一種循環(huán)腫瘤細(xì)胞的富集、分析方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種循環(huán)腫瘤細(xì)胞的富集、分析方法，該方法主要包括：對生物體液樣本進(jìn)行紅細(xì)胞裂解處理；加入與白細(xì)胞、紅細(xì)胞和/或血小板特異性結(jié)合的免疫微珠進(jìn)行孵育；用濾膜過濾細(xì)胞懸液，富集循環(huán)腫瘤細(xì)胞。本發(fā)明對紅細(xì)胞裂解、免疫微珠法和濾膜法富集CTCs方法的綜合及優(yōu)化，從而極大地提高循環(huán)腫瘤細(xì)胞的富集效果，該技術(shù)對白細(xì)胞的去除效率>99.9%，腫瘤細(xì)胞的富集效率>80%。同時(shí)，本發(fā)明還提供一種使用上述循環(huán)腫瘤細(xì)胞的富集方法的試劑盒，以及提供一種用于富集循環(huán)腫瘤細(xì)胞的裝置。本發(fā)明還提供了一種上述富集的循環(huán)腫瘤細(xì)胞的分析方法，通過該方法，可以實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞數(shù)量、基因突變、基因表達(dá)譜等動(dòng)態(tài)變化的分析。
【專利說明】一種循環(huán)腫瘤細(xì)胞的富集、分析方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)，具體的是涉及一種循環(huán)腫瘤細(xì)胞的富集、分析方法。

【背景技術(shù)】
[0002]目前認(rèn)為，腫瘤微轉(zhuǎn)移灶起源于侵入循環(huán)中的腫瘤細(xì)胞，因此，循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells,CTCs)可能是腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的一種標(biāo)志。近年來，隨著分子技術(shù)的發(fā)展，使得分離、計(jì)數(shù)外周血CTCs成為可能。在疾病早期階段，CTCs可能有助于良、惡性腫瘤的鑒別，轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測和判斷。在疾病進(jìn)展期，CTCs或許可以提供重要的預(yù)后信息，以及幫助醫(yī)生監(jiān)測治療效果。而且，CTCs可能反映腫瘤特征，能夠指導(dǎo)治療方案的制定，并且可以作為靶向治療的靶標(biāo)。
[0003]現(xiàn)有的CTCs富集方法通常是基于CTCs的表面標(biāo)志物，如免疫磁性分選法，或CTCs的物理性質(zhì)(密度和大小),如梯度離心法。其中,基于免疫磁珠的CellRearch是一種半自動(dòng)化的CTCs檢測儀器，該方法針對CTCs表面的標(biāo)志物進(jìn)行正向富集，2004年已被美國FDA批準(zhǔn)用于預(yù)測乳腺癌患者的無病生存期和總生存期，但由于CTCs在體內(nèi)生長過程中會出現(xiàn)丟失上皮細(xì)胞黏附因子表面抗原等CTCs表面標(biāo)志物的現(xiàn)象，不能富集該部分CTCs細(xì)胞，在實(shí)際使用的局限性較大。
[0004]密度梯度離心法的具有簡單、廉價(jià)、快速等優(yōu)點(diǎn)，但分離的腫瘤細(xì)胞不純，分離效率不高，有相當(dāng)一部分腫瘤細(xì)胞丟失，在實(shí)際應(yīng)用仍有很大局限。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明目的之一是提供一種富集循環(huán)腫瘤細(xì)胞的方法，該方法可以很好地實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的富集。
[0006]實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下。
[0007]—種循環(huán)腫瘤細(xì)胞的富集方法，主要包括以下步驟:
[0008]I)對生物體液樣本進(jìn)行紅細(xì)胞裂解處理以去除紅細(xì)胞；
[0009]2)加入與白細(xì)胞、紅細(xì)胞和/或血小板特異性結(jié)合的免疫微珠進(jìn)行孵育以去除
[0010]白細(xì)胞、血小板及殘余的紅細(xì)胞。
[0011]在其中一個(gè)實(shí)施例中，還包括步驟:3)將去除白細(xì)胞、紅細(xì)胞后的細(xì)胞懸液在濾膜上進(jìn)行過濾，得到富集循環(huán)腫瘤細(xì)胞的濾膜。
