含有突變的lpdA基因的大腸桿菌及其應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及通過(guò)遺傳工程改造大腸桿菌的領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明提供了一種含有突變的lpdA基因的大腸桿菌。本發(fā)明還涉及使用所述大腸桿菌用于生產(chǎn)如乙醇和丁二酸等化工原料的用途。本發(fā)明還提供了使用所述大腸桿菌生產(chǎn)乙醇和丁二酸等化工原料的方法，以及通過(guò)引入突變的lpdA基因而提高大腸桿菌中丙酮酸脫氫酶活性的方法。
【專(zhuān)利說(shuō)明】含有突變的IpdA基因的大腸桿菌及其應(yīng)用發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及通過(guò)遺傳工程改造大腸桿菌的領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明提供了一種含有突變的IpdA基因的重組大腸桿菌。本發(fā)明還涉及使用所述大腸桿菌用于生產(chǎn)如乙醇、丁二酸、丁醇和1，3-丙二醇等化工原料的用途。本發(fā)明還提供了使用所述大腸桿菌生產(chǎn)乙醇和丁二酸等化工原料的方法，以及通過(guò)引入突變的IpdA基因而提高大腸桿菌中丙酮酸脫氫酶活性的方法。
[0002]發(fā)明背景
[0003]微生物發(fā)酵法生產(chǎn)化工原料(如乙醇、丁二酸等)近來(lái)取得了很大的進(jìn)展。與傳統(tǒng)的化學(xué)方法相比，微生物發(fā)酵法具有很多優(yōu)勢(shì)，例如高生產(chǎn)率、低成本、以及利用可再生的原料而非石油化工產(chǎn)品等。
[0004]在微生物發(fā)酵生產(chǎn)中，大腸桿菌(E.coli)由于其遺傳背景清楚、易操作、易調(diào)控、易培養(yǎng)、生長(zhǎng)迅速等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于研究以獲得高產(chǎn)菌株。大腸桿菌在缺氧條件下，通常消耗糖或其衍生物，并發(fā)酵產(chǎn)生甲酸、乙酸、乳酸、丁二酸、乙醇等產(chǎn)物。野生型大腸桿菌生產(chǎn)乙醇和丁二酸等的產(chǎn)率通常較低。近年來(lái)的研究表明，對(duì)大腸桿菌的代謝途徑中所涉及的酶進(jìn)行遺傳改造，可以獲得相應(yīng)的高產(chǎn)菌株。
[0005]丙酮酸脫氫酶復(fù)合物(TOH)在大腸桿菌代謝途徑中發(fā)揮重要的作用。丙酮酸脫氫酶是三個(gè)酶的復(fù)合物，催化丙酮酸不可逆氧化脫羧轉(zhuǎn)化成乙酰輔酶A(acetyl-C0A)，同時(shí)將NAD+還原為NADH。乙酰輔酶A可繼而被用于檸檬酸循環(huán)以進(jìn)行細(xì)胞呼吸作用(cellular respirat1n)。 丙酮酸脫氫酶復(fù)合物將糖酵解代謝途徑與檸檬酸循環(huán)聯(lián)系起來(lái)。丙酮酸脫羧也稱(chēng)作“丙酮酸脫氫反應(yīng)”，因?yàn)槠渲幸采婕傲吮岬难趸?Hansen etal.，1996B1chim B1phys Actal22:355 - 358;Bisswanger1981J B1l Chem256:815 -822;Quail et al.，1994J Mol Microb1ll2:95_104)。
[0006]在微生物厭氧發(fā)酵過(guò)程中，NAD和NADH是維持氧化還原反應(yīng)的重要輔因子，其中NAD是重要的電子受體，而NADH則是電子傳遞過(guò)程中重要的輔因子，它決定著反應(yīng)過(guò)程中還原力的供給(Garrigues et al., 1997J Bacter1l 179:5282 - 5287;Cassey etal., 1998FEMS Microb1l Lettl59:325-329)。在糖酵解過(guò)程中一分子葡萄糖產(chǎn)生兩分子的NADH，而丙酮酸脫羧過(guò)程中，一分子葡萄糖可以產(chǎn)生兩分子的乙酰輔酶A，并且伴隨四分子的NADH產(chǎn)生(glucose — 2acety1-CoA — 4NADH),這相對(duì)于丙酮酸轉(zhuǎn)化為甲酸的過(guò)程多產(chǎn)生了兩分子的NADH，增加了還原力的供給，所以提高丙酮酸脫羧反應(yīng)中丙酮酸脫氫酶(PDH)的活力，對(duì)提高代謝過(guò)程中的還原力供給有很重要的意義。
[0007]PDH作為連接糖酵解和三羧酸循環(huán)(TCA)的重要酶，其在好氧條件下酶活較高，但在厭氧條件下酶活很低。PDH復(fù)合物所催化生成的產(chǎn)物乙酰輔酶A與NADH，能夠抑制丙酮酸脫氫酶復(fù)合物的作用能力。NADH是用于微生物生物合成的重要的還原力來(lái)源，但是高濃度的NADH卻會(huì)抑制丙酮酸脫氫酶復(fù)合物的活性，成為代謝路徑中關(guān)鍵的限速酶。Kim(Kimet al., 2008J Bacter1ll90:3851 - 3858)篩選得到了 I3DH復(fù)合體中的二氫硫辛酰胺脫氫酶(LPD)突變株E354K (IpdlOl)使PDH在無(wú)氧條件下對(duì)NADH抑制的敏感性顯著下降，提高了利用該途徑生產(chǎn)乙醇的能力。Zhou (Zhou et al., 2008B1technol Lett30:335-342)等的研究也表明，Ipd突變的引入和對(duì)aceEF基因調(diào)控提高了丙酮酸脫氫酶(TOH)的活性，提高發(fā)酵過(guò)程中菌株的生長(zhǎng)及產(chǎn)量。
[0008]為了提高大腸桿菌生產(chǎn)化工原料的產(chǎn)量和/或轉(zhuǎn)化率，需要進(jìn)一步對(duì)大腸桿菌的代謝途徑進(jìn)行改造。
[0009]發(fā)明概述
[0010]一方面，本發(fā)明提供了一種經(jīng)工程化的重組大腸桿菌。
[0011]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種重組大腸桿菌，其中所述大腸桿菌含有突變的IpdA基因，其所編碼的多肽在對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0.:1所示氨基酸序列如下位置的一個(gè)或多個(gè)位置上含有修飾:T81、P275和A358，對(duì)應(yīng)的位置是通過(guò)與SEQ ID N0.:1進(jìn)行序列比對(duì)而確定的，其中在對(duì)應(yīng)于T81的位置上的修飾是用I置換T，在對(duì)應(yīng)于P275的位置上的修飾是用S置換P，以及在對(duì)應(yīng)于A358的位置上的修飾是用V置換A。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述大腸桿菌中所述突變的IpdA基因的表達(dá)增強(qiáng)、和/或所述突變的IpdA基因所編碼的蛋白質(zhì)的活性增強(qiáng)。
[0012]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種大腸桿菌，其中含有突變的IpdA基因，其中所述突變的IpdA基因在對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0.: 2所示核苷酸序列如下位置的一個(gè)或多個(gè)位置上含有突變:C242、C823和C1073，對(duì)應(yīng)的位置是通過(guò)與SEQ ID N0.:2進(jìn)行序列比對(duì)而確定的，并且其中所述突變均是用T置換C。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述大腸桿菌中所述突變的IpdA基因的表達(dá)增強(qiáng)、和/或所述突變的IpdA基因所編碼的蛋白質(zhì)的活性增強(qiáng)。
[0013]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種大腸桿菌，其中含有突變的IpdA基因，其中所述突變的IpdA基因所編碼的多肽在對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0.:1所示氨基酸序列的A358的位置上含有修飾，并且在對(duì)應(yīng)于A358的位置上的修飾是用V置換A。
[0014]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種大腸桿菌，其中含有突變的IpdA基因，其中所述突變的IpdA基因在對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0.: 2所示核苷酸序列的C1073的位置上含有突變，并且其中所述突變是用T置換C。
