一種快速鑒別棉屬種的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地涉及棉屬DNA條形碼及快速準確的棉種鑒定方法。所述方法包括以下步驟：取材及總DNA的提取、PCR擴增、克隆及測序、序列比對。根據(jù)本發(fā)明的方法采用棉花葉綠體基因組特有引物對總DNA進行trnT-trnL和trnH-psbA序列的特異擴增，方便快捷，無需單獨提取葉綠體DNA，作為棉屬DNA條形碼的trnT-trnL和trnH-psbA序列組合，長度適中，對棉種識別力高，能夠快速地鑒定棉種，不依賴于傳統(tǒng)鑒定分類經(jīng)驗，操作簡便，準確性高。
【專利說明】一種快速鑒別棉屬種的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地涉及棉屬DNA條形碼及快速鑒別棉屬種的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著全球環(huán)境、氣候和能源等問題的突出，認識生物多樣性是可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略的迫切需求，而對生物多樣性保護和利用的基礎(chǔ)則是對物種進行快速而準確地鑒定。DNA條形碼技術(shù)(DNA barcoding)也應(yīng)運而生,Paul Hebert (2003)首先提出DNA barcode,指出DNA條形碼技術(shù)是利用標準的、有足夠變異的、易擴增且相對較短的DNA片段基于其在物種種間的多樣性和種內(nèi)的特異性而創(chuàng)建的一種新的物種分類識別系統(tǒng)，它可以對物種進行快速地鑒定。由于葉綠體基因序列保守性強，已經(jīng)被廣泛用來構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹和鑒定植物物種。DNA條形碼技術(shù)具有操作簡便、準確性高、快速高效等特點。對于傳統(tǒng)的分類工作，不同物種需要采取不同的技術(shù)方法，繁瑣而易出現(xiàn)錯誤，而DNA條形碼的出現(xiàn)則簡化了物種分類鑒定的過程，是一個較為通用的方法。DNA條形碼成為傳統(tǒng)物種鑒定的強有力補充，使得物種分類鑒定過程簡化，不過度依賴傳統(tǒng)分類經(jīng)驗。通過一個標準化、較短的基因片段序列變異來鑒定物種，特別是通過葉綠體序列片段的研究，使得DNA條形碼成為生命科學(xué)和生物【技術(shù)領(lǐng)域】進展最迅速的學(xué)科前沿之一。
[0003]研究表明，線粒體細胞色素C氧化酶I (cytochrome coxidase I,CO I)作為動物理想的DNA條形碼，但對于植物，因其線粒體基因進化速率較慢，不宜用作DNA條形碼，至今沒有找到一個標準的DNA barcode。2007年在第二屆國際條形碼大會提出了 7個候選片段，分別是 rbcL、matK、trnH-psbA、rpoCl、rpoB、psbK-psbl 和 atpF-atpH。2009 年生命條形碼聯(lián)盟(the Consortium for the Barcode of Life, CB0L)發(fā)表了一篇 PNAS 研究論文，提議將rbcL和matK基因的組合作為植物通用的DNA條形碼，而將trnH-psbA序列作為候選條形碼。隨后的第三屆國際DNA條形碼大會正式聲明將rbcL和matK基因的組合作為植物DNA核心條形碼，提議trnH-psbA片段和核基因片段ITS為植物DNA條形碼的補充條碼。2011年，第四屆國際DNA條形碼大會圍繞生物多樣性式樣、生態(tài)取證、系統(tǒng)學(xué)和分子進化安排了四個主題報告，并分組對DNA條形碼數(shù)據(jù)在這四個方面的重要科學(xué)問題開展了深入討論。繼上屆會議推薦了植物條形碼后，正式推薦了 ITS為真菌條形碼。
[0004] 但實際上目前建議的植物DNA條形碼(例如rbcL和matK基因)由于其分子進化速率較慢，在種級水平上分辨率較低，并不通用于任何物種和任何分類階元。常用條形碼在通用性上存在的局限性使得我們在不同的科屬種尋找不同的DNA barcode。理想的條形碼必須具備一下條件:第一，通用性，即物種均含有此片段，而且序列片段兩端相對保守的區(qū)域存在一對通用引物，可以容易地獲得產(chǎn)物；第二可讀性，能夠雙向測序，長度適中，序列不需要過多的人為編輯；第三，識別率，即鑒定能力，有足夠的變異，較高的物種識別率，將物種區(qū)分開來。
[0005]條形碼在通用性上存在的局限性使得我們在棉屬內(nèi)尋找合適的DNA barcode。對于棉屬DNA條形碼，即需要具備:具有一對通用的引物，能將其在所有棉種中都得到成功擴增；此片段長度適中，一次雙向測序即可以獲得，不需要過多編輯；具有較高的識別力，能夠區(qū)分所有棉種。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種快速而準確地鑒定棉種的方法。
[0007]本發(fā)明的再一目的是提供棉花葉綠體基因組序列用于DNA條形碼的應(yīng)用。
[0008]根據(jù)本發(fā)明，首先，尋找DNA條形碼，通過分析已經(jīng)測序的棉花葉綠體基因組序列，確定棉屬DNA條形碼為轉(zhuǎn)運RNA T和L的基因間區(qū)(trnT-trnL)以及轉(zhuǎn)運RNAH和編碼Dl蛋白質(zhì)的PsbA基因的基因間區(qū)(trnH-psbA)的序列組合(trnT-trnL+trnH-psbA),能夠區(qū)分任何一個棉種。