[0012]本發(fā)明中，所述生物體液樣本包括但并不局限于以下來源:人或動(dòng)物的外周循環(huán)血，胸腔積液，腹水，臍帶血，羊水，骨髓，或培養(yǎng)的人或動(dòng)物細(xì)胞。本發(fā)明中，所述免疫微珠由抗體與微珠表面進(jìn)行共價(jià)或非共價(jià)偶聯(lián)而成，所述微珠的直徑介于10納米-100微米，可以為磁性或非磁性，例如具體可以為含有聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、和四氧化三鐵中一種或以上成分的微珠。
[0013]所述的免疫微珠上共價(jià)或非共價(jià)偶聯(lián)有與白細(xì)胞、紅細(xì)胞和/或血小板特異性結(jié)合的抗體，進(jìn)一步地，所述的免疫微珠上偶聯(lián)的抗體選自⑶2、⑶15、⑶16、⑶19、⑶33、⑶41、CD45、CD35、CD235a中的兩種或以上。
[0014]本發(fā)明中，所述濾膜孔徑為5~8um，選自聚碳酸酯濾膜、纖維濾膜、尼龍濾膜、或塑料薄膜。
[0015]本發(fā)明中，使用紅細(xì)胞裂解液對生物體液樣本進(jìn)行紅細(xì)胞裂解處理，所述紅細(xì)胞裂解液包括有以下濃度的組份:0.1M~0.5M氯化銨、0.0OlM~0.2M碳酸氫鉀、0.001~
0.05M乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸二鈉。進(jìn)一步地，所述紅細(xì)胞裂解液包括有以下濃度的組份:0.3M~0.32M氯化銨、0.018M~0.022M碳酸氫鉀、0.003~0.005M乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸二鈉。進(jìn)一步地，還包括有0.01%~0.2%的甲醛。
[0016]本發(fā)明的另一目的是提供一種使用上述循環(huán)腫瘤細(xì)胞的富集方法的試劑盒。
[0017]實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下。
[0018]一種用于富集循環(huán)腫瘤細(xì)胞的試劑盒，其組份主要包括:紅細(xì)胞裂解液，免疫微珠。
[0019]進(jìn)一步地，該試劑盒還可以包括濾膜。
[0020]本發(fā)明中，所述的免疫微珠上共價(jià)或非共價(jià)偶聯(lián)有與白細(xì)胞、紅細(xì)胞和/或血小板特異性結(jié)合的抗體，進(jìn)一步地，所述的免疫微珠上偶聯(lián)的抗體選自⑶2、⑶15、⑶16、⑶19、CD33、CD41、CD45、CD35、CD235a 中的兩種或以上。
[0021]本發(fā)明中，所述濾膜孔徑為5~8um，選自聚碳酸酯濾膜、纖維濾膜、尼龍濾膜、或塑料薄膜。
[0022]本發(fā)明中，所述紅細(xì)胞裂解液包括有以下濃度的組份:0.1M~0.5M氯化銨、
0.0OlM~0.2M碳酸氫鉀、0.001~0.05M乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸二鈉。進(jìn)一步地，所述紅細(xì)胞裂解液包括有以下濃度的組份:0.3M~0.32M氯化銨、0.018M~0.022M碳酸氫鉀、0.003~0.005M乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸二鈉。進(jìn)一步地，還包括有0.01%~0.2%的甲醛。
[0023]本發(fā)明的另一目的是提供一種用于富集循環(huán)腫瘤細(xì)胞的裝置，包括用于加入紅細(xì)胞裂解液的部件，用于加入免疫微珠的部件，以及過濾的部件。
[0024]本發(fā)明的另一目的是提供一種上述富集的循環(huán)腫瘤細(xì)胞的分析方法。該方法可用于循環(huán)腫瘤細(xì)胞的分析。
[0025]實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下。
[0026]本發(fā)明中，循環(huán)腫瘤細(xì)胞的分析方法包括:免疫熒光，免疫組化染色，PCR，基因突變檢測，基因表達(dá)檢測，基因表達(dá)譜分析，流式細(xì)胞術(shù)檢測，蛋白表達(dá)譜分析，和/或酶學(xué)測定。
[0027]在其中一個(gè)實(shí)施例中，該方法為免疫熒光，基因突變檢測，基因表達(dá)檢測。
