專利名稱：一種雙層循環(huán)系統的灌注式生物反應器及其應用方法
技術領域：
本發(fā)明涉及醫(yī)療器械中的生物反應器技術領域，更具體地，涉及一種雙層循環(huán)系統的灌注式生物反應器及其應用方法。
背景技術：
現有生物反應器的結構如圖1所示，其功能是在體外制造一個與體內相似的環(huán)境，以加速培養(yǎng)細胞、形成組織乃至器官的系統，可廣泛應用于器官缺損患者替代、構建、保持或增強其組織功能，以及生物制藥等領域。其原理為根據細胞在體內生長微環(huán)境的生理、物理、化學特性，利用工程技術，在體外構建一套裝置，使其能提供與體內相近的微環(huán)境，以利于細胞在該體外微環(huán)境中進行增殖、分化，以及形成組織乃至器官。圖1為現有的灌注式生物反應器的結構示意圖，圖1中，培養(yǎng)液儲存罐2中的培養(yǎng)液通過導管由蠕動泵6抽取到培養(yǎng)罐7中支架8的入口，透過支架8，流入到培養(yǎng)罐7中，培養(yǎng)罐7中的培養(yǎng)液通過導管由蠕動泵4從培養(yǎng)罐7中抽出，通過三通閥5，回流到培養(yǎng)液儲存罐2或從導管3流入廢棄液儲存罐I中。含有氧氣的氣體從導氣管9中加到培養(yǎng)液中，培養(yǎng)液中的廢氣也可通過導氣管9排出。支架8多為多孔介質材料，種植在支架8內的細胞與流過支架的培養(yǎng)液之間存在營·養(yǎng)物質與新陳代謝排泄物的交換過程。細胞可在反應器中進行大規(guī)模增殖，也可進而進行細胞分化。細胞在體外培養(yǎng)過程中，需要相對穩(wěn)定的微環(huán)境，同時又需要能進行高效物質交換的動態(tài)環(huán)境，這是一對矛盾的需求，現有灌注式生物反應器的培養(yǎng)液循環(huán)流動方式，無法有效兼顧這個矛盾需求；生物反應器中為細胞提供營養(yǎng)物質的培養(yǎng)液中需保持一定的溶氧度,為此需向培養(yǎng)液中加注含有氧氣的混合氣體,現有灌注式生物反應器在加注該混合氣體時，存在一些問題。即現有灌注式生物反應器主要存在以下不足:
(I)、現有灌注式生物反應器難以克服培養(yǎng)液在循環(huán)流動過程中存在的矛盾需求:從細胞所需的營養(yǎng)物質與其新陳代謝排泄物的有效傳輸角度，需要培養(yǎng)液不間斷地連續(xù)循環(huán)灌注；然而，從細胞生長的微環(huán)境角度，需要維持相對穩(wěn)定的微環(huán)境，如果細胞培養(yǎng)的微環(huán)境變換過快，會稀釋細胞分泌的生長促進因子，不利于細胞增殖(參考文獻:王甜甜，干細胞體外三維培養(yǎng)的研究進展，[J]國際檢驗醫(yī)學雜志，2 O I 2年3月第3 3卷第6期)，為此，需要培養(yǎng)液維持相對穩(wěn)定?，F有灌注式生物反應器的常規(guī)解決辦法是動態(tài)培養(yǎng)與靜態(tài)培養(yǎng)相結合，即先靜置培養(yǎng)一段時間，此過程中培養(yǎng)液不循環(huán)流動，細胞在宏觀靜止的微環(huán)境中培養(yǎng)，然后循環(huán)灌注培養(yǎng)一段時間，即啟動培養(yǎng)液循環(huán)灌注功能，通過在培養(yǎng)罐與培養(yǎng)液儲存罐間循環(huán)流動培養(yǎng)液，在動態(tài)培養(yǎng)細胞的同時，將反應罐內的培養(yǎng)液換為新鮮的培養(yǎng)液。交替進行這兩種靜態(tài)與動態(tài)培養(yǎng)過程。這種常規(guī)的解決方法，由于存在一段時間的靜態(tài)培養(yǎng)，使得細胞培養(yǎng)的效率與質量不高。(2)、現有灌注式生物反應器在含氧混合氣體的加注方式上存在問題?，F有的灌注式生物反應器一般是在圖1中的培養(yǎng)液儲存罐2中通過導氣管9將含有氧氣的混合氣體(包含氧氣、二氧化碳、氮氣)加入培養(yǎng)液儲存罐2內的培養(yǎng)液中，這種加注氣體的方式，使得培養(yǎng)液中的溶氧率較低，分布也不夠均勻，并且容易導致產生的氣泡隨培養(yǎng)液進入培養(yǎng)罐7中，而氣泡破裂時會對培養(yǎng)的細胞產生破壞作用。

發(fā)明內容
