專利名稱：一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)培育轉(zhuǎn)基因大豆的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)培育轉(zhuǎn)基因大豆的方法。
背景技術(shù)：
與傳統(tǒng)的育種技術(shù)相比，轉(zhuǎn)基因育種技術(shù)的周期短、效率高、目的性強(qiáng)，是改良作物農(nóng)藝性狀的有效途徑。目前，大豆轉(zhuǎn)基因方法主要有農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法、花粉管通道法，其中常用的是農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，該方法能夠較完整地將T-DNA以單拷貝或低拷貝形式插入植物基因組中。雖然近幾年來，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化大豆的技術(shù)已不斷完善，但多數(shù)方法需經(jīng)過外植體的脫分化和再分化的過程，且存在轉(zhuǎn)化效率低、遺傳穩(wěn)定性差、轉(zhuǎn)化周期長(zhǎng)等問題。這些問題嚴(yán)重阻礙了功能基因的驗(yàn)證及轉(zhuǎn)基因育種的進(jìn)程。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種培育轉(zhuǎn)基因大豆的方法，該方法通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)將目的DNA轉(zhuǎn)入大豆細(xì)胞，包括如下步驟:I)在大豆種子萌發(fā)幼苗的子葉節(jié)分生組織處注射含有目的DNA的重組農(nóng)桿菌的懸浮液后，將所述幼苗進(jìn) 行共培養(yǎng)；2)將經(jīng)步驟I)共培養(yǎng)的所述幼苗直接進(jìn)行長(zhǎng)苗培養(yǎng)，即得到具有根、莖和葉的轉(zhuǎn)基因大豆植株；所述共培養(yǎng)的目的是使所述目的DNA整合到大豆基因組中。在上述方法中，所述注射時(shí)的所述幼苗為種子萌發(fā)5 —10天(如5、7或10天)的幼苗。在上述方法中，由于所述幼苗上的頂芽和側(cè)芽會(huì)發(fā)育成新的組織，為了避免未轉(zhuǎn)基因組織的產(chǎn)生，使整個(gè)植株保持一致的轉(zhuǎn)基因特性，在所述注射前，還可包括將所述幼苗的頂芽和側(cè)芽去除的步驟。在上述方法中，所述重組農(nóng)桿菌的懸浮液按照包括如下步驟的方法制備:將所述重組農(nóng)桿菌懸浮于具有如下組成的液體培養(yǎng)基中形成所述重組農(nóng)桿菌的懸浮液:溶劑為水，溶質(zhì)及其在所述液體培養(yǎng)基中的終濃度分別為:1/10的B5基本培養(yǎng)基無機(jī)鹽成分、B5基本培養(yǎng)基有機(jī)成分、蔗糖30g/L、2-(N-嗎啉)乙磺酸3.9g/L、6_芐基腺嘌呤1.67mg/L、L-半胱氨酸 400-1000mg/L (如 400、700、或 1000mg/L)、二硫蘇糖醇 154mg/L、硫代硫酸鈉 158mg/L、乙酰丁香酮 0-300 μ mol/L (或?yàn)?50—300 μ mol/L、100—300 μ mol/L、150—300 μ mol/L 或 200一300 μ mol/L、具體可為 O μ mol/L、50 μ mol/L、100 μ mol/L、150 μ mol/L、200 μ mol/L、或 300 μ mol/L)、赤霉素 0.lmg/L ；所述1/10的B5基本培養(yǎng)基無機(jī)鹽成分為KN03250mg/L、CaCl2113mg/L、MgS04122mg/L、(NH4) 2S0413.4mg/L、KI0.075mg/L、H3BO40.3mg/L、MnS047mg/L、ZnSO4L 15mg/L、Na2MoO40.21mg/L、CoCl20.014mg/L、CuSO40.016mg/L、Na2_EDTA3.73mg/L、FeS0415.2mg/L ；所述B5基本培養(yǎng)基有機(jī)成分為肌醇100mg/L、煙酸lmg/L、鹽酸批B多醇lmg/L、鹽酸硫銨 10mg/L。