[0028]在其中一個(gè)實(shí)施例中，該方法包括，將獲取循環(huán)腫瘤細(xì)胞對象的第一份生物體液樣本中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)量與至少接受一部分治療的同一對象的第二份生物體液樣本中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行比較，從而分析循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化。
[0029]進(jìn)一步地，該方法包括，將獲取循環(huán)腫瘤細(xì)胞對象的第一份生物體液樣本中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光，免疫組化染色，PCR,基因突變檢測，基因表達(dá)譜分析，流式細(xì)胞術(shù)檢測，蛋白表達(dá)譜分析，和/或酶學(xué)測定；以及至少接受一部分治療的同一對象的第二份生物體液樣本中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光，免疫組化染色，PCR，基因突變檢測，基因表達(dá)檢測，基因表達(dá)譜分析，流式細(xì)胞術(shù)檢測，蛋白表達(dá)譜分析，和/或酶學(xué)測定，比較測定結(jié)果從而動(dòng)態(tài)的分析獲取循環(huán)腫瘤細(xì)胞對象的基因突變、基因表達(dá)譜、蛋白表達(dá)譜，和/或酶學(xué)的變化。
[0030]本發(fā)明的另一目的是提供一種細(xì)胞純化試劑盒。該試劑盒可用于去除生物體液中的白細(xì)胞、紅細(xì)胞和/或血小板。該試劑盒主要組份包括有:與白細(xì)胞、紅細(xì)胞和/或血小板特異性結(jié)合的免疫微珠，所述的免疫微珠上共價(jià)或非共價(jià)偶聯(lián)有與白細(xì)胞、紅細(xì)胞和/或血小板特異性結(jié)合的抗體；所述抗體選自⑶2、⑶15、⑶16、⑶19、⑶33、⑶41、⑶45、⑶35、⑶235a中的兩種或以上。
[0031]本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于:
[0032]I)目前富集CTCs的方法中，較為常用的是正性富集法，該法使用的微珠表面偶聯(lián)與目的細(xì)胞結(jié)合的抗體(如EpCAM，HEA125，cK7/8)，細(xì)胞與磁珠結(jié)合后，直接被分離出來；而本發(fā)明使用的是負(fù)性富集法，采用微珠偶聯(lián)抗白細(xì)胞的抗體，從而去除白細(xì)胞，使目的細(xì)胞得以純化，避免了因CTCs表面標(biāo)志物的丟失導(dǎo)致部分CTCs無法有效富集，本發(fā)明可以富集更多CTCs。
[0033]2)本發(fā)明使用負(fù)性富集法，避免如正性富集中抗體與CTCs的結(jié)合，從而有效保證CTCs細(xì)胞的完整性，有利于后續(xù)檢測與工藝處理。
[0034]3)本發(fā)明對紅細(xì)胞裂解、免疫微珠法去除白細(xì)胞和濾膜法富集CTCs方法的綜合及優(yōu)化，從而極大地提高循環(huán)腫瘤細(xì)胞的富集效果，該技術(shù)目前對白細(xì)胞的去除效率>99.9%，腫瘤細(xì)胞的富集效率>80%。
[0035]4)本發(fā)明聯(lián)合多種⑶抗體免疫微珠，解決了目前由于不同類別白細(xì)胞表達(dá)⑶45的豐度不同，造成單一 CD45免疫微珠去除白細(xì)胞的結(jié)合效率差的問題，極大提高了白細(xì)胞的去除效果，從而可以有效富集循環(huán)腫瘤細(xì)胞。
[0036]5)本發(fā)明在使用聯(lián)合多種CD抗體免疫微珠的同時(shí)采用微孔濾膜過濾的方法，進(jìn)一步提高白細(xì)胞的去除效率和腫瘤細(xì)胞的回收率，極大的提高CTCs純度，方便后續(xù)對腫瘤細(xì)胞的研究和分子檢測。

【專利附圖】

【附圖說明】
圖1為實(shí)施例6的免疫熒光結(jié)果示意圖，其中圖A =DLD-1細(xì)胞，圖B:HepG2細(xì)胞，圖C:NC1-H2228，箭頭1:白細(xì)胞，箭頭2:腫瘤細(xì)胞。

【具體實(shí)施方式】
[0037]實(shí)施例1 一種富集循環(huán)腫瘤細(xì)胞的試劑盒，主要包括有:
[0038]1、紅細(xì)胞裂解液
[0039]用于紅細(xì)胞裂解液，具有以下組成:
[0040]表1紅細(xì)胞裂解液
[0041]

【權(quán)利要求】