本發(fā)明為克服上述現有技術所述的至少一種缺陷，提供一種雙層循環(huán)系統的灌注式生物反應器，以解決細胞在培養(yǎng)過程中對培養(yǎng)液循環(huán)流動的矛盾需求問題，并能有效提高培養(yǎng)液中氧的溶解度及其分布的均勻度，有利于培養(yǎng)液中廢氣的排出，并能有效消除氣泡進入細胞培養(yǎng)區(qū)域；進一步的，提供應用所述生物反應器的方法，該方法步驟簡潔。為解決上述技術問題，本發(fā)明采用的技術方案是:一種雙層循環(huán)系統的灌注式生物反應器，其中，包括培養(yǎng)罐、設于培養(yǎng)罐外部的外層循環(huán)系統、設于培養(yǎng)罐內部的內層循環(huán)系統和氣體加注系統；
本方案中，通過外層循環(huán)系統實現培養(yǎng)罐內培養(yǎng)液從外部的培養(yǎng)液儲存處獲得更新；通過內層循環(huán)系統實現培養(yǎng)罐內培養(yǎng)液在培養(yǎng)罐內部進行循環(huán)流動。氣體通過氣體加注系統加入到攪拌室內的空氣中，并排出未溶解入培養(yǎng)液的多余氣體及細胞新陳代謝排泄的廢氣。在生物反應器中設計了內、外雙層循環(huán)灌注系統，外層循環(huán)灌注系統確保培養(yǎng)罐內培養(yǎng)液的營養(yǎng)物質濃度維持在有利于細胞進行物質交換的范圍內；內層循環(huán)灌注系統實現了固定空間內的局部循環(huán)。在內層循環(huán)系統中，采用了槳葉攪拌的流體驅動與細胞培養(yǎng)區(qū)的分區(qū)域但共室的設計技術，使得細胞培養(yǎng)區(qū)的流體運動為平緩的層流，這種固定空間內的局部平緩層流，可確保細胞生長的微環(huán)境成分保持相對穩(wěn)定，又能有利于細胞與培養(yǎng)液間物質交換的有效進行。具體的，所述的外層循環(huán)系統包括廢棄液儲存罐、培養(yǎng)液儲存罐、三通閥、第一蠕動泵、第二蠕動泵、培養(yǎng)液導入管和培養(yǎng)液導出管，培養(yǎng)液導入管一端連接培養(yǎng)罐內部，另一端連接第二蠕動泵，第二蠕動泵通過導管連接培養(yǎng)液儲存罐；培養(yǎng)液導出管一端連接培養(yǎng)罐內部，另一端連接第一蠕動泵；三通閥包括三個出口，其第一出口連接第一蠕動泵，第二出口通過導管連接培養(yǎng)液儲存罐，第三出口通過導管連接廢棄液儲存罐；外層循環(huán)系統啟動后，第二蠕動泵產生的動力將培養(yǎng)液儲存罐中的新鮮培養(yǎng)液從培養(yǎng)液導入管輸送到培養(yǎng)罐內，同時，第一螺動泵將培養(yǎng)罐內的舊培養(yǎng)液從培養(yǎng)液導出管輸送到三通閥處，通過控制三通閥，可以控制培養(yǎng)液導出管中的培養(yǎng)液回到培養(yǎng)液儲存罐內，或是輸送到廢棄液儲存罐內。所述外層循環(huán)系統用來實現培養(yǎng)液的間歇式循環(huán)，即按照設定的間隔時間，通過蠕動泵將培養(yǎng)罐中的培養(yǎng)液進行整體更換，此時內層循環(huán)可以同時進行，也可以停止。所述的內層循環(huán)系統包括設于培養(yǎng)罐內的塔板、底部導通管、攪拌室，塔板的底部通過底部導通管與攪拌室的底部連接，內層循環(huán)系統還包括固定于培養(yǎng)罐上部的電機、與電機連接的連動桿、與連動桿固定的槳葉，連動桿和槳葉設于攪拌室內部；所述的攪拌室還開有出液口，出液口與培養(yǎng)罐內部連通；所述內層循環(huán)系統用來實現培養(yǎng)液在培養(yǎng)罐內進行局部連續(xù)循環(huán)，此時外層循環(huán)停止，培養(yǎng)罐中的培養(yǎng)液在攪拌室內槳葉攪拌的作用下，在塔板與攪拌室間進行局部小循環(huán)。

