一種重組人血白蛋白-尿酸酶融合蛋白的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種重組人血白蛋白-豬尿酸酶融合蛋白藥物的制備。所述藥物含有人血白蛋白、豬尿酸酶以及純化標(biāo)簽。本融合蛋白生產(chǎn)制備工藝穩(wěn)定，適合大規(guī)模生產(chǎn)。經(jīng)過體外酶活性檢測以及小白鼠體內(nèi)初步藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明所述的重組尿酸酶具有明顯的降低體內(nèi)尿酸濃度的藥效。
【專利說明】一種重組人血白蛋白-尿酸酶融合蛋白的制備

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)基因工程領(lǐng)域，主要涉及一種尿酸酶的制備。具體地，利用基因重組技術(shù)，將人血白蛋白(HSA)與尿酸酶基因串聯(lián)并克隆入載體，轉(zhuǎn)化宿主菌，經(jīng)過融合表達(dá)、純化、制劑工藝制備，得到具有理想治療效果的重組尿酸酶藥物，用于治療痛風(fēng)、結(jié)節(jié)瘤、腎功能不全、器官移植和惡性疾病等病癥中并發(fā)的高尿酸癥。

【背景技術(shù)】
[0002]高尿酸血癥不僅是痛風(fēng)及相關(guān)疾病的直接原因，而且是某些腎臟和心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(吳欣等，2007)。故降低血液和組織的尿酸水平是預(yù)防和治療多種尿酸相關(guān)疾病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。人體不能合成尿酸氧化酶，因此降尿酸是長期甚至是終身治療過程。痛風(fēng)在歐洲、北美、日本等地區(qū)和國家的發(fā)病率較高。近年來，隨著我國人民生活水平的提高、壽命的延長、飲食結(jié)構(gòu)的改變(富含核蛋白的食物增多)、肥胖者的增加，以及對(duì)本病的重視程度加強(qiáng)等，痛風(fēng)已不再是國人的罕見病，其患病率較15年前增長約15~30倍。不論在歐美的更發(fā)達(dá)國家還是在中國的醫(yī)藥界都對(duì)現(xiàn)有的治療方式及效果不甚滿意，急欲研究出療效好、副作用小的短期降酸藥及長期控酸藥。
[0003]別嘌呤醇是至今唯一能有效減少尿酸生成、降低血及尿中尿酸的水平來治療原發(fā)性痛風(fēng)的藥物，它在體內(nèi)能競爭性地抑制次黃嘌呤醇的活性，使次黃嘌呤、黃嘌呤合成尿酸受阻，從而降低血尿酸的濃度。但是毒副作用主要是骨髓抑制，其引起的全血細(xì)胞減少癥與用藥劑量有關(guān)。使用別嘌呤醇治療約2%的患者產(chǎn)生過敏反應(yīng)，并且有0.4%的患者出現(xiàn)嚴(yán)重的超敏反應(yīng)綜合征，這種超敏反應(yīng)綜合征可引起危及生命的急性腎衰竭和肝衰竭，以及嚴(yán)重的皮膚損傷(毒性表皮壞死松懈、剝落性皮炎、多形紅斑等)。而且嘌呤醇干擾用于白血病的藥物和用于防止器官同種移植排斥的藥物硫唑嘌呤和6-巰基嘌呤的代謝，產(chǎn)生顯著高尿酸血癥，并可能引起嚴(yán)重的痛風(fēng)或威脅腎功能，所以，腎功能不全者慎用別嘌呤藥物(SchiIlinger,1990)。
[0004]尿酸酶可降低痛風(fēng)病人體內(nèi)的尿酸水平，消除痛風(fēng)病人痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)石沉積、尿酸腎結(jié)石的形成等癥狀。流行病學(xué)調(diào)查顯示(Lee AC, 1998 ；Bosly A, 2003 ；Bomalaski JS, 2004 ；Lee AC, 2003 ;)。