[0015]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種大腸桿菌，其中含有突變的IpdA基因，其中所述突變的IpdA基因所編碼的多肽在對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0.:1所示氨基酸序列的T81、P275和A358的位置上都含有修飾，其中在對(duì)應(yīng)于T81的位置上的修飾是用I置換T，在對(duì)應(yīng)于P275的位置上的修飾是用S置換P，以及在對(duì)應(yīng)于A358的位置上的修飾是用V置換A。
[0016]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種大腸桿菌，其中含有突變的IpdA基因，其中所述突變的IpdA基因在對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0.: 2所示核苷酸序列的C242、C823和C1073的位置上都含有突變，并且其中所述突變均是用T置換C。
[0017]在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的大腸桿菌中所含有的突變的IpdA基因的活性增強(qiáng)。
[0018]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的大腸桿菌中含有突變的IpdA基因，并且所述突變的IpdA基因位于質(zhì)粒中或者整合至染色體中。
[0019]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的大腸桿菌還含有如下的修飾:磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTS)中所涉及的基因表達(dá)的抑制、和/或磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTS)中所涉及的基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的抑制；pflB和/或adhE基因表達(dá)的抑制、和/或PflB和/或adhE基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的抑制；ldhA基因表達(dá)的抑制、和/或IdhA基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的抑制；galP基因和/或外源gif基因表達(dá)的增強(qiáng)、和/或galP基因和/或外源glf基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的增強(qiáng)；和pck基因表達(dá)的增強(qiáng)、和/或Pck基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的增強(qiáng)。
[0020]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的大腸桿菌中磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTS)所涉及的基因表達(dá)的抑制、和/或磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTS)中所涉及的基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的抑制，其中所述基因是選自如下的一或多種基因:編碼PTS系統(tǒng)酶I的基因ptsl、編碼PTS系統(tǒng)酶Hpr的基因ptsH、編碼PTS系統(tǒng)酶IIAele的基因err和編碼PTS系統(tǒng)酶IICBae的基因ptsG。
[0021]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的大腸桿菌還含有如下的修飾:pflB基因表達(dá)的抑制、和/或PflB基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的抑制；IdhA基因表達(dá)的抑制、和/或IdhA基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的抑制；和frdABCD基因簇表達(dá)的抑制、和/或frdABCD基因簇所編碼的蛋白質(zhì)活性的抑制。
[0022]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的大腸桿菌還含有如下的修飾aceEF基因簇表達(dá)的增強(qiáng)、和/或aceEF基因簇所編碼的蛋白質(zhì)活性的增強(qiáng)。
[0023]在第二方面，本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)化工原料的方法，其中包括培養(yǎng)本發(fā)明的大腸桿菌的步驟。
[0024]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)乙醇、丁二酸、丁醇和/或1，3-丙二醇的方法，其中包括培養(yǎng)本發(fā)明的大腸桿菌的步驟。
[0025]在第三方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的大腸桿菌在生產(chǎn)化工原料中的用途。
[0026]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及本發(fā)明的大腸桿菌在生產(chǎn)乙醇、丁二酸、丁醇和/或1,3-丙二醇中的用途。
[0027]附圖簡(jiǎn)述
[0028]圖1:㈧IpdA基因及IpdA突變基因的PDH酶活性分析；(B) IpdA基因及IpdA突變基因受NADH/NAD抑制的分析。
[0029]圖2:使用RBS文庫(kù)調(diào)控JC-007的IpdA*基因獲得的突變庫(kù)中隨機(jī)挑選的10個(gè)克隆厭氧發(fā)酵。(A)乙醇的產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率；(B)丙酮酸脫氫酶活性。
[0030]圖3:使用RBS文庫(kù)調(diào)控JC-015的aceEF基因獲得的突變庫(kù)中隨機(jī)挑選的10個(gè)克隆厭氧發(fā)酵。(A)乙醇的產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率；(B)丙酮酸脫氫酶活性。
[0031]圖4: (A)野生型IpdA基因以及突變的IpdA基因(IpdA*)的核苷酸序列比對(duì)；(B)野生型以及突變的IpdA基因(IpdA*)所編碼的多肽的氨基酸序列比對(duì)
[0032]發(fā)明詳述
[0033]除非另有說(shuō)明，所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)都具有本領(lǐng)域所知的常見(jiàn)含義。所有專(zhuān)利、專(zhuān)利申請(qǐng)、公開(kāi)出版物、序列、以及其他公開(kāi)材料均援引加入本文，除非另有說(shuō)明。
[0034]一方面，本發(fā)明提供了一種重組大腸桿菌，其中含有突變的IpdA基因
[0035]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“經(jīng)工程化的重組大腸桿菌”、“工程化的大腸桿菌”和“重組大腸桿菌”可互換使用，均是指經(jīng)過(guò)遺傳改造的大腸桿菌，其中所述的遺傳改造可以是，例如，基因表達(dá)的增強(qiáng)、基因表達(dá)的抑制、引入新的基因、引入突變的基因或者對(duì)基因進(jìn)行突變等，其中可以通過(guò)本領(lǐng)域常規(guī)的技術(shù)手段實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)的增強(qiáng)或基因表達(dá)的抑制，例如基因的敲除、改變基因的拷貝數(shù)、引入質(zhì)粒、改變基因的啟動(dòng)子(例如使用強(qiáng)啟動(dòng)子或弱啟動(dòng)子)
坐寸O
[0036]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種重組的大腸桿菌，其中含有突變的IpdA基因，其所編碼的多肽在對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0.:1所示氨基酸序列如下位置的一個(gè)或多個(gè)位置上含有修飾:T81、P275和Α358，對(duì)應(yīng)的位置是通過(guò)與SEQ ID N0.:1進(jìn)行序列比對(duì)而確定的。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述大腸桿菌中所述突變的IpdA基因的表達(dá)增強(qiáng)、和/或所述突變的IpdA基因所編碼的蛋白質(zhì)的活性增強(qiáng)。