通過該內、外雙層循環(huán)灌注系統,可以解決細胞培養(yǎng)對培養(yǎng)液循環(huán)流動的矛盾需求問題。所采用的外層循環(huán)可以更新培養(yǎng)罐中的培養(yǎng)液，更新后的培養(yǎng)液中營養(yǎng)物的濃度較高，細胞新陳代謝排泄物的濃度較低，此狀況有利于細胞的新陳代謝過程有效進行；培養(yǎng)液更新完成后，停止外層循環(huán)，內層循環(huán)使得培養(yǎng)液僅在塔板與攪拌室之間進行局部循環(huán)，此局部空間的內部循環(huán)，使得細胞分泌的促生長因子仍停留在該局部空間之中，不會因該因子成分的過度過快稀釋而對細胞的生長造成不利影響，同時，該局部循環(huán)，也有利于更新細胞周圍的微環(huán)境，給細胞帶來營養(yǎng)物質，帶走新陳代謝排泄物，有利于細胞新陳代謝過程的順利進行。當新陳代謝過程進行一定時間后，培養(yǎng)罐內的營養(yǎng)物濃度因被細胞吸收而濃度較低，而排泄后的廢物濃度較高，不利于細胞新陳代謝所需要的物質交換過程的順利進行時，則再次啟動外層循環(huán)系統，將培養(yǎng)罐的培養(yǎng)液進行整體更換，如此反復交替進行，從而可解決細胞對培養(yǎng)液循環(huán)的矛盾需求問題，為細胞提供有利于其新陳代謝進程的微環(huán)境。所述的氣體加注系統包括氣體導入管、氣體導出管，氣體導入管一端設于培養(yǎng)罐外部，另一端連接攪拌室的底部；氣體導出管一端連接攪拌室的上部，另一端連接培養(yǎng)罐外部。具體的，生物反應器還包括塔板固定接頭、底座和底座固定桿，培養(yǎng)罐開口處設有頂蓋，塔板固定接頭一端固定于頂蓋上，另一端固定塔板；底座固定桿一端固定于頂蓋上，另一端固定底座，底座承托塔板。具體的，所述的攪拌室包括攪拌室底座、設于攪拌室底座上的攪拌室外筒和攪拌室內筒；連動桿和槳葉設于攪拌室內筒內，氣體導出管和出液口設于攪拌室外筒上部。具體的，所述的攪拌室底座的圓周上開有氣體導入口，氣體導入口連接氣體導入管，攪拌室內筒底部設有氣體入口，氣體入口與氣體導入口連通。所述的攪拌室內筒底部還設有培養(yǎng)液入口，培養(yǎng)液入口與底部導通管連通。內層循環(huán)系統啟動后，電機通過連動桿帶動槳葉進行高速旋轉，高速旋轉的槳葉帶動槳葉區(qū)域內的培養(yǎng)液向上向外快速甩出，使得槳葉下方區(qū)域因培養(yǎng)液的減少而壓力下降，從而可將塔板區(qū)域的培養(yǎng)液通過底部導通管吸引到槳葉下方區(qū)域。隨著槳葉的高速旋轉而向上向外甩出的培養(yǎng)液，將沿著攪拌室內筒、攪拌室外筒的內壁面向上移動到達出液口，從出液口流出攪拌室，流回到塔板區(qū)域，形成一個培養(yǎng)罐內部的培養(yǎng)液循環(huán)流動的路線。槳葉高速攪拌產生的培養(yǎng)液湍流經過攪拌室內筒的阻礙緩沖作用后，再從攪拌室外筒上方的出液口流出時，已經是平緩流動的層流，從而可避免快速復雜的湍流對塔板區(qū)域的影響，使得塔板區(qū)域的流體運動為簡單的層流，這有利于塔板區(qū)域內的細胞生長微環(huán)境的相對穩(wěn)定。含有氧氣的混合氣體(含有氧氣、二氧化碳、氮氣)從氣體導入管進入攪拌室內槳葉側下方的培養(yǎng)液中，氣體在培養(yǎng)液中產生的氣泡，被高速旋轉的槳葉瞬間擊碎，并在槳葉的攪拌作用下，快速而均勻地溶解到培養(yǎng)液中。未溶解的多余氣體則上浮到攪拌室上方，從氣體導出管排出。細胞排泄到培養(yǎng)液中的廢氣隨培養(yǎng)液進入到攪拌室內后，在槳葉的快速攪拌作用下，可快速從培養(yǎng)液中釋放出，然后從氣體導出管排出。連動桿在電機的驅動下帶動槳葉作高速旋轉，對攪拌室內筒中的培養(yǎng)液產生上升力，拉動底部導通管內的培養(yǎng)液從培養(yǎng)液入口進入攪拌室內筒,實現了對培養(yǎng)罐內培養(yǎng)液進行局部循環(huán)的驅動功 能；氣體進入氣體導入口，從氣體入口到達槳葉的側下方的培養(yǎng)液中，所產生的氣泡會被快速旋轉的槳葉擊碎，從而實現了破除氣泡的功能；進入到培養(yǎng)液的氣體，在槳葉的攪拌作用下，能快速而均勻地溶解到培養(yǎng)液中，實現了氧在培養(yǎng)液中快速而均勻地溶解功能；培養(yǎng)液中的廢氣，在槳葉的攪拌作用下，能快速地從培養(yǎng)液中釋放分離，實現了促進培養(yǎng)液中廢氣的釋放分離功能。在內層循環(huán)系統的攪拌室底部、槳葉的側下方加入氣體。加入的氣體在培養(yǎng)液中產生的氣泡，在高速轉動的槳葉攪拌作用下，會被瞬間擊碎。