早在 1974 年(Current Rheumatology Reports2001,3:29~35)使用微生物提取的尿酸氧化酶治療痛風(fēng)，但是，由于當(dāng)時(shí)使用的酶是從微生物Asperigellas flavus中提取的，純度不高,難于控制,在使用中產(chǎn)生各種各樣的副作用，2001年、2002年先后在歐洲和美國上市了基因重組的Asperigellas flavus尿酸氧化酶在高尿酸血癥的預(yù)防和治療 (腫瘤化療高尿酸血癥的治療和預(yù)防)，和傳統(tǒng)的治療藥物相t匕，有起效快、藥效明顯、副作用小、藥物相互反應(yīng)限制少、治療周期短等特點(diǎn)。在痛風(fēng)方面也有使用的報(bào)道，目前已經(jīng)使用在器官移植引起的痛風(fēng)治療(Rev Rhum Engl Ed.1995May ；62(5):392-4.),也有在其它因素引起的痛風(fēng)中的使用(Annals of the RheumaticDisease2005:64 ；516)。
[0005]尿酸氧化酶是一種在嘌呤代謝過程中把尿酸分解為尿囊素的酶，在尿酸氧化酶基因的調(diào)控表達(dá)下合成。為尿酸代謝的關(guān)鍵酶。在研究人、猿等靈長類動(dòng)物的尿酸氧化酶同源C DN A序列時(shí)，發(fā)現(xiàn)它由4個(gè)外顯子組成，在第33和187位處2個(gè)無義突變(CGA/AGA+TGA)，導(dǎo)致編碼區(qū)提前終止，這樣，人類等靈長類動(dòng)物體內(nèi)便不能產(chǎn)生尿酸氧化酶，尿酸成為嘌呤在人體內(nèi)代謝的終產(chǎn)物(Morisaki T，2008;Safra N，2005)。尿酸生成過多或排泄過少時(shí)則出現(xiàn)高尿酸血癥。其濃度達(dá)到最大飽和度時(shí)，則析出結(jié)晶沉積在血管壁使血管內(nèi)皮細(xì)胞損害，并能直接導(dǎo)致血小板原生長因子的表達(dá)和血管平滑肌的增殖，使血管硬化并形成高血壓。如果在腎臟則出現(xiàn)腎小球和小管間質(zhì)病變，尿酸結(jié)石，在關(guān)節(jié)則形成痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎(GuarnerF, 2003)。富嘌呤食物攝入過多、白血病和淋巴瘤及其化療過程所引起的嘌呤代謝增加均可使人體內(nèi)尿酸水平異常升高而形成高尿酸血癥，而尿酸及其鹽類在血液中的低溶解度和易沉積性，又使得高尿酸血癥成為痛風(fēng)等系列疾病和腫瘤治療中出現(xiàn)急性腎衰竭的直接原因(Oda Metal, 2002 ；Baeksgaard L etal, 2003) ?
[0006]微生物來源的尿酸氧化酶可用于臨床診斷和治療。但微生物產(chǎn)酶量較低，限制了其廣泛應(yīng)用。通過基因重組技術(shù)高效表達(dá)酶基因是一條提高產(chǎn)酶量的途徑。迄今為止，已有多個(gè)物種的尿酸氧化酶基因被克隆[Legoux R等，1992 ;0estreicher N, 1993 ；KoyamaY等，1996;]。在法國和意大利，已用從黃曲霉制備的尿酸酶治療與白血病化療有關(guān)的嚴(yán)重高尿酸血癥達(dá)20年以上(Patte C，2001);并且在美國，已在近年的臨床試驗(yàn)中將所述尿酸酶運(yùn)用于白血病的治療(Goldman SC, 2001, Schumacher HR, 2006)。結(jié)果證明尿酸酶比別嘌啉醇起效更快(PayS，2003)。在痛風(fēng)患者方面，尿酸酶應(yīng)用可以阻止急性發(fā)作，并減少痛風(fēng)石的體積(Vogt B，2005)由于尿酸酶對(duì)人類有著較大的應(yīng)用價(jià)值，許多不同來源的尿酸酶被研究(Huang SH, etal，2004 ； Saeed HM, 2004)。