[0009]根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案，設(shè)計通用引物，根據(jù)條形碼序列在兩側(cè)設(shè)計葉綠體特異引物TL和HA，并使得能夠?qū)λ忻薹N進行有效擴增，所述通用引物對包括TL和HA，對于trnT-trnL,上游引物TLF的核苷酸序列為:CGATGACCATCGCATTACAAAT，下游引物TLR的核苷酸序列為:GGCTCAATCCAATTAAGTCCGTA，對于trnH-psbA，上游引物HAF的核苷酸序列為:CCCCTACAATTACTATACTCTAT，下游引物 HAR 的核苷酸序列為:GACTTTGGTTTTAGTGTATACGA。
[0010]根據(jù)本發(fā)明的鑒定棉種的方法包括以下步驟:
[0011]根據(jù)本發(fā)明的方法包括以下步驟:
[0012]I)設(shè)計通用引物，根據(jù)條形碼序列在兩側(cè)設(shè)計葉綠體特異引物TL和HA，并使得能夠?qū)λ忻薹N進行有效擴增，所述通用引物對包括TL和HA，對于trnT-trnL，上游引物TLF的核苷酸序列為:CGATGACCATCGCATTACAAAT，下游引物TLR的核苷酸序列為:GGCTCAATCCAATTAAGTCCGTA，對于trnH-psbA，上游引物HAF的核苷酸序列為:CCCCTACAATTACTATACTCTAT，下游引物 HAR 的核苷酸序列為:GACTTTGGTTTTAGTGTATACGA ；
[0013]2)取材及DNA的提取，取目的棉種葉片5g左右，利用CTAB法提取棉花總DNA ；
[0014]3) PCR擴增，設(shè)計擴增程序，利用設(shè)計的通用引物(TL和HA)進行降落PCR擴增；
[0015]4)PCR產(chǎn)物檢測及克隆測序，trnT-trnL目的片段約1500bp，HA目的片段約400bp，送菌液測序；
[0016]5)序列比對，參照條形碼序列，去除測得序列的兩端非目的片段序列，與DNA條形碼進行比對，以確定棉種。
[0017]根據(jù)本發(fā)明的方法只需提取棉種總DNA，通過PCR法特異地擴增作為棉屬DNA條形碼的葉綠體序列片段組合trnT-trnL+HA,方便快捷,無需單獨提取葉綠體DNA。
[0018]根據(jù)trnT-trnL+HA序列與已知條形碼的比對,直接確定棉種，快速準確，且不依賴于傳統(tǒng)鑒定分類經(jīng)驗，簡化了鑒定過程。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1是棉屬DNA條形碼比對圖(箭頭指示顯著的標記)；
[0020]圖2是棉屬DNA條形碼的通用引物TL和HA的設(shè)計；
[0021 ] 圖3是實施例中九個未知棉種的PCR擴增trnT-trnL產(chǎn)物；
[0022] 圖4是實施例中九個未知棉種的PCR擴增trnH-psbA產(chǎn)物?！揪唧w實施方式】
[0023]下面結(jié)合具體的實施例來進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明，而不能限制本發(fā)明的保護范圍。
[0024]實施例1 二十個已知棉種的DNA條形碼的獲得
[0025]I材料和方法
[0026]1.1實驗材料
[0027]實驗材料是二十個已知棉種的葉片，分別編號1-20，來自于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所，見下表:
【權(quán)利要求】
1.棉花葉綠體基因組中的轉(zhuǎn)運RNAT和L的基因間區(qū)trnT-trnL以及轉(zhuǎn)運RNA H和編碼Dl蛋白質(zhì)的psbA基因的基因間區(qū)trnH-psbA的序列組合trnT-trnL+trnH-psbA作為棉屬DNA條形碼。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，使用引物對擴增棉花DNA，其中，上游引物TLF的核苷酸序列為:CGATGACCATCGCATTACAAAT，下游引物TLR的核苷酸序列為:GGCTCAATCCAATTAAGTCCGTA。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，使用引物對擴增棉花DNA，其中，上游引物HAF的核苷酸序列為:CCCCTACAATTACTATACTCTAT，下游引物HAR的核苷酸序列為:GACTTTGGTTTTAGTGTATACGA。
4.一種鑒定棉種的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟: O設(shè)計通用引物，對已有棉種進行有效擴增，所述通用引物對包括TL和HA，對于trnT-trnL,上游引物TLF的核苷酸序列為:CGATGACCATCGCATTACAAAT，下游引物TLR的核苷酸序列為:GGCTCAATCCAATTAAGTCCGTA，對于trnH-psbA，上游引物HAF的核苷酸序列為:CCCCTACAATTACTATACTCTAT，下游引物 HAR 的核苷酸序列為:GACTTTGGTTTTAGTGTATACGA ； 2)提取目的棉種的棉花總DNA； 3)PCR擴增，利用步驟I)的通用引物對目的棉種的棉花總DNA進行降落PCR擴增； 4)PCR產(chǎn)物檢測及克隆測序； 5)序列比對，參照條形碼序列，去除測得序列的兩端非目的片段序列，與DNA條形碼進行比對，以確定棉種。
【文檔編號】C12N15/11GK103468672SQ201310198602
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年5月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月26日
【發(fā)明者】馮坤, 王坤波, 劉方, 華金平, 周忠麗, 王春英, 王玉紅, 蔡小彥, 王星星, 尚明照 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所