槳葉在高速轉動時對不同比重的物質所產生的離心力不同，由于氣體比重遠小于培養(yǎng)液的比重，培養(yǎng)液會在較大離心力的作用下向外圍分散，而少量未被及時擊碎的氣泡會在較小離心力的作用下，集中在旋渦中心區(qū)域而迅速與培養(yǎng)液分區(qū)域分布，然后向上浮出液面，從攪拌室的氣體導出管排出，從而有效消除了氣泡進入細胞培養(yǎng)區(qū)域后破裂時對細胞造成損害問題。氣泡被擊碎后，在高速攪拌的作用下，可以快速溶解入培養(yǎng)液中，提高氧氣在培養(yǎng)液中的溶解度，而且可以均勻地分布到培養(yǎng)中。而培養(yǎng)液中的新陳代謝廢氣，在槳葉的快速攪拌作用下，可快速從培養(yǎng)液中釋放到液面上，然后從氣體導出管排出。通過該氣體加注方式，可以有效提高培養(yǎng)液中氧的溶解度及其分布的均勻度，有利于培養(yǎng)液中廢氣的排出，并能有效消除氣泡進入細胞培養(yǎng)區(qū)域。一種應用所述生物反應器的方法，其中包括以下步驟:
S1.啟動外層循環(huán)系統的第二蠕動泵，將培養(yǎng)液儲存罐內的培養(yǎng)液通過培養(yǎng)液導入管輸送到培養(yǎng)罐內；將接種有細胞的塔板安置到培養(yǎng)罐內，啟動外層循環(huán)系統的第二蠕動泵，將培養(yǎng)液儲存罐內的新鮮培養(yǎng)液通過培養(yǎng)液導入管輸送到培養(yǎng)罐內，直到培養(yǎng)罐內輸入了所需容量的培養(yǎng)液時停止外層循環(huán)系統。S2.啟動內層循環(huán)系統的電機，通過連動桿帶動槳葉旋轉，塔板的培養(yǎng)液通過底部導通管吸引到槳葉下方，沿著攪拌室內筒、攪拌室外筒的內壁面向上移動到達出液口，從出液口流出攪拌室，流回到塔板；啟動內層循環(huán)系統的電機，通過連動桿帶動槳葉作高速旋轉，槳葉的高速旋轉產生吸力，將培養(yǎng)罐內的培養(yǎng)液，從塔板內通過底部導通管進入攪拌室內筒，接著在槳葉旋轉產生的升力作用下，沿攪拌室內筒的內壁上升進入攪拌室外筒，攪拌室內筒中作快速湍流運動的·培養(yǎng)液經攪拌室內筒壁面的阻礙緩沖作用后，在攪拌室外筒中變?yōu)榫徛纳仙?，到達出液口，從出液口流出攪拌室外筒，以平緩的層流運動流回到塔板區(qū)域。因此，培養(yǎng)液在塔板的細胞培養(yǎng)區(qū)，是平緩而簡單的層流運動，而在攪拌室內筒區(qū)域，則是急速而復雜的湍流運動。同時啟動氣體加注系統，混合氣體從氣體導入管加注到攪拌室內筒，在槳葉的攪拌作用下，混合氣體溶解到培養(yǎng)液中，未溶解的余氣及細胞排泄在培養(yǎng)液中的廢氣，從氣體導出管排出培養(yǎng)罐外部；在啟動內存循環(huán)系統的同時，啟動氣體加注系統，含有氧氣的混合氣體(包含氧氣、二氧化碳、氮氣)從氣體導入管加注到攪拌室內筒區(qū)域的培養(yǎng)液中，氣體在培養(yǎng)液中所產生的氣泡，被高速旋轉的槳葉瞬間擊碎，并在攪拌作用下，被快速而均勻地溶解到培養(yǎng)液中。未溶解的余氣及細胞排泄在培養(yǎng)液中的廢氣，從氣體導出管排出。S3.當培養(yǎng)罐內培養(yǎng)液中的營養(yǎng)物質因被細胞吸收而降低到一定濃度,或是培養(yǎng)罐內培養(yǎng)液中因細胞新陳代謝而排泄的廢物濃度增加到一定濃度時，再次啟動外層循環(huán)系統，通過第一蠕動泵將培養(yǎng)罐內舊的培養(yǎng)液通過培養(yǎng)液導出管、三通閥，抽送到廢棄液儲存罐中。再將培養(yǎng)液儲存罐內的新鮮培養(yǎng)液通過培養(yǎng)液導入管輸送到培養(yǎng)罐中，實現培養(yǎng)罐內培養(yǎng)液的更新。在此外層循環(huán)進行培養(yǎng)液更新過程中，內層循環(huán)可以停止，也可以不停止。所述的步驟S1、S2、S3循環(huán)進行。培養(yǎng)罐5內的培養(yǎng)液更新完成后，停止外層循環(huán)系統，繼續(xù)進行內層循環(huán)系統。內、外層循環(huán)系統如此反復交替進行。與現有技術相比，有益效果是:
1、兼顧了細胞培養(yǎng)對生長的微環(huán)境的一對矛盾需求，即:為不過快過度稀釋細胞所釋放的促生長因子，細胞所在的微環(huán)境成分應維持相對穩(wěn)定；為促進細胞與培養(yǎng)液間的物質交換，細部所在的微環(huán)境應有一定的變化，能及時補充細胞周期被細胞吸收的營養(yǎng)物質成分，帶走細胞排泄的代謝物成分。在生物反應器中設計了內、外雙層循環(huán)灌注系統，外層循環(huán)灌注系統確保培養(yǎng)罐內培養(yǎng)液的營養(yǎng)物質濃度維持在有利于細胞進行物質交換的范圍內；內層循環(huán)灌注系統實現了固定空間內的局部循環(huán)。在內層循環(huán)系統中，采用了槳葉攪拌的流體驅動與細胞培養(yǎng)區(qū)的分區(qū)域但共室的設計技術，使得細胞培養(yǎng)區(qū)的流體運動為平緩的層流，這種固定空間內的局部平緩層流，可確保細胞生長的微環(huán)境成分保持相對穩(wěn)定，又能有利于細胞與培養(yǎng)液間物質交換的有效進行。2、兼顧了含氧氣體在培養(yǎng)液中快速、均勻加注，加注氣體時產生氣泡的消除，以及培養(yǎng)液中廢氣的有效排出問題。在生物反應器內層循環(huán)灌注系統中槳葉旋轉區(qū)域的培養(yǎng)液中加注氣體的方法，通過快速旋轉的槳葉，實現了含氧氣體在培養(yǎng)液中快速、均勻加注，加注氣體時產生氣泡的消除，以及培養(yǎng)液中廢氣的有效排出功能。


圖1是現有的灌注式生物反`應器整體示意圖。圖2是本發(fā)明的整體示意圖。圖3是本發(fā)明的局部放大示意圖。圖4是本發(fā)明的灌注式生物反應器工作流程示意圖。
具體實施例方式附圖僅用于示例性說明，不能理解為對本專利的限制；為了更好說明本實施例，附圖某些部件會有省略、放大或縮小，并不代表實際產品的尺寸；對于本領域技術人員來說，附圖中某些公知結構及其說明可能省略是可以理解的。如圖2、3所不,一種雙層循環(huán)系統的灌注式生物反應器,其中,包括培養(yǎng)罐5、設于培養(yǎng)罐5外部的外層循環(huán)系統、設于培養(yǎng)罐5內部的內層循環(huán)系統和氣體加注系統；
外層循環(huán)系統包括廢棄液儲存罐1、培養(yǎng)液儲存罐2、三通閥3、第一蠕動泵4A、第二蠕動泵4B、培養(yǎng)液導入管6和培養(yǎng)液導出管7,培養(yǎng)液導入管6 —端連接培養(yǎng)罐5內部,另一端連接第二蠕動泵4B，第二蠕動泵4B通過導管連接培養(yǎng)液儲存罐2 ;培養(yǎng)液導出管7 —端連接培養(yǎng)罐5內部，另一端連接第一蠕動泵4A ;三通閥3包括三個出口，其第一出口連接第一蠕動泵4A，第二出口通過導管連接培養(yǎng)液儲存罐2，第三出口通過導管連接廢棄液儲存罐I ;外層循環(huán)系統啟動后，第二蠕動泵4B產生的動力將培養(yǎng)液儲存罐2中的新鮮培養(yǎng)液從培養(yǎng)液導入管6輸送到培養(yǎng)罐5內，同時,第一螺動泵4A將培養(yǎng)罐5內的舊培養(yǎng)液從培養(yǎng)液導出管7輸送到三通閥3處，通過控制三通閥3，可以控制培養(yǎng)液導出管中的培養(yǎng)液回到培養(yǎng)液儲存罐2內，或是輸送到廢棄液儲存罐I內。所述外層循環(huán)系統用來實現培養(yǎng)液的間歇式循環(huán)，即按照設定的間隔時間，通過蠕動泵將培養(yǎng)罐中的培養(yǎng)液進行整體更換，此時內層循環(huán)可以同時進行，也可以停止。內層循環(huán)系統包括設于培養(yǎng)罐5內的塔板9、底部導通管12、攪拌室，塔板9的底部通過底部導通管12與攪拌室的底部連接，內層循環(huán)系統還包括固定于培養(yǎng)罐5上部的電機19、與電機19連接的連動桿20、與連動桿20固定的槳葉18，連動桿20和槳葉18設于攪拌室內部；所述的攪拌室還開有出液口 16，出液口 16與培養(yǎng)罐5內部連通；生物反應器還包括塔板固定接頭8、底座10和底座固定桿11，培養(yǎng)罐5開口處設有頂蓋，塔板固定接頭8一端固定于頂蓋上，另一端固定塔板9 ;底座固定桿11 一端固定于頂蓋上，另一端固定底座10，底座10承托塔板9。