[0037]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種重組的大腸桿菌，其中含有突變的IpdA基因，其所編碼的多肽在對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0.:1所示氨基酸序列如下位置的一個(gè)或多個(gè)位置上含有修飾:Τ81、Ρ275和Α358，對(duì)應(yīng)的位置是通過(guò)與SEQ ID N0.:1進(jìn)行序列比對(duì)而確定的，并且其中在對(duì)應(yīng)于Τ81的位置上的修飾是用I置換Τ，在對(duì)應(yīng)于Ρ275的位置上的修飾是用S置換P，以及在對(duì)應(yīng)于Α358的位置上的修飾是用V置換Α。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述大腸桿菌中所述突變的IpdA基因的表達(dá)增強(qiáng)、和/或所述突變的IpdA基因所編碼的蛋白質(zhì)的活性增強(qiáng)。
[0038]術(shù)語(yǔ)“突變”具有本領(lǐng)域內(nèi)常用的含義，是指在核苷酸序列中插入、添加、缺失、或者取代一或多個(gè)核苷酸，或者是指在多肽序列中插入、添加、缺失、或者取代一或多個(gè)氨基酸。
[0039]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種大腸桿菌，其中含有突變的IpdA基因，其中所述突變的IpdA基因在對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0.: 2所示核苷酸序列如下位置的一個(gè)或多個(gè)位置上含有突變:C242、C823和C1073，對(duì)應(yīng)的位置是通過(guò)與SEQ ID N0.: 2進(jìn)行序列比對(duì)而確定的。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述大腸桿菌中所述突變的IpdA基因的表達(dá)增強(qiáng)、和/或所述突變的IpdA基因所編碼的蛋白質(zhì)的活性增強(qiáng)。
[0040]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種大腸桿菌，其中含有突變的IpdA基因，其中所述突變的IpdA基因在對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0.: 2所示核苷酸序列如下位置的一個(gè)或多個(gè)位置上含有突變:C242、C823和C1073，對(duì)應(yīng)的位置是通過(guò)與SEQ ID N0.:2進(jìn)行序列比對(duì)而確定的，并且其中所述突變均是用T置換C。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述大腸桿菌中所述突變的IpdA基因的表達(dá)增強(qiáng)、和/或所述突變的IpdA基因所編碼的蛋白質(zhì)的活性增強(qiáng)。
[0041]IpdA 基因(Genbank ACA79157.1)是編碼硫辛酰胺脫氫酶(EC No: 1.8.1.4)的基因。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所使用的初始大腸桿菌菌株中的野生型IpdA基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.:2所示，其所編碼的多肽的氨基酸序列如SEQ ID N0.:1所示。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的大腸桿菌中所包含的突變的IpdA基因含有對(duì)應(yīng)于如下突變的一或多種突變:C242T、C823T、和C1073T(參見(jiàn)圖4A);而所述突變的IpdA基因所編碼的多肽具有對(duì)應(yīng)于如下突變的一或多種氨基酸置換:T811、P275S、和A358V(參見(jiàn)圖4B)。
[0042]本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)意識(shí)到不同大腸桿菌菌株的IpdA基因序列可能與SEQ IDN0.:2所示IpdA基因序列不完全等同，以及不同大腸桿菌菌株的IpdA基因所編碼的多肽序列可能與SEQ ID N0.:1所示的多肽序列不完全等同。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，所述突變的IpdA基因中的突變位于對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0.:2的第C242位、第823位、和/或第1073位的位置上。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，所述突變的IpdA基因所編碼的多肽中的置換位于對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0.:1的第81位、第275位、和/或第358位的位置上。
[0043]在本發(fā)明中，“對(duì)應(yīng)于” SEQ ID N0.:1或SEQ ID N0.:2中某一特定位置的位置可以通過(guò)序列比對(duì)而確定，包括如使用人工排列對(duì)比及通過(guò)使用眾多可利用的排列對(duì)比程序(例如BLASTP)以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它方法。通過(guò)對(duì)比多肽或核苷酸序列，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在適當(dāng)?shù)奈恢靡胂鄳?yīng)的突變，從而實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)效果。另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員也可以使用保守和類(lèi)似的氨基酸殘基來(lái)置換相應(yīng)位置上的氨基酸殘基，或者在IpdA基因序列中引入同義突變，而實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)效果。
[0044]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種大腸桿菌，其中含有突變的IpdA基因，其中所述突變的IpdA基因所編碼的多肽在對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0.:1所示氨基酸序列的A358的位置上含有修飾。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種大腸桿菌，其中含有突變的IpdA基因，其中所述突變的IpdA基因所編碼的多肽在對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0.:1所示氨基酸序列的A358的位置上含有修飾，并且在對(duì)應(yīng)于A358的位置上的修飾是用V置換A。
[0045]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種大腸桿菌，其中含有突變的IpdA基因，其中所述突變的IpdA基因在對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0.: 2所示核苷酸序列的C1073的位置上含有突變。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種大腸桿菌，其中含有突變的IpdA基因，其中所述突變的IpdA基因在對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0.: 2所示核苷酸序列的C1073的位置上含有突變，并且其中所述突變是用T置換C。
[0046]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種大腸桿菌，其中含有突變的IpdA基因，其中所述突變的IpdA基因所編碼的多肽在對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0.:1所示氨基酸序列的T81、P275和A358的位置上都含有修飾。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種大腸桿菌，其中含有突變的IpdA基因，其中所述突變的IpdA基因所編碼的多肽在對(duì)應(yīng)于SEQID N0.:1所示氨基酸序列的T81、P275和A358的位置上都含有修飾，并且其中在對(duì)應(yīng)于T81的位置上的修飾是用I置換T，在對(duì)應(yīng)于P275的位置上的修飾是用S置換P，以及在對(duì)應(yīng)于A358的位置上的修飾是用V置換A。