[0007]由于聚乙二醇是一種具有較好生物相容性高分子化合物，因此目前市場上銷售的尿酸酶藥物多為PEG化尿酸酶。多年來的臨床使用結(jié)果表明，PEG化尿酸酶制劑由于其半衰期短、藥效維持時(shí)間短、熱穩(wěn)定性不好、具有生物制劑的副反應(yīng)而促使人們研究安全性和效果更好的尿酸酶藥物(Imhoff RD，2003)。
[0008]2010年9月14日，美國FDA批準(zhǔn)了 Savient制藥公司藥物Krystexxa (PEG化尿酸氧化酶)用于那些對(duì)常規(guī)治療藥無應(yīng)答的成人痛風(fēng)患者。此前，為期6個(gè)月，受試者達(dá)212名的兩項(xiàng)臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，Krystexxa效果顯著ΗβΡ?Α同時(shí)指出，每四個(gè)人當(dāng)中就有一人用藥后產(chǎn)生較為嚴(yán)重的過敏反應(yīng)，醫(yī)師在給患者用藥時(shí)應(yīng)向患者分發(fā)皮質(zhì)留類藥和抗組胺劑藥，將類似的風(fēng)險(xiǎn)降至最低。
[0009]人血白蛋白(HSA)是人體內(nèi)含量最高的蛋白質(zhì)，在維持血漿滲透壓和運(yùn)輸小分子物質(zhì)等方面都有十分重要的作用。作為小分子藥物的載體，白蛋白能與藥物可逆性結(jié)合，從而影響藥物的分布和代謝(郭賓等，2005 ；Harald 0，2004)。血清蛋白作為理想的載體具有安全無毒、生物降解、生物相容性好等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)作為人類固有蛋白長期使用不會(huì)引起免疫原性反應(yīng)(Sug1 S, 1999 ；Huang BX, 2004) ? 2005年美國FDA批準(zhǔn)白蛋白結(jié)合紫杉醇納米顆粒注射懸液上市(Zu YG，2009; Iwao Y etal，2009)。
[0010]發(fā)明概述
[0011]本發(fā)明將豬尿酸酶和人血白蛋白聯(lián)合后與純化標(biāo)簽串聯(lián)，在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)表達(dá)，經(jīng)過發(fā)酵、純化、制劑等工藝，獲得具有理想治療效果的重組尿酸酶藥物。本發(fā)明提供的藥物制備方法可保證有效地治療因尿酸沉積過多引發(fā)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)石沉積、尿酸腎結(jié)石的痛風(fēng)以及其他相關(guān)疾病。
[0012]本發(fā)明的目的之一在于提供了一種新的能用于治療因尿酸過多導(dǎo)致的痛風(fēng)的相關(guān)疾病的藥物多肽及其藥物組合物。
[0013]本發(fā)明的目的之二在于提供了所述多肽藥物的構(gòu)建及獲得方法。
[0014]本發(fā)明的目的之三在于提供了能夠共表達(dá)表達(dá)所述多肽藥物的基因工程菌株。
[0015]本發(fā)明的目的之四在于提供了所述多肽藥物的制備方法。
[0016]本發(fā)明的目的之五在于提供了所述多肽藥物在治療模型動(dòng)物高尿酸癥中的使用方法及療效。
[0017]在第一方面，本發(fā)明提供了一種用于治療高尿酸血癥的藥物多肽及其組合物。所述藥物多肽包括主要結(jié)構(gòu)蛋白尿酸酶以及人血白蛋白串聯(lián)到一起所形成的多肽或藥學(xué)上可接受的鹽以及多肽蛋白所需要的載體。串聯(lián)可以通過遺傳工程方法進(jìn)行，多肽藥物中除了含有主要結(jié)構(gòu)蛋白外，還包含非免疫活性物質(zhì)。所述非免疫活性物質(zhì)為各多肽的連接部分，不具有免疫原性，也不具有任何佐劑活性，主要有純化標(biāo)簽、接頭肽、化學(xué)修飾部分、N端信號(hào)肽和C端多聚腺苷酸等；此外還有分子佐劑。所述藥學(xué)上可接受的鹽是指無毒性、刺激和變態(tài)反應(yīng)，適用于人或動(dòng)物組織的鹽。非活性物質(zhì)和藥學(xué)上可接受的鹽為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。