攪拌室包括攪拌室底座24、設于攪拌室底座24上的攪拌室外筒15和攪拌室內筒17 ;連動桿20和槳葉18設于攪拌室內筒17內，氣體導出管14和出液口 16設于攪拌室外筒15上部。氣體加注系統包括氣體導入管13、氣體導出管14，氣體導入管13一端設于培養(yǎng)罐5外部，另一端連接攪拌室的底部；氣體導出管14一端連接攪拌室的上部，另一端連接培養(yǎng)罐5外部。內層循環(huán)系統啟動后，電機19通過連動桿20帶動槳葉18進行高速旋轉,高速旋轉的槳葉18帶動槳葉區(qū)域內的培養(yǎng)液向上向外快速甩出，使得槳葉下方區(qū)域因培養(yǎng)液的減少而壓力下降，從而可將塔板9區(qū)域的培養(yǎng)液通過底部導通管12吸引到槳葉下方區(qū)域。隨著槳葉18的高速旋轉而向上向外甩出的培養(yǎng)液，將沿著攪拌室內筒、攪拌室外筒的內壁面向上移動到達出液口 16，從出液口 16流出攪拌室，流回到塔板9區(qū)域，形成一個培養(yǎng)罐內部的培養(yǎng)液循環(huán)流動的路線。槳葉18高速攪拌產生的培養(yǎng)液湍流經過攪拌室內筒的阻礙緩沖作用后，再從攪拌室外筒上方的出液口 16流出時，已經是平緩流動的層流，從而可避免快速復雜的湍流對塔板9區(qū)域的影響，使得塔板9區(qū) 域的流體運動為簡單的層流，這有利于塔板9區(qū)域內的細胞生長微環(huán)境的相對穩(wěn)定。攪拌室底座24的圓周上開有氣體導入口 21，氣體導入口 21連接氣體導入管13，攪拌室內筒17底部設有氣體入口 22，氣體入口 22與氣體導入口 21連通。攪拌室內筒17底部還設有培養(yǎng)液入口 23，培養(yǎng)液入口 23與底部導通管12連通。含有氧氣的混合氣體(含有氧氣、二氧化碳、氮氣)從氣體導入管13進入攪拌室內槳葉側下方的培養(yǎng)液中，氣體在培養(yǎng)液中產生的氣泡，被高速旋轉的槳葉18瞬間擊碎，并在槳葉的攪拌作用下，快速而均勻地溶解到培養(yǎng)液中。未溶解的多余氣體則上浮到攪拌室上方，從氣體導出管14排出。細胞排泄到培養(yǎng)液中的廢氣隨培養(yǎng)液進入到攪拌室內后，在槳葉18的快速攪拌作用下，可快速從培養(yǎng)液中釋放出，然后從氣體導出管14排出。連動桿20在電機19的驅動下帶動槳葉18作高速旋轉，對攪拌室內筒中的培養(yǎng)液產生上升力，拉動底部導通管12內的培養(yǎng)液從培養(yǎng)液入口 23進入攪拌室內筒17，實現了對培養(yǎng)罐內培養(yǎng)液進行局部循環(huán)的驅動功能；氣體進入氣體導入口 21，從氣體入口 21通過氣體入口 22到達槳葉18的側下方的培養(yǎng)液中，所產生的氣泡會被快速旋轉的槳葉18擊碎，從而實現了破除氣泡的功能；進入到培養(yǎng)液的氣體，在槳葉18的攪拌作用下，能快速而均勻地溶解到培養(yǎng)液中，實現了氧在培養(yǎng)液中快速而均勻地溶解功能；培養(yǎng)液中的廢氣，在槳葉的攪拌作用下，能快速地從培養(yǎng)液中釋放分離，實現了促進培養(yǎng)液中廢氣的釋放分離功倉泛。如圖4所示，一種應用所述生物反應器的方法，其中包括以下步驟:
S1.啟動外層循環(huán)系統的第二蠕動泵，將培養(yǎng)液儲存罐內的培養(yǎng)液通過培養(yǎng)液導入管輸送到培養(yǎng)罐內；將接種有細胞的塔板安置到培養(yǎng)罐內，啟動外層循環(huán)系統的第二蠕動泵，將培養(yǎng)液儲存罐內的新鮮培養(yǎng)液通過培養(yǎng)液導入管輸送到培養(yǎng)罐內，直到培養(yǎng)罐內輸入了所需容量的培養(yǎng)液時停止外層循環(huán)系統。S2.啟動內層循環(huán)系統的電機，通過連動桿帶動槳葉旋轉，塔板的培養(yǎng)液通過底部導通管吸引到槳葉下方，沿著攪拌室內筒、攪拌室外筒的內壁面向上移動到達出液口，從出液口流出攪拌室，流回到塔板；啟動內層循環(huán)系統的電機，通過連動桿帶動槳葉作高速旋轉，槳葉的高速旋轉產生吸力，將培養(yǎng)罐內的培養(yǎng)液，從塔板內通過底部導通管進入攪拌室內筒，接著在槳葉旋轉產生的升力作用下，沿攪拌室內筒的內壁上升進入攪拌室外筒，攪拌室內筒中作快速湍流運動的培養(yǎng)液經攪拌室內筒壁面的阻礙緩沖作用后，在攪拌室外筒中變?yōu)榫徛纳仙?