專利名稱：枯草芽孢桿菌L-天冬酰胺酶(ansZ)在大腸桿菌中的高效表達的制作方法
技術領域：
利用重組大腸桿菌高效表達B.subtilis6-7L-天冬酰胺酶，并首次對來源于枯草芽孢桿菌的L-天冬酰胺酶的酶學性質進行研究，屬于基因工程和酶工程領域。
背景技術：
L-天冬酰胺酶(EC3.5.1.1)即L-天酰胺酰胺基水解酶，能專一性地催化L-天冬酰胺水解生成天冬氨酸和氨。L-天冬酰胺酶是是一種有抗癌活性的蛋白酶，能專一催化L-天冬酰胺水解成天冬氨酸和MK15L-天冬酰胺酶的生理作用主要表現(xiàn)為對某些腫瘤的抑制作用，尤其對急性白血病和惡性淋巴腫瘤有效。L-天冬酰胺酶已成為治療白血病非常有效的藥物，且對骨髓沒有抑制作用。L-天冬酰胺酶可以減少食物中丙烯酰胺的生成。丙烯酰胺主要是由食品原料中的還原糖和天冬酰胺在高溫加熱過程中通過美拉德反應生成，在食物中加入天冬酰胺酶可以水解天冬酰胺，從源頭上減少丙烯酰胺的生成。1922年Clamenti首先發(fā)現(xiàn)豚鼠血清中含有豐富的L-天冬酰胺酶，1953年Kiddd觀察到豚鼠血清有破壞Gardner小鼠癌細胞6C3HED的作用，1961年Broome用層析法將豚鼠血清分離提純后，在有抗癌活力的部分測出極高的L-天冬酰胺酶活力，1964年Mashbum和Wriston從Escherichia coli B中部分提純了 L-天冬酰胺酶,發(fā)現(xiàn)其同樣具有抗癌作用。2004年Amrein等提出用L-天冬酰胺酶代替其他方法減少食物中丙烯酰胺含量。2009年Hendriksen等研究證明在高溫處理食品時加入L-天冬酰胺酶不會產生危害，同時有眾多學者通過具體的實驗證明L-天冬酰胺酶可以降低炸土豆片、馬鈴薯干粉、面團等食物中丙烯酰胺的含量。目前美國、德國、日本等國均已有產品出售，1995年美國還將L-天冬酰胺酶作為抗癌新藥開發(fā)。L-天冬酰胺 酶來源多樣，一些微生物、哺乳動物及植物被證實含有L-天冬酰胺酶。Campbell等發(fā)現(xiàn)E.coli B中的L-天冬酰胺酶有EC-1和EC-2兩種組分，僅具有相對熱穩(wěn)定性的EC-2組分有抗癌作用。Schwartz等人在E.coli K-12中也發(fā)現(xiàn)兩種天冬酰胺酶:天冬酸胺酶 I 和 II。Escherichia col1、Erwinia chrysanthem1、B.subtilis 等均包含這兩種L-天冬酰胺酶,研究證實僅L-天冬酰胺酶II具有抗癌作用，來自Escherichiacoli和Erwinia chrysanthemi的L-天冬酰胺酶II已被開發(fā)為治療急性淋巴細胞白血病的有效藥物，目前研究的大部分是具有抗腫瘤效果的L-天冬酰胺酶II。因為野生菌株L-天冬酰胺酶產量低，近年來隨著基因工程技術的快速發(fā)展，利用基因工程技術構建L-天冬酰胺酶工程菌的報道日益增多，采用基因工程菌產L-天冬酰胺酶逐漸成為一個重要來源。本發(fā)明通過分子生物學技術獲得L-天冬酰胺酶基因，將其連接于表達載體上并轉化大腸桿菌成功構建基因工程菌，實現(xiàn)L-天冬酰胺酶的高效表達，并對重組酶的酶學性質進行研究。發(fā)明內容