[0018]在第二方面，本發(fā)明提供了一種核苷酸分子，其編碼本發(fā)明第一方面所述的治療性藥物多肽。本發(fā)明中核苷酸可以是RNA形式，DNA形式，通過人工合成方式分別合成多抗原表位串聯(lián)序列和分子佐劑序列，然后經(jīng)過基因工程操作，將基因片段克隆入載體，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌，篩選、發(fā)酵、純化后獲得重組尿酸酶多肽。在本發(fā)明中可以對(duì)該核酸進(jìn)行常規(guī)的分子生物學(xué)操作，如:PCR、限制性內(nèi)切酶酶切，連接等。核酸設(shè)計(jì)5’端和3’端均加入保護(hù)性堿基和酶切位點(diǎn)。
[0019]在第三方面，本發(fā)明提供了一種載體，其除了含有本發(fā)明第二方面所述的編碼藥物多肽蛋白的核苷酸分子，還含有與該核苷酸序列可操作的連接，在原核細(xì)胞表達(dá)(轉(zhuǎn)錄和翻譯)所需的表達(dá)控制元件。最基本的表達(dá)控制元件包括啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄終止子、增強(qiáng)子，選擇性標(biāo)記等，這些調(diào)控元件為本領(lǐng)域所熟知。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體為大腸桿菌表達(dá)載體。
[0020]在第四方面，本發(fā)明提供了一種宿主細(xì)胞，其含有本發(fā)明第三方面所述的載體。宿主細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染含有本發(fā)明所述編碼蛋白的基因序列，而后經(jīng)檢測具有良好的的遺傳和表達(dá)穩(wěn)定性后，可用于發(fā)酵表達(dá)生產(chǎn)所需的尿酸酶藥物。
[0021]在第五方面，本發(fā)明提供了一種重組尿酸酶的制備方法，其包括以下步驟:工程菌發(fā)酵表達(dá)藥物多肽，經(jīng)過粗純化與精細(xì)純化工藝以及后續(xù)制劑工藝，獲得所需要的多肽。其中涉及的方法包括但不限制于菌體破碎、包涵體洗滌、離心、變性、親和層析、疏水層析、復(fù)性等。本發(fā)明中涉及的制備方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。
在第六方面，本發(fā)明提供了一種用于治療高尿酸癥的藥物，其包括本發(fā)明第一方面所述的多肽以及藥學(xué)上可接受的載體。配制注射用藥劑可使用非賦形劑包括但不限制于磷酸鹽緩沖液、水、多元醇和甘油等。用于腸胃外注射藥劑的成分包括藥學(xué)上可接受的注射溶液或非水劑、分散劑、懸浮液或乳劑以及現(xiàn)配現(xiàn)用的與無菌注射溶液或分散劑混合的無菌粉劑。這些制劑可以添加一些其他成分，例如防腐劑、增溶劑、穩(wěn)定劑、潤濕劑、乳化劑、緩沖液、抗氧化劑和稀釋劑等。
[0023]在第七方面，本發(fā)明提供了第六方面所述的多肽藥物的應(yīng)用。藥物可以通過靜脈注射、皮內(nèi)注射、皮下注射、肌肉注射或腹膜內(nèi)等多種途徑將尿酸酶注射到尿酸水平過高的哺乳動(dòng)物體內(nèi)。
[0024]另外，需要指出的是，在本申請(qǐng)的上下文的公開內(nèi)容的基礎(chǔ)上，本發(fā)明的其他具有實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)的方面對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人來說是顯而易見的。此外，本發(fā)明亦使用了公開文獻(xiàn)，他們的全文內(nèi)容均納入本文進(jìn)行參考。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]下列附圖用于說明本發(fā)明的具體實(shí)施方案，而不用于限定由權(quán)利要求書說界定的本發(fā)明范圍。