在上述方法中，與所述液體培養(yǎng)基相比，所述重組農(nóng)桿菌的懸浮液的OD6c 值為0.4一1.0 (如0.4、0.6、1.0);所述重組農(nóng)桿菌的懸浮液的注射量為每個(gè)所述幼苗20—100 μ L (如 20,80,100 μ L)。在上述方法中，所述注射通過內(nèi)徑為0.06mm-lmm(如0.06、0.1或Imm)、外徑為
0.2mm-1.14mm (如 0.2、0.24、1.14mm)的針頭實(shí)現(xiàn)。在上述方法中，所述農(nóng)桿菌為根癌農(nóng)桿菌，具體可為根癌農(nóng)桿菌EHA105。在上述方法中，所述共培養(yǎng)的條件為在溫度25°C、黑暗條件下用水培養(yǎng)3天。本發(fā)明還提供了一種農(nóng)桿菌侵染植物用的液體培養(yǎng)基，其溶劑為水，溶質(zhì)及其在所述液體培養(yǎng)基中的終濃度分別為:1/10的B5基本培養(yǎng)基無機(jī)鹽成分、B5基本培養(yǎng)基有機(jī)成分、蔗糖30g/L、2-(N-嗎啉)乙磺酸3.9g/L、6-芐基腺嘌呤1.67mg/L、L-半胱氨酸400-1000mg/L、二硫蘇糖醇154mg/L、硫 代硫酸鈉158mg/L、乙酰丁香酮0-400 μ mol/L(或?yàn)镺—300 u mol/L>50—300 u mol/L、100—300 u mol/L、150—300 u mol/L 或 200—300 u mol/L、具體可為 0 μ mol/L、50 μ mol/L、100 μ mol/L、150 μ mol/L、200 μ mol/L、或 300 μ mol/L)、赤霉素0.lmg/L ；所述1/10的B5基本培養(yǎng)基無機(jī)鹽成分為KN03250mg/L、CaCl2113mg/L、MgS04122mg/L、(NH4) 2S0413.4mg/L、KI0.075mg/L、H3BO40.3mg/L、MnS047mg/L、ZnSO4L 15mg/L、Na2MoO40.21mg/L、CoCl20.014mg/L、CuSO40.016mg/L、Na2_EDTA3.73mg/L、FeS0415.2mg/L ；所述B5基本培養(yǎng)基有機(jī)成分為肌醇100mg/L、煙酸lmg/L、鹽酸批B多醇lmg/L、鹽酸硫銨 10mg/L。在上述培養(yǎng)基中，所述植物為單子葉植物或雙子葉植物，所述雙子葉植物具體可為大豆。根據(jù)植物分生組織具有分生新細(xì)胞的特性、且為產(chǎn)生和分化其他各種組織的基礎(chǔ)，本發(fā)明采用在大豆種子萌發(fā)幼苗的子葉節(jié)分生組織處以注射農(nóng)桿菌懸浮液的方式，將目的DNA整合入大豆的染色體，獲得轉(zhuǎn)基因植株，整個(gè)過程不經(jīng)過植物組織的脫分化和再分化的組織培養(yǎng)過程，不受無菌操作等實(shí)驗(yàn)條件(超凈臺(tái)、組培間)的限制，減少了化學(xué)試劑(如激素、抑菌劑)的使用量，具有操作簡(jiǎn)單、轉(zhuǎn)化周期短、轉(zhuǎn)化效率高(最高可達(dá)15.3%)、經(jīng)濟(jì)節(jié)約、應(yīng)用范圍廣的優(yōu)點(diǎn)。


圖1為注射侵染大豆幼苗子葉節(jié)分生組織圖。圖2為葉片涂抹早按勝3天后的植株。圖3為PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株中除草劑抗性基因Bar的結(jié)果。其中，泳道M為分子量標(biāo)準(zhǔn)，從上至下的大小依次為2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp，泳道I一24為