本發(fā)明的主要研究內容:本發(fā)明利用分子技術克隆了來自B.subtilis6-7的L-天冬酰胺酶基因(簡稱ansZ)，構建重組表達載體pGEX-6P-l-ansZ，并將其轉化E.coli BL21,成功構建了基因工程菌pGEX-6P-l-ansZ/BL21，其酶活較原始菌提高了 266倍。利用親和層析法對表達的重組蛋白進行純化，純酶比酶活為56.30U/mg，并對該酶的酶學性質進行了研究，為該酶在食品及醫(yī)藥方面的應用提供一些理論基礎。本發(fā)明的技術方案:1.L-天冬酰胺酶引物設計根據NCBI枯草芽孢桿菌全基因組核酸序列中ansZ基因序列，設計L-天冬酰胺酶基因的PCR引物Pl和P2。Pl:5，-GAC GGA TCC ATG AAAAAA CAA CGAATG CT-3，(BamHI)P2:5，-GAC CTC GAG TTAATA CTC ATT GAAATAAG-3’ (Xho I)2.重組菌的構建從B.subtilis6-7中抽提染色體DNA作為模板，根據預先設計好的引物、PCR擴增條件和擴增體系進行PCR。采用凝膠 回收試劑盒對PCR產物進行純化和回收，電泳檢驗回收產物的濃度。采用相同的限制性內切酶對載體PGEX-6P-1和純化的PCR產物進行雙酶切，電泳檢驗酶切產物，并用凝膠回收試劑盒對酶切產物進行純化和回收。將載體和PCR產物用T4DNA連接酶過夜連接，將連接產物轉入E.coli BL21的感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆于加入氨芐的IOmL的LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)過夜，提取質粒，酶切驗證正確后，將菌液加入甘油于-40°C冰箱保存。3.重組蛋白的表達將構建好的工程菌接種于LB培養(yǎng)基中進行活化，次日轉接于發(fā)酵培養(yǎng)基中，IPTG誘導表達，離心收集菌體，破細胞獲得粗酶液，采用氨電極法測定酶活。3.重組菌L-天冬酰胺酶的表達純化將獲得的粗酶液通過親和層析得到純酶液，對該酶的酶學性質進行初步研究，蛋白質含量采用Bradford法測定，以BSA為標準蛋白。本發(fā)明的有益效果:L-天冬酰胺酶的生理作用主要表現(xiàn)為對某些腫瘤的抑制作用，尤其對急性白血病和惡性淋巴腫瘤有效，L-天冬酰胺酶已成為治療白血病非常有效的藥物，而且L-天冬酰胺酶可以減少食物中丙烯酰胺的生成。本發(fā)明首次探索了枯草芽孢桿菌來源的L-天冬酰胺酶基因在E.coliBL21中的表達，構建了高產L-天冬酰胺酶的基因工程菌株，并對重組蛋白的酶學性質進行研究，適用于工業(yè)化的生產和應用，具有一定的理論價值和應用價值。


圖1 質粒 pGEX-6P-l_ansZ 酶切驗證。I:pGEX-6P-l-ansZ/BamH I ；2:pGEX-6P-l_ansZ/BamH I+Xho I ；3 =DNAMarker:DL-2000 ；4:DNA Marker: λ -Hind III圖2L-天冬酰胺酶的表達與純化。I:pGEX-6P-l/BL21 全細胞；2:pGEX-6P-l_ansZ/BL21 全細胞；3 =ProteinMarker4:pGEX-6P-l_ansZ/BL21 破碎上清液；5:pGEX-6P-l_ansZ/BL21 穿透液；6:pGEX-6P-l-ansZ/BL21 洗脫液