[0026]圖1為含有蛋白編碼基因的表達(dá)載體pEVSCC-HSA-pUO示意圖
[0027]圖2為限制性內(nèi)切酶瓊脂糖凝膠電泳圖，其中泳道I為DNA marker,從上至下依次為 2000bp、1000bp、 750bp、500bp、250bp，泳道 2 為陰性對(duì)照，泳道 3 為 BamH I 和 NheI 雙酶切片段，泳道4為未進(jìn)行酶切的pEVSCC-HSA-pUO質(zhì)粒，泳道5為Nhe I和Hind III雙酶切片段；
[0028]圖3為菌種表達(dá)和純化后的SDS-PAGE分析結(jié)果，其中泳道I為蛋白分子量marker，從上至下依次為 220kd、150kd、100kd、75kd、50kd、32kd、25kd、15kd，泳道 2 為誘導(dǎo)表達(dá)菌，泳道3為未誘導(dǎo)表達(dá)陰性對(duì)照菌，泳道4為純化后的蛋白(箭頭所指)；
[0029]圖4為純化蛋白WESTERNBL0T印記結(jié)果，其中泳道I為預(yù)染marker，分子量從上至下依次為165KD、105KD、76KD、64KD，泳道2為陰性對(duì)照，泳道3為純化目的蛋白樣品；
[0030]圖5為PH與重組尿酸酶比活性關(guān)系曲線圖；
[0031]圖6為溫度與重組尿酸酶比活性關(guān)系曲線圖；
[0032]圖7為小鼠體內(nèi)重組尿酸酶藥效學(xué)結(jié)果；

【具體實(shí)施方式】
[0033]實(shí)施例中所述的具體試驗(yàn)方法描述僅是示例性描述，用于詳細(xì)闡述本發(fā)明，但并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明范圍的限制，依據(jù)本說明書的諸多變化為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知。
[0034]實(shí)施例一大腸桿菌表達(dá)載體與表達(dá)菌株的構(gòu)建
[0035]將設(shè)計(jì)好的人血白蛋白HSA和豬尿酸酶(UrATe oxidase of swine, pUO)的編碼基因由上海英俊生物技術(shù)公司合成，HSA基因片段兩端分別設(shè)計(jì)了 BamH 1(5’端)和Nhe1(3’端)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，pUO基因片段兩端分別設(shè)計(jì)了 Nhe 1(5’端)和Hind 111(3’端)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。上海英俊生物技術(shù)公司把基因片段合成后克隆到PMD18T載體上，測序正確后，將含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌寄回本公司。
[0036]將含有HSA和pUO的編碼基因的大腸桿菌菌株分別接種到含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩過夜培養(yǎng)，次日按照Qiagen質(zhì)粒提取試劑盒使用手冊(cè)提取重組質(zhì)粒。將含HSA基因的質(zhì)粒使用BamH I和Nhe I進(jìn)行限制性內(nèi)切酶處理，含豬尿酸酶的編碼基因的，質(zhì)粒使用Nhe I和Hind III進(jìn)行限制性內(nèi)切酶處理，大腸桿菌表達(dá)載體選用本公司在PBV220載體基礎(chǔ)上自行優(yōu)化構(gòu)建的分泌表達(dá)載體pEVSCC，該載體使用BamH I和Hind III進(jìn)行限制性內(nèi)切酶處理，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，分別切取含目的基因片斷和載體基因的膠條，再按照Qiagen公司凝膠回收試劑盒說明書進(jìn)行膠回收。