[0047]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種大腸桿菌，其中含有突變的IpdA基因，其中所述突變的IpdA基因在對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0.: 2所示核苷酸序列的C242、C823和C1073的位置上都含有突變。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種大腸桿菌，其中含有突變的IpdA基因，其中所述突變的IpdA基因在對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0.:2所示核苷酸序列的C242、C823和C1073的位置上都含有突變，并且其中所述突變均是用T置換C。
[0048]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述大腸桿菌中所述突變的IpdA基因的表達(dá)增強(qiáng)、和/或所述突變的IpdA基因所編碼的蛋白質(zhì)的活性增強(qiáng)。
[0049]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“基因表達(dá)增強(qiáng)”，其具有本領(lǐng)域內(nèi)熟知的含義，是指基因表達(dá)強(qiáng)度的增強(qiáng)，并導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)生的mRNA數(shù)量的增加?；虮磉_(dá)增強(qiáng)可以通過(guò)如下方式實(shí)現(xiàn)，例如但不限于:在基因前引入強(qiáng)啟動(dòng)子、增加基因的拷貝數(shù)、或者增強(qiáng)mRNA的穩(wěn)定性等。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“基因所編碼的蛋白活性增強(qiáng)”具有本領(lǐng)域內(nèi)熟知的含義，是指基因轉(zhuǎn)錄翻譯后產(chǎn)生的蛋白活性的增加。其可以例如通過(guò)基因表達(dá)強(qiáng)度的增強(qiáng)、增加酶在細(xì)胞中的含量、氨基酸位點(diǎn)的突變來(lái)實(shí)現(xiàn)。實(shí)現(xiàn)“基因的表達(dá)增強(qiáng)”以及“基因所編碼的蛋白質(zhì)的活性增強(qiáng)”的各種技術(shù)手段是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。
[0050]在本發(fā)明中，基因表達(dá)增強(qiáng)可以例如通過(guò)引入強(qiáng)啟動(dòng)子來(lái)實(shí)現(xiàn)。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，使用的強(qiáng)啟動(dòng)子例如是:Ppck*(SEQ ID N0.:5) (Zhang et al., 2009b, ApplEnviron Microb1l75:7807-7813)或 M1_93(SEQ ID N0.:6) (Lu et al.，2012，ApplMicrob1l B1technol93:2455-2426)。
[0051]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的大腸桿菌中含有突變的IpdA基因，并且所述突變的IpdA基因位于質(zhì)粒中或者染色體中。
[0052]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的大腸桿菌中含有突變的IpdA基因，并且所述突變的IpdA基因位于染色體中。
[0053]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的大腸桿菌中含有突變的IpdA基因，并且所述突變的IpdA基因位于質(zhì)粒中。
[0054]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“質(zhì)粒”具有本領(lǐng)域熟知的定義，其是以附加體形式存在于細(xì)胞中的非染色體DNA并且能夠自主復(fù)制的DNA分子。本發(fā)明中可以使用的質(zhì)粒例如有:pEASY-Blunt、pACYC184、pTrc99A、pTrc99A_M、pTrc99A-M_Kan、pKD4 和 pKD46 等。
[0055]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“染色體”具有本領(lǐng)域熟知的定義。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明所涉及的經(jīng)修飾的基因位于染色體中。將經(jīng)修飾的基因整合至染色體的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，例如可以參見(jiàn) Michael R.Green 和 Joseph Sambrook 的〃Molecular Cloning:ALaboratory Manual〃(Fourth Edit1n)。
[0056]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的大腸桿菌還含有選自如下的一或多種修飾:磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTS)所涉及的基因表達(dá)的抑制、和/或磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTS)所涉及的基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的抑制；pflB和/或adhE基因表達(dá)的抑制、和/或 PflB或adhE基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的抑制；ldhA基因表達(dá)的抑制、和/或IdhA基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的抑制；galP基因和/或外源glf基因表達(dá)的增強(qiáng)、和/或galP基因或外源glf基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的增強(qiáng)；和pck基因表達(dá)的增強(qiáng)、和/或Pck基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的增強(qiáng)。
[0057]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的大腸桿菌中磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTS)所涉及的基因表達(dá)的抑制、和/或磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTS)中所涉及的基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的抑制，其中所述基因是選自如下的一或多種基因:編碼PTS系統(tǒng)酶I的基因ptsl、編碼PTS系統(tǒng)酶Hpr的基因ptsH、編碼PTS系統(tǒng)酶IIAele的基因err和編碼PTS系統(tǒng)酶IICBae的基因ptsG。
[0058]在本發(fā)明中，ptsl基因(GenBank No:ACA76928.1、NC_010468.1)編碼一種磷酸轉(zhuǎn)移酶，其被稱(chēng)為磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸轉(zhuǎn)移酶I (EC No:2.7.3.9)0 ptsH基因(GenBank No:ACA76929.1)編碼磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸轉(zhuǎn)移酶Hpr (EC No:2.7.1.69)。err基因(GenBank No:ACA76927.1)編碼磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸轉(zhuǎn)移酶IIAGlc (ECNo:2.7.1.69)。ptsG基因(GenBank No:ACA78131.1)編碼磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸轉(zhuǎn)移酶 IICBGlc (EC No: 2.7.1.69)。