，到達出液口，從出液口流出攪拌室外筒，以平緩的層流運動流回到塔板區(qū)域。因此，培養(yǎng)液在塔板的細胞培養(yǎng)區(qū)，是平緩而簡單的層流運動，而在攪拌室內筒區(qū)域，則是急速而復雜的湍流運動。同時啟動氣體加注系統，混合氣體從氣體導入管加注到攪拌室內筒，在槳葉的攪拌作用下，混合氣體溶解到培養(yǎng)液中，未溶解的余氣及細胞排泄在培養(yǎng)液中的廢氣，從氣體導出管排出培養(yǎng)罐外部；在啟動內存循環(huán)系統的同時，啟動氣體加注系統，含有氧氣的混合氣體(包含氧氣、二氧化碳、氮氣)從氣體導入管加注到攪拌室內筒區(qū)域的培養(yǎng)液中，氣體在培養(yǎng)液中所產生的氣泡，被高速旋轉的槳葉瞬間擊碎，并在攪拌作用下，被快速而均勻地溶解到培養(yǎng)液中。未溶解的余氣及細胞排泄在培養(yǎng)液中的廢氣，從氣體導出管排出。S3.當培養(yǎng)罐內培養(yǎng)液中的營養(yǎng)物質因被細胞吸收而降低到一定濃度,或是培養(yǎng)罐內培養(yǎng)液中因細胞新陳代 謝而排泄的廢物濃度增加到一定濃度時，再次啟動外層循環(huán)系統，通過第一蠕動泵將培養(yǎng)罐內舊的培養(yǎng)液通過培養(yǎng)液導出管、三通閥，抽送到廢棄液儲存罐中。再將培養(yǎng)液儲存罐內的新鮮培養(yǎng)液通過培養(yǎng)液導入管輸送到培養(yǎng)罐中，實現培養(yǎng)罐內培養(yǎng)液的更新。在此外層循環(huán)進行培養(yǎng)液更新過程中，內層循環(huán)可以停止，也可以不停止。所述的步驟S1、S2、S3循環(huán)進行。培養(yǎng)罐5內的培養(yǎng)液更新完成后，停止外層循環(huán)系統，繼續(xù)進行內層循環(huán)系統。內、外層循環(huán)系統如此反復交替進行。顯然，本發(fā)明的上述實施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對本發(fā)明的實施方式的限定。對于所屬領域的普通技術人員來說，在上述說明的基礎上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這里無需也無法對所有的實施方式予以窮舉。凡在本發(fā)明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發(fā)明權利要求的保護范圍之內。
權利要求
1.一種雙層循環(huán)系統的灌注式生物反應器，其特征在于，包括培養(yǎng)罐(5)、設于培養(yǎng)罐(5)外部的外層循環(huán)系統、設于培養(yǎng)罐(5)內部的內層循環(huán)系統和氣體加注系統； 所述的外層循環(huán)系統包括廢棄液儲存罐(I)、培養(yǎng)液儲存罐(2)、三通閥(3)、第一蠕動泵(4A)、第二螺動泵(4B)、培養(yǎng)液導入管(6)和培養(yǎng)液導出管(7),培養(yǎng)液導入管(6)—端連接培養(yǎng)罐(5)內部，另一端連接第二蠕動泵(4B)，第二蠕動泵(4B)通過導管連接培養(yǎng)液儲存罐(2);培養(yǎng)液導出管(7) —端連接培養(yǎng)罐(5)內部，另一端連接第一蠕動泵(4A);三通閥(3)包括三個出口，其第一出口連接第一蠕動泵(4A)，第二出口通過導管連接培養(yǎng)液儲存罐(2)，第三出口通過導管連接廢棄液儲存罐(I)； 所述的內層循環(huán)系統包括設于培養(yǎng)罐(5)內的塔板(9)、底部導通管(12)、攪拌室，塔板(9)的底部通過底部導通管(12)與攪拌室的底部連接，內層循環(huán)系統還包括固定于培養(yǎng)罐(5)上部的電機(19)、與電機(19)連接的連動桿(20)、與連動桿(20)固定的槳葉(18)，連動桿(20)和槳葉(18)設于攪拌室內部；所述的攪拌室還開有出液口(16)，出液口(16)與培養(yǎng)罐(5)內部連通； 所述的氣體加注系統包括氣體導入管(13)、氣體導出管(14)，氣體導入管(13) 一端設于培養(yǎng)罐(5)外部，另一端連接攪拌室的底部；氣體導出管(14) 一端連接攪拌室的上部，另一端連接培養(yǎng)罐(5)外部。