1.一種循環(huán)腫瘤細(xì)胞的富集方法，其特征在于，主要包括以下步驟: 1)對生物體液樣本進(jìn)行紅細(xì)胞裂解處理以去除紅細(xì)胞； 2)加入與白細(xì)胞、紅細(xì)胞和/或血小板特異性結(jié)合的免疫微珠進(jìn)行孵育以去除白細(xì)胞、血小板及殘余的紅細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的循環(huán)腫瘤細(xì)胞的富集方法，還包括: 3)將去除白細(xì)胞、紅細(xì)胞后的細(xì)胞懸液在濾膜上進(jìn)行過濾，得到富集循環(huán)腫瘤細(xì)胞的濾膜。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的循環(huán)腫瘤細(xì)胞的富集方法，其特征在于，所述濾膜孔徑為5~8um，選自聚碳酸酯濾膜、纖維濾膜、尼龍濾膜、或塑料薄膜。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的循環(huán)腫瘤細(xì)胞的富集方法，所述的免疫微珠上共價(jià)或非共價(jià)偶聯(lián)有與白細(xì)胞、紅細(xì)胞和/或血小板特異性結(jié)合的抗體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的循環(huán)腫瘤細(xì)胞的富集方法，所述的免疫微珠上偶聯(lián)的抗體選自 CD2、CD15、CD16、CD19、CD33、CD41、CD45、CD35、CD235a 中的兩種或以上。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的循環(huán)腫瘤細(xì)胞的富集方法，其特征在于，使用紅細(xì)胞裂解液對生物體液樣本進(jìn)行紅細(xì)胞裂解處理，所述紅細(xì)胞裂解液包括有以下濃度的組份:0.1M~0.5M氯化銨、0.0OlM~0 .2M碳酸氫鉀、0.001~0.05M乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸二鈉。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的循環(huán)腫瘤細(xì)胞的富集方法，其特征在于，所述紅細(xì)胞裂解液包括有以下濃度的組份:0.3M~0.32M氯化銨、0.018M~0.022M碳酸氫鉀、0.003~0.005M乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸二鈉。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的循環(huán)腫瘤細(xì)胞的富集方法，其特征在于，所述的紅細(xì)胞裂解液還包括有0.01%~0.2%的甲醛。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的循環(huán)腫瘤細(xì)胞的富集方法，其特征在于，所述免疫微珠由抗體與微珠表面進(jìn)行共價(jià)或非共價(jià)偶聯(lián)而成，所述微珠的直徑介于10納米-100微米。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的循環(huán)腫瘤細(xì)胞的富集方法，其特征在于，所述微珠為磁性或非磁性。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的循環(huán)腫瘤細(xì)胞的富集方法，其特征在于，所述微珠含有聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、和四氧化三鐵中一種或以上的成分。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至11任一所述的循環(huán)腫瘤細(xì)胞的富集方法，其特征在于，所述生物體液樣本來源于人或動(dòng)物的:外周循環(huán)血，胸腔積液，腹水，臍帶血，羊水，骨髓，或培養(yǎng)的人或動(dòng)物細(xì)胞。
13.一種用于富集循環(huán)腫瘤細(xì)胞的試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括紅細(xì)胞裂解液，免疫微珠。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒還包括濾膜。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的試劑盒，其特征在于，所述的免疫微珠上共價(jià)或非共價(jià)偶聯(lián)有與白細(xì)胞、紅細(xì)胞和/或血小板特異性結(jié)合的抗體。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的試劑盒，其特征在于，所述的免疫微珠上偶聯(lián)的抗體選自CD2、CD15、CD16、CD19、CD33、CD41、CD45、CD35、CD235a 中的兩種或以上。
