopol反應緩沖液中含有200mmol pH8.8的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸、IOOmmol/L氯化鉀、100mmol/L硫酸銨、20mmol/L硫酸鎂和I %曲拉通X-100。
4.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于步驟b環(huán)介導等溫擴增反應液中的脫氧核酸三磷酸基質由dUTP、dATP、dGTP和dCTP四種脫氧核糖核酸組成，其中四種脫氧核糖核酸的質量比為 dUTP: dATP: dGTP: dCTP = 2:1:1:1。
5.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于步驟b中BstDNA聚合酶為8U/ μ L。
6.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于步驟c中顯色劑為10%的熒光染料SYBRGREEN I。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種鷹嘴豆殼二孢葉枯病環(huán)介導等溫擴增快速檢測方法，該方法包括真菌DNA的提取、真菌的環(huán)介導等溫擴增、顯示檢測步驟完成，以克服現(xiàn)有技術所需周期長、操作復雜等問題，該方法優(yōu)點是快速、特異性強、靈敏度高，且成本低，可用于田間鷹嘴豆殼二孢葉枯病的早期診斷和病菌的監(jiān)測和鑒定。
文檔編號C12R1/645GK103215375SQ20131018632
公開日2013年7月24日 申請日期2013年5月20日 優(yōu)先權日2013年5月20日
發(fā)明者馬德英, 馬麗娟, 羌松 申請人:新疆農(nóng)業(yè)大學