按照載體:片段1: 2_3的比例將兩個(gè)目的基因片斷與分泌表達(dá)載體進(jìn)行連接反應(yīng)，反應(yīng)體系15 μ 1，由T4DNA連接酶進(jìn)行連接，16°C連接過夜，獲得重組質(zhì)粒命名為pEVSCC-HSA-pUO(見圖1)，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌 BL21(DE3)pLysS。
[0037]轉(zhuǎn)化:將200 μ I感受態(tài)細(xì)胞置冰上融化，然后加入3 μ 1DMS0,混勻，加入2 μ I鏈接反應(yīng)液，再次混勻，置冰上30分鐘，420C 45秒，然后迅速放回冰浴1.5分鐘，加入2mlLB培養(yǎng)液，370C，200rpm振蕩培養(yǎng)I小時(shí)，4000g低溫離心10秒鐘棄上清，用200 μ ILB培養(yǎng)基重懸菌體；將菌液鋪于含有氨芐青霉素抗性的LB瓊脂培養(yǎng)板上，涂勻，室溫放置30分鐘，倒置于32°C恒溫箱中培養(yǎng)12-16小時(shí)。篩選平板上的克隆，提取質(zhì)粒，分別用BamH I和Nhe1.Nhe I和Hind III進(jìn)行雙酶切，含有能夠分別切出與人血白蛋白(1815bp)和豬尿酸酶(925bp)基因片段大小相符的質(zhì)粒的克隆，初步確定為陽性克隆見圖2。
[0038]誘導(dǎo)表達(dá):即將陽性克隆過夜培養(yǎng)，次日早上按1: 100轉(zhuǎn)接，37°C培養(yǎng)3小時(shí)后，加入0.2mM IPTG，30°C繼續(xù)培養(yǎng)3小時(shí)，制備樣品；常規(guī)SDS-PAGE檢測目的蛋白表達(dá)情況——在103.5KD分子量處，見到特異性條帶為正確克??；取正確克隆，放大培養(yǎng)，SDS-PAGE證實(shí)表達(dá)正確后，使用常規(guī)western-blot進(jìn)一步證實(shí)其表達(dá)準(zhǔn)確性，見圖3，圖4 ;經(jīng)過上述構(gòu)建及鑒定程序后，可將挑選的陽性克隆作為工程菌進(jìn)行原始種子庫的建立及菌種保藏，菌種命名為 pEVSCC-HSA-pU0/BL21 (DE3, Plys)。
[0039]實(shí)施例二工程菌的發(fā)酵、純化與制劑
[0040]發(fā)酵取生產(chǎn)用基礎(chǔ)種子庫菌種，開啟后劃種培養(yǎng)基(LB+Amp)平板2~3塊，培養(yǎng)后挑取平板中典型集落8~10個(gè)，分別培養(yǎng)后保存，然后分別進(jìn)行重組尿酸酶蛋白表達(dá)量測定，重復(fù)三次，選其中表達(dá)量最高的一份供生產(chǎn)制備種子液用。挑取單菌接種于試管LB液體培養(yǎng)基中，在搖床中32°C培養(yǎng)震蕩12小時(shí)。將試管中的菌以1: 100的接種量接入搖瓶，32°C遙床培養(yǎng)至0D600 = 3，即可以按10%比例接種發(fā)酵罐。發(fā)酵用培養(yǎng)基為改造的LB培養(yǎng)基，用蒸餾水配制，其中不含有任何抗生素，對(duì)發(fā)酵罐進(jìn)行溶氧和pH值的校正，進(jìn)行實(shí)罐滅菌。降溫至30.(TC時(shí)，調(diào)整轉(zhuǎn)數(shù)至300rpm，標(biāo)定pH及溶氧(OD)零點(diǎn)。發(fā)酵溫度為30.0±0.1°C，根據(jù)工程菌生長情況到后期可作必要的培養(yǎng)基成分添加，溶氧控制在30%左右，pH控制在7.0，接種后培養(yǎng)菌體0D600 = 1.0~1.2時(shí)流加補(bǔ)料500ml，補(bǔ)料后I小時(shí)加入IPTG (終濃度為0.2mM)誘導(dǎo)表達(dá)，連續(xù)誘導(dǎo)4個(gè)小時(shí)后發(fā)酵結(jié)束，取樣做SDS-PAGE檢定表達(dá)情況。