待測(cè)轉(zhuǎn)基因植株的擴(kuò)增產(chǎn)物。圖4為重組農(nóng)桿菌懸浮液中使用不同濃度乙酰丁香酮對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、農(nóng)桿菌介導(dǎo)培育轉(zhuǎn)基因大豆方案I1、重組農(nóng)桿菌懸浮液的制備將含有除草劑抗性基因Bar的植物雙元表達(dá)載體PB2GW7 (Binary gatewayoverexpression vector PB2GW7)(文獻(xiàn):Dubin MJ, Bowler C, Benvenuto G.A modifiedGateway cloning strategy for overexpressing tagged proteins in plants.Plantmethods,2008,4(3):1-11.公眾可從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所獲得)轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens) EHA105 (購自北京天恩澤基因科技有限公司)中，得到含有目的基因的重組根癌農(nóng)桿菌EHA105/PB2GW7。將重組根癌農(nóng)桿菌EHA105/PB2GW7的單菌落用含壯觀霉素50mg/L和利福平25mg/L的YEP培養(yǎng)液(溶劑為水，溶質(zhì)及其濃度分別為:氯化鈉5g/L、酵母提取物5g/L和胰蛋白胨10g/L)于28°C培養(yǎng)至OD6tltl為0.8—1.2 ;4000rpm，離心lOmin，用如下液體培養(yǎng)基重懸至OD6tltl為0.6得到重組農(nóng)桿菌的懸浮液:溶劑為水，溶質(zhì)及其在所述液體培養(yǎng)基中的終濃度分別為:1/10的B5基本培養(yǎng)基無機(jī)鹽成分、B5基本培養(yǎng)基有機(jī)成分、蔗糖30g/L、2-(N-嗎啉)乙磺酸3.9g/L、6_芐基腺嘌呤1.67mg/L、L-半胱氨酸1000mg/L、二硫蘇糖醇154mg/L、硫代硫酸鈉158mg/L、乙酰丁香酮 200 μ mol/L、赤霉素 0.lmg/L ；所述1/10的B5基本培養(yǎng)基無機(jī)鹽成分為KN03250mg/L、CaCl2113mg/L、MgS04122mg/L、(NH4) 2S0413.4mg/L、KI0.075mg/L、H3BO40.3mg/L、MnS047mg/L、ZnSO4L 15mg/L、Na2MoO40.21mg/L、CoCl20.014mg/L、CuSO40.016mg/L、Na2_EDTA3.73mg/L、FeS0415.2mg/L ；所述B5基本培養(yǎng)基有機(jī)成分為肌醇100mg/L、煙酸lmg/L、鹽酸批B多醇lmg/L、鹽酸硫銨 10mg/L。2、幼苗的準(zhǔn)備挑取飽滿且表面無病斑的大豆品種東農(nóng)50種子，間隔一定距離置于潤(rùn)濕的雙層濾紙間，包裹呈紙卷，放于塑料盒中水培，25°C、光周期為每天光照16小時(shí)、黑暗8小時(shí)、光照強(qiáng)度為ΙΟΟμπιοΙ.πΓ2.s-1的條件下培養(yǎng)至種子萌發(fā)7天，去除頂芽和側(cè)芽，進(jìn)行步驟3的注射侵染。3、注射侵染及共培養(yǎng)取步驟I制備的重組農(nóng)桿菌的懸浮液，通過內(nèi)徑為0.1_、外徑為0.24mm的管狀針頭注射(圖1)到步驟2的去除頂芽和側(cè)芽的所述幼芽的子葉節(jié)分生組織處，每個(gè)所述幼苗注射80 μ L，將所述幼苗置于25°C、黑暗、濕度為70%的條件下用水培養(yǎng)(即共培養(yǎng))3天。4、成苗培養(yǎng)及篩選