具體實施例方式實施例1:重組質粒pGEX-6P-l_ansZ的構建及轉化[I]從B.subtilis6-7抽提染色體DNA作為模板。[2]以B.subtilis6_7總DNA為模板，利用實施例1提供的引物做PCR擴增，擴增條件為:94°C預變性,5min, 一個循環(huán);94°C變性,Imin, 56°C退火,lmin, 72°C 延伸,lmin30s,30個循環(huán)；72°C，10min，一個循環(huán)；15°C，lOmin，一個循環(huán)。PCR擴增體系:模板2 μ L，上下游引物各 0.5yL，dNTP Mix4pL, IOXEx Taq Buffer5 μ L，滅菌 ddH2037 μ L，Ex Taq DNA 聚合酶I μ L。采用凝膠回收試劑盒對PCR產物進行純化和回收，電泳檢驗回收產物的濃度?；厥债a物存放在1.5mL的離心管中，_20°C冰箱保存?zhèn)溆?。[3]構建重組質粒pMD18-T_ansZ，導入感受態(tài)E.coli JM109。PCR膠回收產物連接克隆載體pMD18-T，16°C過夜連接。連接產物轉化E.coil JM109，轉化產物涂布含氨芐青霉素的LB平板，經37 °C培養(yǎng)過夜，挑取菌落到IOmL液體LB培養(yǎng)基中，37 °C搖床過夜培養(yǎng)后提取質粒，命名為pMD18-T-ansZ，經酶切驗證連接成功后，將菌液加入甘油于_70°C冰箱保藏。[4]將[3]中提取的質粒和表達載體PGEX-6P-1分別用BamHI和XhoI進行雙酶切，利用凝膠回收試劑盒回收后進行連接。將連接好的重組質粒pGEX-6P-l-ansZ轉化到感受態(tài)E.coilBL21，轉化方法參照實施例[3]，用氨芐抗性平板篩選陽性克隆。37°C搖床過夜培養(yǎng)后提取質粒，酶切驗證正確后保藏菌種，-40°C冰箱保藏備用。實施例2:L-天冬酰胺酶高效表達及酶活測定[I]將構建好的工程菌接入IOmL液體LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)過夜，次日按2%的接種量轉接于發(fā)酵培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)至0D600約0.6 0.8時加入終濃度為Immol/L的IPTG，置于16°C搖床過夜誘導表達。低溫離心收集菌體，用超聲波破碎細胞，離心收集上清液作為粗酶液，12% SDS-PAGE檢測及分析。[2]酶活測定采用25mL測定體系，取兩支比色管，一支作為對照，一支為樣品管，均加9mL50mM的Tris-HCl (pH7.5)，10mL50mM的L-天冬酰胺底物，于37°C預熱，對照管加入5mL15%的三氯乙酸，對照管與樣品管均加0.5mL細胞破碎上清液，37°C反應15min，樣品管加入5mL15%的三氯乙酸終止反應。將反應溶液轉入50mL燒杯中并加入高濃度NaOHlmL，于電磁攪拌狀態(tài)下，用氨氣敏電極檢測L-天冬酰胺酶酶活。重組菌的酶活為10.41U/mL，較原始菌株酶活提高了 266倍。實施例3:L-天冬酰胺酶的純化及酶學性質[ I ]粗酶液經GST親和柱純化后得到純的L-天冬酰胺酶，純酶液比活力為56.30U/mg,利用純化的酶液進行酶學性質研究。[2]最適pH及pH穩(wěn)定性:用底物緩沖液L-Asn配制不同pH(3 10)的底物溶液，將酶加入不同pH底物緩沖液中，37°C下反應15min，測定不同pH條件下酶的活性，并進行比較，確定酶反應的最適pH值。將一定量的純酶液加入到不同pH值的緩沖液中，每隔一定時間取樣，測定酶的剩余活性，觀察該酶在不同PH條件下的穩(wěn)定性。[3]最適 溫度和熱穩(wěn)定性:在20°C 80°C設置11個反應溫度20°C、25°C、30°C、35°C、40°C、45°C、50°C、55°C、6(rC、65°C、7(rC，測定不同溫度下酶的活力，確定酶的最適反應溫度。將純化的酶液分別在-2o°c、o°c、2o°c、3(rc、4(rc、5(rc、6(rc保溫，每隔2h取樣，