[0041]提取將收集到的菌體，每10g用提取液(lOmMTris-cl pH8.0, ImM EDTA,0.lug/ml重組溶菌酶)500ml，4-8°C溫和攪拌(轉(zhuǎn)速低于每分鐘150轉(zhuǎn))提取30分鐘。低溫低速離心(3000-4000rpm)進(jìn)行固液分離，上清備用，沉淀再用上述方法提取一次，合并提取上清，沉淀進(jìn)入廢物處理程序。
[0042]純化提取液上清上經(jīng)過，I金屬螯合層析純化:分離介質(zhì)Chelating SepharoseFF，用平衡溶液I (1mMTris-HCl pH8.0，IM NaCl，20mM咪唑)充分平衡的層析柱，上樣完畢后用平衡溶液再充分平衡，再用平衡溶液II (1mMTris-HCl pH8.0，20mM咪唑)平衡，然后用洗脫溶液(1mMTris-HCl pH8.0，500mM咪唑)釋放目的蛋白，收集目的蛋白；2再用陰離子層析純化:分離介質(zhì)(復(fù)分離介質(zhì)Q Sepharose FF,基本緩沖體系1mMTris-HCl pH8.0,O-1M NaCl線性梯度洗脫，收集目的蛋白峰；3再做酶切處理:將目的蛋白稀釋到2_3mg/ml，加入CaC12至ImM，調(diào)整溶液至pH8.0，加入重組腸激酶至0.01ug/ml，25°C作用12小時(shí)；4金屬螯合層析純化:分離介質(zhì)Chelating Sepharose FF,用平衡溶液I (1mMTris-HCl pH8.0,IM NaCl，20mM咪唑)充分平衡的層析柱，上樣完畢后用平衡溶液再充分平衡，收集被酶解的目的蛋白所在的穿出液，用洗脫溶液(1mMTris-HCl pH8.0，500mM咪唑)釋放未被酶解的目的蛋白，收集目的蛋白儲(chǔ)存或再酶解；5再進(jìn)行疏水層析:層析介質(zhì)Phenyl SepharoseHigh Performance,基本緩沖體系1mMTris-HCl pH8.0, 1.5-ONaCl線性梯度洗脫，收集目的蛋白峰；6再進(jìn)行SDS-PAGE以及WESTERNBLOT印記確定純化產(chǎn)物為目標(biāo)蛋白。陰離子層析純化:分離介質(zhì)(復(fù)分離介質(zhì)S0URCE30Q，基本緩沖體系1mMTris-HCl pH8.0, O-1M NaCl線性梯度洗脫，收集目的蛋白峰-J進(jìn)行凝膠過濾純化:分離介質(zhì)Sephacryl S-300HR,緩沖體系PBS(pH7.2)收集目的蛋白峰。8半成品檢測、處理和儲(chǔ)存:目的蛋白通過SDS-PAGE和HPLC分析，達(dá)到純度> 98%的純度要求，過濾除菌除熱源，BCA法定量和半成品質(zhì)控后凍存?zhèn)溆谩?br> [0043]制劑在符合GMP標(biāo)準(zhǔn)的環(huán)境中進(jìn)行制劑操作，制劑配方:rHSA-pU010mg/ml,鹿糖10g/L，甘露醇20/L，溶媒PBS(pH7.2)，劑型:凍干粉針，凍干曲線:_35°C預(yù)凍3h，_35°C真空凍干5h，-25°C真空凍干4h，-15°C真空凍干3h，30°C真空干燥2h。成品檢測合格后包裝儲(chǔ)存。
[0044]實(shí)施例三酶活性的測定
[0045]參照Koyama等(1996)的方法，在37 °C，取3ml pH7.5硼酸緩沖液中溶解的120ymol/L尿酸溶液，于Icm石英比色杯中，加入適量尿酸酶溶液，充分混勻后置UV-1601PC紫外分光光度計(jì)，準(zhǔn)確反應(yīng)5min，以硼酸緩沖液做空白，在293nm處測定吸光值的減少量。活力單位定義為，該條件下Imin內(nèi)催化I μ mol尿酸成尿囊素所需要的酶量。其計(jì)算公式為:
[0046] U/ml = (AAXVTXdf)/(12.6 X VE),式中:U =每 ml 尿酸酶活力單位數(shù)；Δ A =每分鐘293nm波長下的光密度下降值；VT =反應(yīng)液總體積(ml) ；df =稀釋倍數(shù)；12.6為尿酸在293nm波長下的微摩爾消光系數(shù)；VE =酶液體積(ml)。
[0047]相對(duì)活力(RelativeActivity) (% ) = UE/UmaxX 100,式中:UE =不同反應(yīng)條件下測得的酶活力單位；Umax =同組實(shí)驗(yàn)中測得的最大酶活力單位。
[0048]實(shí)施例四重組酶的最適作用pH
[0049]在尿酸酶最適反應(yīng)溫度條件下，分別于pH3~10緩沖體系中測定尿酸酶樣品溶液的酶活力，得到PH-酶活曲線圖，見圖5。尿酸酶在pH7.0時(shí)的反應(yīng)能力最強(qiáng)。pH高于或者低于7.0，尿酸酶的反應(yīng)能力都會(huì)降低?？梢?，該重組尿酸酶的最適反應(yīng)pH為7.0。
[0050]實(shí)施例五重組尿酸酶的熱穩(wěn)定性
[0051 ] 尿酸酶樣品溶液分別在20°C、30 V、40°C、50 V、60 V和70 V的水浴條件下精確保溫20min，冰水浴迅速冷卻后，在酶最適反應(yīng)條件下測定各個(gè)樣品的剩余酶活性。將尿酸酶樣品溶液在不同的溫度下水浴精確保溫20min，然后用冰水浴迅速冷卻，在40°C pH7.0的反應(yīng)體系中測定尿酸酶樣品溶液中的剩余酶活性，得到尿酸酶溫度穩(wěn)定曲線圖，見圖6。由圖可知，尿酸酶在30~50°C范圍內(nèi)穩(wěn)定性較好，當(dāng)溫度超過50°C時(shí)，酶活力直線下降。
[0052]實(shí)施例六重組尿酸酶體內(nèi)藥效學(xué)試驗(yàn)
[0053]將22_25g昆明小鼠12只隨即分為2組，試驗(yàn)組(HAS-UA)尾靜脈注射無菌尿酸酶溶液(0.75U/ml)，空白對(duì)照組(NS)注射生理鹽水。預(yù)給藥后立即腹腔注射尿酸溶液，1min后摘眼球取血測定血清中尿酸含量。分離血清后，用磷鎢酸法測定血清中的尿酸水平(按試劑盒說明書操作)。結(jié)果如圖7。NS對(duì)照組小鼠體內(nèi)血尿酸含量為(41.5±1.9)mg/L;尿酸酶給藥組小鼠體內(nèi)血尿酸含量為(8.3±5.2)mg/L，接近小鼠的正常水平約5mg/L。NS對(duì)照組和尿酸酶給藥組的血尿酸含量相差很大，存在顯著性差異(P < 0.01)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，尿酸酶使造模形成的高尿酸血癥顯著緩解，血尿酸含量有大幅度下降。
【權(quán)利要求】
1.一種用于治療高尿酸血癥的重組尿酸酶藥物蛋白。
2.—種核酸分子，其編碼權(quán)利要求1所述藥物蛋白序列。
3.—種載體,其含有權(quán)利要求2所述的核酸分子。
4.一種宿主細(xì)胞,其含有權(quán)利要求3所述的載體。
5.權(quán)利要求1所述的藥物蛋白，其具體核酸序列組合為:SEQID N0.1。
6.權(quán)利要求1所述的藥物蛋白，其具體氨基酸序列組合為:SEQID N0.2
7.一種用于治療高尿酸血癥的藥物，其包括權(quán)利要求6所述的融合蛋白以及藥學(xué)上可接受的載體。
【文檔編號(hào)】C12N15/53GK104178464SQ201310190376
【公開日】2014年12月3日 申請(qǐng)日期:2013年5月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月22日
【發(fā)明者】李殿明, 蒲勤, 李毅, 齊春梅, 田春輝, 任百亮, 張導(dǎo)春, 劉甜甜, 顧富香 申請(qǐng)人:李殿明, 蒲勤