[0059]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的大腸桿菌還含有選自如下的一或多種修飾:ptsl基因表達(dá)的抑制、和/或PtsI基因所編碼的蛋白質(zhì)的活性抑制；pf IB和/或adhE基因表達(dá)的抑制、和/或PflB和/或adhE基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的抑制；ldhA基因表達(dá)的抑制、和/或IdhA基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的抑制；galP基因和/或外源glf基因表達(dá)的增強(qiáng)、和/或galP基因和/或外源glf基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的增強(qiáng)；和pck基因表達(dá)的增強(qiáng)、和/或pck基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的增強(qiáng)。
[0060]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的大腸桿菌還含有選自如下的一或多種修飾:ptsl基因表達(dá)的抑制、和/或PtsI基因所編碼的蛋白質(zhì)的活性抑制；pflB和/或adhE基因表達(dá)的抑制、和/或PflB和/或adhE基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的抑制；ldhA基因表達(dá)的抑制、和/或IdhA基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的抑制；galP基因表達(dá)的增強(qiáng)、和/或galP基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的增強(qiáng)jPpck基因表達(dá)的增強(qiáng)、和/或pck基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的增強(qiáng)。
[0061]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的大腸桿菌還含有選自如下的一或多種修飾:ptsl基因表達(dá)的抑制、和/或PtsI基因所編碼的蛋白質(zhì)的活性抑制；pflB基因表達(dá)的抑制、和/或PflB所編碼的蛋白質(zhì)活性的抑制；ldhA基因表達(dá)的抑制、和/或IdhA基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的抑制；galP基因表達(dá)的增強(qiáng)、和/或galP基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的增強(qiáng)；和pck基因表達(dá)的增強(qiáng)、和/或pck基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的增強(qiáng)。
[0062]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的大腸桿菌還含有選自如下修飾:ptsl基因表達(dá)的抑制、和/或ptsl基因所編碼的蛋白質(zhì)的活性抑制；pflB基因表達(dá)的抑制、和/或pflB所編碼的蛋白質(zhì)活性的抑制；ldhA基因表達(dá)的抑制、和/或IdhA基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的抑制；galP基因表達(dá)的增強(qiáng)、和/或galP基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的增強(qiáng)；和pck基因表達(dá)的增強(qiáng)、和/或Pck基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的增強(qiáng)。
[0063]在本發(fā)明中，pflB基因(GenBank No: ACA78322.1)編碼丙酮酸甲酸裂解酶(Pyruvate formate lyase)(EC No:2.3.1.54)。adhE 基因(Genbank No:ACA78022.1)編碼乙醇 / 乙醒脫氫酶(Alcohol/acetaldehyde dehydrogenase) (EC No: 1.1.1.1, ECNo: 1.2.1.10)。IdhA 基因(GenBank No:ACA77176.1)編碼乳酸脫氫酶 A(lactatedehydrogenase A) (EC No: 1.1.1.28)。galP 基因(GenBank No:ACA76443.1)編碼半乳糖MFS轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。glf基因(GenBa nk No:AAA27691.1)編碼葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Glf (glucosefacilitator protein)。pck 基因(GenBank No:ACA75988.1)編碼憐酸烯醇式丙酮酸羧化激酶，又稱(chēng)作 PCK 酶(EC No:4.1.1.49)。
[0064]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“基因表達(dá)的抑制”具有本領(lǐng)域內(nèi)熟知的含義，是指基因表達(dá)強(qiáng)度的降低，從而導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)生的mRNA數(shù)量的減少?；虮磉_(dá)的抑制可以通過(guò)如下方式實(shí)現(xiàn)，例如但不限于:基因的敲除、減少基因的拷貝數(shù)、改變基因的啟動(dòng)子(例如使用弱啟動(dòng)子)等。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“基因所編碼的蛋白質(zhì)的活性抑制”具有本領(lǐng)域內(nèi)熟知的含義，是指基因轉(zhuǎn)錄翻譯后產(chǎn)生的蛋白活性的降低。其可以例如通過(guò)基因表達(dá)強(qiáng)度的降低、基因中核苷酸的插入或缺失、氨基酸位點(diǎn)的突變來(lái)實(shí)現(xiàn)。實(shí)現(xiàn)“基因表達(dá)的抑制”以及“基因所編碼的蛋白質(zhì)的活性抑制”的各種技術(shù)手段是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。
[0065]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的大腸桿菌還含有如下的修飾:frdABCD基因簇表達(dá)的抑制、和/或frdABCD基因簇所編碼的蛋白質(zhì)活性的抑制。
[0066]frdABCD基因簇編碼富馬酸還原酶(EC No: 1.3.5.4),包括frdA基因(GenBankNo:ACA79460.1)編碼富馬酸還原酶黃素蛋白亞基、frdB基因(GenBank No:ACA79461.1)編碼富馬酸還原酶黃素蛋白亞基、frdC基因(GenBank No:ACA79462.1)編碼富馬酸還原酶C亞基、和frdD基因(GenBank No:ACA79463.1)編碼富馬酸還原酶D亞基。
[0067]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的大腸桿菌還含有如下的一或多種修飾:pflB基因表達(dá)的抑制、和/或Pf IB基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的抑制；IdhA基因表達(dá)的抑制、和/或IdhA基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的抑制；和frdABCD基因簇表達(dá)的抑制、和/或frdABCD基因簇所編碼的蛋白質(zhì)活性的抑制。