測定酶的剩余活力，研究該酶在不同溫度下的熱穩(wěn)定性。[4]不同金屬離子以及EDTA對酶活的影響:分別在反應體系中加入終濃度為Immol /I,的 Ca2+、Ba2+、Ni+、Zn2+、Mn2+、K+、Na+、Mg2+、Cu2+、La3+、Fe3+、Al3+ 離子以及 EDTA,以不添加任何金屬離子的酶活為100%，研究各金屬離子對酶活的影響。[5]Km值及Vmax的測定:配置不同濃度的底物，進行酶促反應，反應時間控制在5min。采用雙倒數作圖法確定L-天冬酰胺酶的Km及Vmax值。該酶反應最適pH為7.5，在pH值6.0-9.0的范圍內穩(wěn)定，反應最適溫度為40°C，在60°C處理2h后仍有10%的剩余酶活，Cu2+、La3+、Fe3+對L-天冬酰胺酶有明顯的抑制作用，而Na+和EDTA對酶的影響非常小，沒有發(fā)現(xiàn)對該酶有明顯激活作用的金屬離子，酶動力學參數以L-天冬酰胺為底物的Km值為`0.43mmol/L, Vmax為77.51 μ mol/(mL/min)。
權利要求
1.高產L-天冬酰胺酶重組菌E.coli BL21 (DE3)/pGEX-6P-l_ansZ的構建，其特征是以B.subtilis6-7基因組DNA為模板，擴增得到編碼L-天冬酰胺酶的基因ansZ，將其克隆到表達載體PGEX-6P-1上并轉化E.coli BL21 (DE3)，實現(xiàn)B.subtilis6_7L-天冬酰胺酶基因在 E.coli BL21(DE3)中高效表達，重組菌 E.coli BL21 (DE3)/pGEX-6P-l_ansZ 的酶活達到10.41U/mL，較出發(fā)菌株酶活提高了 266倍。
2.將重組蛋白純化，其特征在于利用表達載體PGEX-6P-1上的GST標簽，用GST融合蛋白親和層析法純化L-天冬酰胺酶；酶學性質結果表明該重組L-天冬酰胺酶具有如下酶學性質，該酶的反應最適pH為7.5，在pH值6.0-9.0的范圍內穩(wěn)定，反應最適溫度為40°C，在60°C處理2h后仍有10%的剩余酶活，Cu2+、La3+、Fe3+對L-天冬酰胺酶有明顯的抑制作用，而Na+和EDTA對酶的影響非常小，沒有發(fā)現(xiàn)對該酶有明顯激活作用的金屬離子，酶動力學參數以L-天冬酰胺 為底物的Km值為0.43mmol/L, Vmax為77.51 μ mol/(mL/min)。
全文摘要
以B.subtilis6-7基因組DNA為模板，擴增得到編碼L-天冬酰胺酶的基因ansZ，將其克隆到表達載體pGEX-6P-1上，首次實現(xiàn)枯草芽孢桿菌ansZ在E.coli BL21中高效表達，酶活測定表明重組菌酶活較原始菌提高了266倍。用GST融合蛋白親和層析法純化L-天冬酰胺酶。對該酶的酶學性質進行了初步研究，該酶的反應最適pH為7.5，在pH值6.0-9.0的范圍內穩(wěn)定，反應最適溫度為40℃，在60℃處理2h后仍有10％的剩余酶活，沒有發(fā)現(xiàn)對該酶有明顯激活作用的金屬離子，酶動力學參數以L-天冬酰胺為底物的Km值為0.43mmol/L，Vmax為77.51μmol/(mL/min)。
文檔編號C12R1/125GK103243063SQ201310196209
公開日2013年8月14日 申請日期2013年5月24日 優(yōu)先權日2013年5月24日
發(fā)明者饒志明, 賈明媚, 徐美娟 申請人:江南大學