將經(jīng)步驟3共培養(yǎng)的幼苗移栽至土壤中于正常水肥條件下培養(yǎng)10天左右，直到長(zhǎng)出三出復(fù)葉后，用100mg/L的草胺膦涂抹三出復(fù)葉的葉片，3天后，觀察葉片是否變黃，部分結(jié)果如圖2所示，野生型未轉(zhuǎn)基因大豆東農(nóng)20的陰性植株涂抹草胺膦的葉片變黃(圖2中的左圖)，轉(zhuǎn)基因植株涂抹草胺膦的葉片仍為綠色(圖2中的右圖)。去除葉片變黃的植株，保留葉片無明顯變化的植株。5、PCR 鑒定
取經(jīng)步驟4經(jīng)草胺膦篩選無明顯變化的植株，提取基因組DNA，以該DNA為模板進(jìn)行抗性基因Bar的PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，擴(kuò)增產(chǎn)物中含有440bp的Bar基因片段的植株為陽性轉(zhuǎn)基因植株，不含有該片段的植株為陰性轉(zhuǎn)基因植株，部分?jǐn)U增結(jié)果如圖3所不。上述PCR擴(kuò)增使用的引物序列如下:擴(kuò)增Bar 基因的正向引物:5’ -GCACCATCGTCAACCACTAC-3’ ；擴(kuò)增Bar 基因的反向引物:5’ -TGAAGTCCAGCTGCCAGAAAC-3’。6、實(shí)驗(yàn)結(jié)果步驟I一 5的實(shí)驗(yàn)設(shè)置三次重復(fù)，結(jié)果如表I所示。表1、農(nóng)桿菌介導(dǎo)培育轉(zhuǎn)基因大豆的統(tǒng)計(jì)結(jié)果
權(quán)利要求
1.培育轉(zhuǎn)基因大豆的方法，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)將目的DNA轉(zhuǎn)入大豆細(xì)胞，其特征在于:所述方法包括如下步驟: 1)在大豆種子萌發(fā)幼苗的子葉節(jié)分生組織處注射含有目的DNA的重組農(nóng)桿菌的懸浮液后，將所述幼苗進(jìn)行共培養(yǎng)； 2)將經(jīng)步驟I)共培養(yǎng)的所述幼苗直接進(jìn)行長(zhǎng)苗培養(yǎng)，即得到具有根、莖和葉的轉(zhuǎn)基因大豆植株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述注射時(shí)的所述幼苗為種子萌發(fā)5—10天的幼苗。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于:所述注射前，包括將所述幼苗的頂芽和側(cè)芽去除的步驟。
4.根據(jù)權(quán)利要求1一3中任一所述的方法，其特征在于:所述重組農(nóng)桿菌的懸浮液按照包括如下步驟的方法制備:將所述重組農(nóng)桿菌懸浮于具有如下組成的液體培養(yǎng)基中形成所述重組農(nóng)桿菌的懸浮液:溶劑為水，溶質(zhì)及其在所述液體培養(yǎng)基中的終濃度分別為:1/10的B5基本培養(yǎng)基無機(jī)鹽 成分、B5基本培養(yǎng)基有機(jī)成分、蔗糖30g/L、2-(N-嗎啉)乙磺酸3.9g/L、6-芐基腺嘌呤1.67mg/L、L-半胱氨酸400_1000mg/L、二硫蘇糖醇154mg/L、硫代硫酸鈉 158mg/L、乙酰丁香酮 0-300 μ mol/L、赤霉素 0.lmg/L ； 所述1/10的B5基本培養(yǎng)基無機(jī)鹽成分為KN03250mg/L、CaCl2113mg/L、MgS04122mg/L、(NH4) 2S0413.4mg/L、KI0.075mg/L、H3BO40.3mg/L、MnS047mg/L、ZnSO4L 15mg/L、Na2MoO40.21mg/L、CoCl20.014mg/L、CuSO40.016mg/L、Na2_EDTA3.73mg/L、FeS0415.2mg/L ； 所述B5基本培養(yǎng)基有機(jī)成分為肌醇100mg/L、煙酸lmg/L、鹽酸吡哆醇lmg/L、鹽酸硫銨10mg/Lo