[0068]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的大腸桿菌還含有如下修飾:pflB基因表達(dá)的抑制、和/或PflB基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的抑制；ldhA基因表達(dá)的抑制、和/或IdhA基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的抑制；和frdABCD基因簇表達(dá)的抑制、和/或frdABCD基因簇所編碼的蛋白質(zhì)活性的抑制。
[0069]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的大腸桿菌還含有如下的修飾:aceEF基因簇表達(dá)的增強(qiáng)、和/或aceEF基因簇所編碼的蛋白質(zhì)活性的增強(qiáng)。
[0070]aceEF基因簇編碼丙酮酸復(fù)合體E1/E2，包括aceE基因(GenBank No:ACA79159.1)編碼丙酮酸脫氫酶復(fù)合體El (EC No: 1.2.4.1)和aceF基因(GenBank No:ACA79158.1)編碼丙酮酸脫氫酶復(fù)合體E2。
[0071]本發(fā)明中，增強(qiáng)的方法包括RBS文庫(kù)調(diào)控:用核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS，ribosomebinding site)文庫(kù)序列(核昔酸由隨機(jī)喊基組成)提聞基因的表達(dá)水平的策略。
[0072]在第二方面，本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)化工原料的方法，其中包括培養(yǎng)本發(fā)明的大腸桿菌的步驟。
[0073]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括培養(yǎng)本發(fā)明的大腸桿菌的，以及任選的分離或純化所得的化工原料。
[0074]本發(fā)明的方法可以用于生產(chǎn)各種可通過(guò)微生物發(fā)酵產(chǎn)生的化工原料，包括但不限于:丁二酸、乙醇、丁醇和1，3-丙二醇等。
[0075]在一個(gè)實(shí)施方案中,本發(fā)明所述的“培養(yǎng)”包括種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)。
[0076]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“種子培養(yǎng)”是指將用于發(fā)酵的菌種在固體培養(yǎng)基上活化后，再經(jīng)過(guò)搖瓶及種子罐逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)而獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的純種的過(guò)程。
[0077]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“發(fā)酵培養(yǎng)”是指利用微生物菌種，在適宜的條件下，將培養(yǎng)基組分經(jīng)過(guò)特定的代謝途徑轉(zhuǎn)化為某些特定產(chǎn)物的過(guò)程。
[0078]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法中包括將本發(fā)明的大腸桿菌厭氧發(fā)酵。
[0079]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“厭氧發(fā)酵”是指利用厭氧發(fā)酵菌株，在隔絕空氣的條件下，經(jīng)特定代謝途徑將培養(yǎng)基組分轉(zhuǎn)化為某些特定產(chǎn)物的過(guò)程。
[0080]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法中的培養(yǎng)過(guò)程不進(jìn)行任何通氣步驟。
[0081]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明中對(duì)大腸桿菌進(jìn)行培養(yǎng)的方法包括以下步驟:
[0082](I)將本發(fā)明的重組大腸桿菌接種于種子培養(yǎng)基，在適宜大腸桿菌生長(zhǎng)的條件下培養(yǎng)一段時(shí)間得到種子液；
[0083](2)將種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，在厭氧條件下培養(yǎng)。
[0084]本發(fā)明的方法中可以使用本領(lǐng)域中常規(guī)用于培養(yǎng)大腸桿菌的各種培養(yǎng)條件，例如培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間和是否搖動(dòng)以及搖動(dòng)速度等。本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)需要可以選擇適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件。本發(fā)明的方法中所使用的培養(yǎng)條件以及發(fā)酵條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的(諸葛健等，1994，工業(yè)微生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)手冊(cè)，中國(guó)輕工業(yè)出版社)。
[0085]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的培養(yǎng)條件包括但不限于:溫度為30_45°C，例如30-31 0C >31-32 °C >32-33 °C >33-34 °C >34-35 °C >35-36 °C >36-37 °C >37-38 °C >38-39 °C、39-40 O、40-410、41-42 O、42-43 O、43-44 O、或 44-45 V。
[0086]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的培養(yǎng)條件包括但不限于:種子培養(yǎng)的時(shí)間為6-16小時(shí),例如6-7小時(shí)、7-8小時(shí)、8-9小時(shí)、9-10小時(shí)、10-11小時(shí)、11-12小時(shí)、12-13小時(shí)、13-14小時(shí)、14-15小時(shí)、或15-16小時(shí)。
[0087]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的培養(yǎng)條件包括但不限于:發(fā)酵培養(yǎng)的時(shí)間為2-5天，例如2天、3天、4天、或5天。
[0088]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的培養(yǎng)條件包括但不限于:將本發(fā)明的重組大腸桿菌按照0.1-10% (V/V)的接種量接種于種子培養(yǎng)基，例如0.1%、0.5%、1%、2.5%、5%、或10%。。
[0089]在一實(shí)施方案中，本發(fā)明的培養(yǎng)條件包括但不限于:將種子液按照終濃度OD550=0.05-0.5 的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，例如 OD55tl 為 0.05-0.1,0.1-0.2,0.2-0.3、0.3-0.4 或 0.4-0.5。
[0090]在一實(shí)施方案中，可以使用常用于大腸桿菌的培養(yǎng)基。用于本發(fā)明的大腸桿菌的培養(yǎng)基可以包括合適的氮源，例如有機(jī)含氮化合物或無(wú)機(jī)含氮化合物或其混合物。在一實(shí)施方案中，所述有機(jī)含氮化合物例如選自豆餅粉、花生餅粉、牛肉膏、魚(yú)粉、酵母膏、蛋白胨、玉米漿中的一種或任意幾種的混合物，所述無(wú)機(jī)含氮化合物選自硝酸鹽(如硝酸鈉、硝酸鉀、硝酸鈣)，銨鹽(如磷酸銨、硫酸銨、硝酸銨、氯化銨)中的一種或任意幾種的混合物。在一實(shí)施方案中，用于本發(fā)明的大腸桿菌的培養(yǎng)基可以包括合適的碳源，例如選自葡萄糖、淀粉、淀粉水解糖、果糖、糊精、乳糖、半乳糖、木糖、蔗糖、甘油、麥芽糖、脂肪酸、乙酸、丙酮酸、和富馬酸中的一種或任意幾種的混合物。
[0091]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法中所使用的種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基由以下成分組成(溶劑為水):