2.根據權利要求1所述的一種雙層循環(huán)系統的灌注式生物反應器，其特征在于，生物反應器還包括塔板固定接頭(8)、底座(10)和底座固定桿(11)，培養(yǎng)罐(5)開口處設有頂蓋，塔板固定接頭(8)—端固定于頂蓋上，另一端固定塔板(9);底座固定桿(11) 一端固定于頂蓋上,另一端固定底座(10 )，底座(10 )承托塔板(9 )。
3.根據權利要求2所述的一種雙層循環(huán)系統的灌注式生物反應器，其特征在于，所述的攪拌室包括攪拌室底座(24)、設于攪拌室底座(24)上的攪拌室外筒(15)和攪拌室內筒(17);連動桿(20)和槳葉(18)設于攪拌室內筒(17)內，氣體導出管(14)和出液口(16)設于攪拌室外筒(15)上部。
4.根據權利要求3所述的一種雙層循環(huán)系統的灌注式生物反應器，其特征在于，所述的攪拌室底座(24)的圓周上開有氣體導入口(21)，氣體導入口(21)連接氣體導入管(13)，攪拌室內筒(17)底部設有氣體入口(22)，氣體入口(22)與氣體導入口(21)連通。
5.根據權利要求4所述的一種雙層循環(huán)系統的灌注式生物反應器，其特征在于，所述的攪拌室內筒(17 )底部還設有培養(yǎng)液入口( 23 )，培養(yǎng)液入口( 23 )與底部導通管(12 )連通。
6.一種應用權利要求1至5任一所述生物反應器的方法，其特征在于包括以下步驟: . 51.啟動外層循環(huán)系統的第二蠕動泵(4B)，將培養(yǎng)液儲存罐(2)內的培養(yǎng)液通過培養(yǎng)液導入管(6)輸送到培養(yǎng)罐(5)內；. 52.啟動內層循環(huán)系統的電機(19)，通過連動桿(20)帶動槳葉(18)旋轉，塔板(9)的培養(yǎng)液通過底部導通管(12)吸引到槳葉(18)下方，沿著攪拌室內筒(17)、攪拌室外筒(15)的內壁面向上移動到達出液口( 16 )，從出液口( 16 )流出攪拌室，流回到塔板(9 ); 同時啟動氣體加注系統，混合氣體從氣體導入管(13 )加注到攪拌室內筒(17 )，在槳葉(18)的攪拌作用下，混合氣體溶解到培養(yǎng)液中，未溶解的余氣及細胞排泄在培養(yǎng)液中的廢氣，從氣體導出管(14)排出培養(yǎng)罐(5)外部； . 53.當培養(yǎng)罐(5)內培養(yǎng)液中的營養(yǎng)物質因被細胞吸收而降低到一定濃度,或是培養(yǎng)罐(5)內培養(yǎng)液中因細胞新陳代謝而排泄的廢物濃度增加到一定濃度時，再次啟動外層循環(huán)系統，通過第一蠕動泵(4A)將培養(yǎng)罐(5 )內舊的培養(yǎng)液通過培養(yǎng)液導出管(7 )、三通閥(3 )，抽送到廢棄液儲存罐(I)中。
7.根據權利要求6所述的應用方法，其特征在于，所述的步驟SI中，培養(yǎng)罐(5)內輸入了所需容量的培養(yǎng)液后，停止外層循環(huán)系統，第二蠕動泵(4B)關閉，再進行步驟S2。
8.根據權 利要求6所述的應用方法，其特征在于，所述的步驟S1、S2、S3循環(huán)進行。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)療器械中的生物反應器技術領域，更具體地，涉及一種雙層循環(huán)系統的灌注式生物反應器及其應用方法。一種雙層循環(huán)系統的灌注式生物反應器，其中，包括培養(yǎng)罐、設于培養(yǎng)罐外部的外層循環(huán)系統、設于培養(yǎng)罐內部的內層循環(huán)系統和氣體加注系統；解決細胞在培養(yǎng)過程中對培養(yǎng)液循環(huán)流動的矛盾需求問題，并能有效提高培養(yǎng)液中氧的溶解度及其分布的均勻度，有利于培養(yǎng)液中廢氣的排出，并能有效消除氣泡進入細胞培養(yǎng)區(qū)域。
文檔編號C12M1/04GK103243027SQ201310197609
公開日2013年8月14日 申請日期2013年5月24日 優(yōu)先權日2013年5月24日
發(fā)明者羅語溪, 高玉寶, 龔逸鴻, 蔣慶 申請人:中山大學