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于:與所述液體培養(yǎng)基相比，所述重組農(nóng)桿菌的懸浮液的0D_值為0.4-1.0 ;所述重組農(nóng)桿菌的懸浮液的注射量為每個(gè)所述幼苗20_100u L0
6.根據(jù)權(quán)利要求1一5中任一所述的方法，其特征在于:所述注射通過內(nèi)徑為0.06mm-lmm、夕卜徑為0.20mm一1.14mm的針頭實(shí)現(xiàn)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1一6中任一所述的方法，其特征在于:所述農(nóng)桿菌為根癌農(nóng)桿菌，具體可為根癌農(nóng)桿菌EHA105。
8.根據(jù)權(quán)利要求1一7中任一所述的方法，其特征在于:所述共培養(yǎng)的條件為在溫度25 °C、黑暗條件下用水培養(yǎng)3天。
9.一種農(nóng)桿菌侵染植物用的液體培養(yǎng)基，其特征在于:所述液體培養(yǎng)基的溶劑為水，溶質(zhì)及其在所述液體培養(yǎng)基中的終濃度分別為:1/10的B5基本培養(yǎng)基無機(jī)鹽成分、B5基本培養(yǎng)基有機(jī)成分、蔗糖30g/L、2-(N-嗎啉)乙磺酸3.9g/L、6-芐基腺嘌呤1.67mg/L、L-半胱氨酸400_1000mg/L、二硫蘇糖醇154mg/L、硫代硫酸鈉158mg/L、乙酰丁香酮0-300 μ mol/L、赤霉素 0.lmg/L ； 所述1/10的B5基本培養(yǎng)基無機(jī)鹽成分為KN03250mg/L、CaCl2113mg/L、MgS04122mg/L、(NH4) 2S0413.4mg/L、KI0.075mg/L、H3BO40.3mg/L、MnS047mg/L、ZnSO4L 15mg/L、Na2MoO40.21mg/L、CoCl20.014mg/L、CuSO40.016mg/L、Na2_EDTA3.73mg/L、FeS0415.2mg/L ； 所述B5基本培養(yǎng)基有機(jī)成分為肌醇100mg/L、煙酸lmg/L、鹽酸吡哆醇lmg/L、鹽酸硫銨10mg/Lo
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的培養(yǎng)基，其特征在于:所述植物為單子葉植物或雙子葉植物，所述雙子葉植物具 體可為大豆。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)培育轉(zhuǎn)基因大豆的方法。該方法是通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)將目的DNA轉(zhuǎn)入大豆細(xì)胞，包括如下步驟1)在大豆種子萌發(fā)幼苗的子葉節(jié)分生組織處注射含有目的DNA的重組農(nóng)桿菌的懸浮液后，將所述幼苗進(jìn)行共培養(yǎng)；2)將經(jīng)步驟1)共培養(yǎng)的所述幼苗直接進(jìn)行長(zhǎng)苗培養(yǎng)，即得到具有根、莖和葉的轉(zhuǎn)基因大豆植株。本發(fā)明具有操作簡(jiǎn)單、轉(zhuǎn)化周期短、轉(zhuǎn)化效率高(最高可達(dá)15.3%)、經(jīng)濟(jì)節(jié)約、應(yīng)用范圍廣的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12N15/82GK103224954SQ20131019371
公開日2013年7月31日 申請(qǐng)日期2013年5月23日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月23日
發(fā)明者陳李淼, 沙愛華, 張曉娟, 單志慧, 陳水蓮, 張嬋娟, 邱徳珍, 周蓉, 周新安 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所