17.根據(jù)權(quán)利要求14所述的試劑盒，其特征在于，所述濾膜孔徑為5~8um，選自聚碳酸酯濾膜、纖維濾膜、尼龍濾膜、或塑料薄膜。
18.根據(jù)權(quán)利要求13-17任一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于，所述紅細(xì)胞裂解液包括有以下濃度的組份:0.1M~0.5M氯化銨、0.0OlM~0.2M碳酸氫鉀、0.001~0.05M乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸二鈉。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的試劑盒，其特征在于，所述紅細(xì)胞裂解液包括有以下濃度的組份:0.3M~0.32M氯化銨、0.018M~0.022M碳酸氫鉀、0.003~0.005M乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸二鈉。
20.一種用于富集循環(huán)腫瘤細(xì)胞的裝置，包括用于加入紅細(xì)胞裂解液的部件，用于加入免疫微珠的部件，以及過濾的部件。
21.一種權(quán)利要求1至11任一項(xiàng)富集的循環(huán)腫瘤細(xì)胞的分析方法，其特征在于，該分析方法包括免疫熒光，免疫組化染色，PCR,基因突變檢測，基因表達(dá)檢測，基因表達(dá)譜分析，流式細(xì)胞術(shù)檢測，蛋白表達(dá)譜分析，和/或酶學(xué)測定。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的循環(huán)腫瘤細(xì)胞的分析方法，其特征在于，該方法包括免疫熒光，基因表達(dá)檢測，和/或基因突變檢測。
23.一種權(quán)利要求1至11任一項(xiàng)富集的循環(huán)腫瘤細(xì)胞的分析方法，該方法包括，將獲取循環(huán)腫瘤細(xì)胞對象的第一份生物體液樣本中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)量與至少接受一部分治療的同一對象的第二份生物體液樣本中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行比較，從而分析循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化。
24.一種權(quán)利要求1至11任一項(xiàng)富集的循環(huán)腫瘤細(xì)胞的分析方法，該方法包括，將獲取循環(huán)腫瘤細(xì)胞對象的第一份生物體液樣本中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光，免疫組化染色，PCR，基因突變檢測，基因表達(dá)檢測，基因表達(dá)譜分析，流式細(xì)胞術(shù)檢測，蛋白表達(dá)譜分析，和/或酶學(xué)測定；以及至少接受一部分治療的同一對象的第二份生物體液樣本中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光，免疫組化染色，PCR，基因突變檢測，基因表達(dá)檢測，基因表達(dá)譜分析，流式細(xì)胞術(shù)檢測，蛋白表達(dá)譜分析，和/或酶學(xué)測定，比較測定結(jié)果從而動(dòng)態(tài)分析獲取循環(huán)腫瘤細(xì)胞對象的基因突變、基因表達(dá)譜、蛋白表達(dá)譜，和/或酶學(xué)的變化。
25.—種細(xì)胞純化試劑盒，其特征在于，主要組份包括有:與白細(xì)胞、紅細(xì)胞和/或血小板特異性結(jié)合的免疫微珠，所述的免疫微珠上共價(jià)或非共價(jià)偶聯(lián)有與白細(xì)胞、紅細(xì)胞和/或血小板特異性結(jié)合的抗體；所述抗體選自⑶2、⑶15、⑶16、⑶19、⑶33、⑶41、⑶45、⑶35、⑶235a中的兩種或以上。
【文檔編號】C12M1/12GK104178454SQ201310200385
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2013年5月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月24日
【發(fā)明者】許嘉森, 劉志明, 吳詩揚(yáng), 劉蘇燕, 林麗 申請人:益善生物技術(shù)股份有限公司