[0092]大量元素:葡萄糖、KH2PO4,K2HPO4, (NH4) 2HP04、MgSO4.7H20、和甜菜堿-KCl ；
[0093]微量元素:FeCl3.6H20、CoCl2.6H20、CuCl2.2H20、ZnCl2、Na2MoO4.2H20、MnCl2.4H202、和 H3BO3。
[0094]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的培養(yǎng)基由以下成分組成(溶劑為水):
[0095]大量元素:葡萄糖20-l20g/L，KH2P042-5g/L, K2HP044-8g/L, (NH4) 2HP043-5g/L,MgSO4.7H200.1-0.3g/L、以及甜菜堿-KC10.1-lg/L ；
[0096]微量元素=FeCl3.6H201_5 μ g/L、CoCl2.6H200.05-1 μ g/L、CuCl2.2H200.05-1 μ g/L、ZnCl20.05-1 μ g/L、Na2MoO4.2H200.05-1 μ g/L、MnCl2.4H2020.1 - 1 μ g/L, H3BO30.01-0.5 μ g/L。
[0097]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明中對(duì)大腸桿菌進(jìn)行培養(yǎng)的具體方法如下:
[0098]將菌株厭氧發(fā)酵，包括以下步驟:
[0099](I)種子培養(yǎng):將1/3-1/2體積的種子培養(yǎng)基置于三角瓶中，高溫高壓滅菌。冷卻后將本發(fā)明的重組大腸桿菌按照0.1-10%(V/V)的接種量接種于種子培養(yǎng)基，在37°C以及搖動(dòng)的條件下培養(yǎng)6-16小時(shí)得到種子液，用于發(fā)酵培養(yǎng)基接種；
[0100](2)發(fā)酵培養(yǎng):將1/3-1/2體積的發(fā)酵培養(yǎng)基體積置于厭氧發(fā)酵罐中，將種子液按照終濃度OD55tl=0.05-0.5的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)2_5天，得到發(fā)酵液。
[0101]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明生產(chǎn)化工原料的方法中還包括從發(fā)酵液中收集、提取、分離和/或純化所得的化工原料的步驟。
[0102]在第三方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的大腸桿菌在生產(chǎn)丁二酸中的用途。實(shí)施例
[0103]本發(fā)明通過(guò)下述實(shí)施例進(jìn)一步闡明，但任何實(shí)施例或其組合不應(yīng)當(dāng)理解為對(duì)本發(fā)明的范圍或?qū)嵤┓绞降南拗啤１景l(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求書(shū)限定，結(jié)合本說(shuō)明書(shū)和本領(lǐng)域一般常識(shí)，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以清楚地明白權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。在不偏離本發(fā)明的精神和范圍的前提下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行任何修改或改變，這種修改和改變也包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0104]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0105]實(shí)施例1:菌株HX-024的構(gòu)律
[0106]以野生型大腸桿菌ATCC8739為起始菌株，敲除乳酸脫氫酶基因ldhA，敲除丙酮酸甲酸裂解酶編碼基因Pf 1B，敲除磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸轉(zhuǎn)移酶I基因PtsI，激活半乳糖MFS轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GalP，激活磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶PCK，敲除磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶基因pta和乙酸激酶基因ackA，激活蘋(píng)果酸合成酶AceA和異檸檬酸裂解酶AceB，激活二羧酸Dcu轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白DcuC，得到菌株NZ-037。
[0107]再將NZ-037經(jīng)過(guò)1080代進(jìn)化后獲得菌株HX021。
[0108]從重組大腸桿菌菌株HX021出發(fā)，敲除mgsA基因(GenBank N0.ACA78263.1)，獲得重組大腸桿菌HX023。
[0109]HX023經(jīng)過(guò)360代進(jìn)化后獲得菌株HX024。HX024以保藏號(hào)CGMCC 7259 (2013年2月25日，分類(lèi)命名:大腸埃希氏菌E.coli)保藏于CGMCC (北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中科院微生物所)。具體構(gòu)建過(guò)程可以參見(jiàn)發(fā)明人于同日提交的題目為“生產(chǎn)丁二酸的重組大腸桿菌及其應(yīng)用”的專(zhuān)利申請(qǐng)說(shuō)明書(shū)。
[0110]實(shí)施例2:lpdA及IpdA突奪某閔克降于DTrc99A-M
[0111](I)質(zhì)粒PXZ163和pXZ174的構(gòu)建(其中所含有的IpdA基因分別來(lái)自于 E.coli ATCC 8739 (Gunsalus et al.，1941，J B1l ChemHl: 853-858)和菌株HX-024(CGMCC7259):
[0112]以E.coli ATCC8739 和 HX-024 的基因組 DNA 為模板，用引物對(duì) 8739-lpdA-up-SacI/8739-lpdA-down-PstI (SEQ ID N0.:7/SEQ ID N0.:8)分別進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增；用限制性?xún)?nèi)切酶SacI和PstI I (NEB, UK)在37°C酶切30分鐘，用相同的限制性?xún)?nèi)切酶處理pTrc99A_M質(zhì)粒(Shi et al., 2013, Metab Engl6:1-10),用 PCR 純化試劑盒清洗(Gel/PCR Extrat1nKU，購(gòu)自B1MIGA生物技術(shù)有限公司);克隆體系:取50ng目標(biāo)片段，20ng載體pTrc99A_M片段，加入2 μ 110ΧΤ4連接緩沖液(NEB公司)、I μ I Τ4多核苷酸激酶(NEB公司)，補(bǔ)充蒸餾水至 20μ 1，37°C反應(yīng)30分鐘；加入1μ I Τ4連接酶(NEB公司，400，000粘附末端單位/ml)，室溫反應(yīng)2小時(shí)得到連接產(chǎn)物；氯化鈣熱轉(zhuǎn)化法:取5μ I連接產(chǎn)物加入50 μ ITransl-Tl感受態(tài)細(xì)胞(購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司)中，冰浴30分鐘。42°C熱激30秒，立即置于冰上2分鐘。加入250μ1 LB培養(yǎng)基，200rpm，37°C孵育I小時(shí)。取200 μ I菌液涂在含有卡那霉素(終濃度為50 μ g/ml)的LB平板上，過(guò)夜培養(yǎng)后，挑選5個(gè)陽(yáng)性單菌落，進(jìn)行菌落 PCR 驗(yàn)證，引物為 pTrc99A-F/pTrc99A-R(SEQ ID N0.: 17/SEQ ID N0.: 18) ?送樣測(cè)序分析，結(jié)果正確的為陽(yáng)性克隆，得到質(zhì)粒PXZ163和pXZ174(表3)。
[0113](2)質(zhì)粒pXZ165(含有IpdA所編碼的多肽中的單突變E354K)、pXZ173(含有IpdA所編碼的多肽中的單突變T81I)、pXZ178(含有IpdA所編碼的多肽中的單突變P275S)和PXZ179 (含有IpdA所編碼的多肽中的單突變A358V)的構(gòu)建:
[0114]以質(zhì)粒pXZ163 的 DNA 為模板，用引物對(duì) 8739-lpdA-E354K-F/8739-lpdA_E354K-R(SEQ ID N0.:9/SEQ ID N0.: 10)，或引物對(duì) 8739-lpdA-T811-F/8739-lpdA_T811-R(SEQ ID N0.:11/SEQ ID N0.:12),或引物對(duì) 8739-lpdA-P275S-F/8739-lpdA_P275S-R(SEQID N0.: 13/SEQ ID N0.: 14)，或引物對(duì) 8739-lpdA-A358V-F/8739-lpdA_A358V-R(SEQ IDN0.: 15/SEQ ID N0.:16)進(jìn)行反向PCR擴(kuò)增；分別得到大小約4kb的片段用限制性?xún)?nèi)切酶DpnI (NEB公司)在37°C處理模板30分鐘，用PCR純化試劑盒清洗(Gel/PCR Extrat1nKU，購(gòu)自B1MIGA生物技術(shù)有限公司)；克隆體系:取30ng純化后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，加入2 μ 110ΧΤ4連接緩沖液(NEB公司)、I μ I Τ4多核苷酸激酶(NEB公司)，補(bǔ)充蒸餾水至20μ 1，37°C反應(yīng)30分鐘；加入I μ I T4連接酶(NEB公司，400，000粘附末端單位/ml)，室溫反應(yīng)2小時(shí)得到連接產(chǎn)物；氯化鈣熱轉(zhuǎn)化法同實(shí)施例2(1)。取200 μ I菌液涂在含有氨芐霉素(終濃度為50μg/ml)的LB平板上，過(guò)夜培養(yǎng)后，挑選2-3個(gè)克隆，送樣進(jìn)行測(cè)序分析，正確的質(zhì)粒命名為PXZ165, pXZ173，pXZ178和pXZ179 (表3)。
[0115](3)質(zhì)粒pXZ180(含有IpdA所編碼的多肽中的雙突變P275S A358V)的構(gòu)建:以質(zhì)粒pXZ178 (含有IpdA所編碼的多肽中的單突變P275S)的DNA為模板，用引物對(duì)8739_lpdA-A358V-F/8739-lpdA-A358V-R(SEQ ID N0.: 15/SEQ ID N0.:16)進(jìn)行反向 PCR 擴(kuò)增，分別得到大小約4kb的片段用限制性?xún)?nèi)切酶DpnI (NEB公司)在37°C處理模板30分鐘，用PCR純化試劑盒清洗(Gel/PCR Extrat1n KU，購(gòu)自B1MIGA生物技術(shù)有限公司)；克隆體系同實(shí)施例2 (2);氯化鈣熱轉(zhuǎn)化法同實(shí)施例2 (I)。加入250 μ I LB培養(yǎng)基，200rpm, 37°C孵育I小時(shí)。取200 μ I菌液涂在含有氨芐霉素(終濃度為50 μ g/ml)的LB平板上，過(guò)夜培養(yǎng)后，挑選2-3個(gè)克隆，送樣進(jìn)行測(cè)序分析，正確的質(zhì)粒命名為PXZ180 (表3)。
[0116]表1.本發(fā)明構(gòu)建的菌株
[0117]
[0118]
【權(quán)利要求】
1.一種重組大腸桿菌，其中所述大腸桿菌還含有突變的IpdA基因，其所編碼的多肽在對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0.:1所示氨基酸序列如下位置的一個(gè)或多個(gè)位置上含有修飾:Τ81、Ρ275和 Α358, 對(duì)應(yīng)的位置是通過(guò)與SEQ ID N0.:1進(jìn)行序列比對(duì)而確定的， 其中在對(duì)應(yīng)于Τ81的位置上的修飾是用I置換Τ，在對(duì)應(yīng)于Ρ275的位置上的修飾是用S置換P，以及在對(duì)應(yīng)于Α358的位置上的修飾是用V置換Α， 任選地，所述大腸桿菌中所述突變的IpdA基因的表達(dá)增強(qiáng)、和/或所述突變的IpdA基因所編碼的蛋白質(zhì)的活性增強(qiáng)。
2.權(quán)利要求1的大腸桿菌，其中所述突變的IpdA基因在對(duì)應(yīng)于SEQID N0.:2所示核苷酸序列如下位置的一個(gè)或多個(gè)位置上含有突變:C242、C823和C1073， 對(duì)應(yīng)的位置是通過(guò)與SEQ ID N0.:2進(jìn)行序列比對(duì)而確定的， 其中所述突變均是用T置換C。
3.權(quán)利要求1的大腸桿菌，其中所述突變的IpdA基因所編碼的多肽在對(duì)應(yīng)于SEQIDN0.:1所示氨基酸序列的A358的位置上含有修飾。
4.權(quán)利要求2的大腸桿菌，其中所述突變的IpdA基因在對(duì)應(yīng)于SEQID N0.:2所示核苷酸序列的C1073的位置上含有突變。
5.權(quán)利要求1的大腸桿菌，其中所述突變的IpdA基因所編碼的多肽在對(duì)應(yīng)于SEQIDN0.:1所示氨基酸序列的T81、P275和A358的位置上都含有修飾。
6.權(quán)利要求2的大腸桿菌，其中所述突變的IpdA基因在對(duì)應(yīng)于SEQID N0.:2所示核苷酸序列的C242、C823和C1073的位置上都含有突變。
7.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的大腸桿菌，其中所述突變的IpdA基因位于質(zhì)粒或染色體中。
8.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的大腸桿菌，其中所述大腸桿菌中還含有如下修飾: 磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTS)中所涉及的基因表達(dá)的抑制、和/或磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTS)中所涉及的基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的抑制；PflB和/或adhE基因表達(dá)的抑制、和/或pflB和/或adhE基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的抑制； IdhA基因表達(dá)的抑制、和/或IdhA基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的抑制；galP基因和/或外源gif基因表達(dá)的增強(qiáng)、和/或galP基因和/或外源gif基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的增強(qiáng)；和 pck基因表達(dá)的增強(qiáng)、和/或pck基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的增強(qiáng)。
9.權(quán)利要求8的大腸桿菌，其中所述磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTS)中所涉及的基因是選自如下的一或多種基因:編碼PTS系統(tǒng)酶I的基因Pts1、編碼PTS系統(tǒng)酶Hpr的基因ptsH、編碼PTS系統(tǒng)酶IIAele的基因err和編碼PTS系統(tǒng)酶IICBele的基因ptsG。
10.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的大腸桿菌，其中所述大腸桿菌還含有如下的遺傳改造: PflB基因表達(dá)的抑制、和/或PflB基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的抑制； IdhA基因表達(dá)的抑制、和/或IdhA基因所編碼的蛋白質(zhì)活性的抑制；和 frdABCD基因簇表達(dá)的抑制、和/或frdABCD基因簇所編碼的蛋白質(zhì)活性的抑制。
11.權(quán)利要求ι-?ο任一項(xiàng)的大腸桿菌，其中所述大腸桿菌還含有如下的遺傳改造:aceEF基因簇表達(dá)的增強(qiáng)、和/或aceEF基因簇所編碼的蛋白質(zhì)活性的增強(qiáng)。
12.生產(chǎn)乙醇和/或丁二酸的方法，所述方法包括培養(yǎng)權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)的大腸桿菌。
13.權(quán)利要求1-11任 一項(xiàng)的大腸桿菌在生產(chǎn)乙醇和/或丁二酸中的用途。
【文檔編號(hào)】C12N1/21GK104178442SQ201310198769
【公開(kāi)日】2014年12月3日 申請(qǐng)日期:2013年5月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月24日
【發(fā)明者】張學(xué)禮, 朱欣娜, 陳晶 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所