白血病融合基因的檢測(cè)方法及其引物、探針和基因芯片的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種多重RT-PCR聯(lián)合基因芯片檢測(cè)白血病融合基因的方法，步驟包括：1）抽提樣本細(xì)胞總RNA；2）RNA特異性逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；3）多重RT-PCR擴(kuò)增cDNA；4）用含檢測(cè)白血病融合基因的特異性探針的基因芯片檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。本發(fā)明還公開了上述方法所用的探針、引物和基因芯片。本發(fā)明采用一管巢式多重PCR，擴(kuò)增樣本中可能含有的特異性融合基因片段，再通過基因芯片雜交和芯片掃描圖像分析，獲得融合基因檢測(cè)結(jié)果，如此實(shí)現(xiàn)了15個(gè)白血病融合基因的27種及以上不同融合形式的特異性片段的同時(shí)檢測(cè)，從而大大提高了白血病融合基因的檢測(cè)效率，有利于大規(guī)模的臨床篩選。
【專利說明】白血病融合基因的檢測(cè)方法及其引物、探針和基因芯片

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是涉及一種多重RT-PCR聯(lián)合基因芯片檢測(cè)白血病融合基因的方法，以及該方法所用的特異性探針、引物和基因芯片。

【背景技術(shù)】
[0002]白血病是造血系統(tǒng)的一種惡性腫瘤，年發(fā)病率約為2.76人/10萬人，占癌總發(fā)病數(shù)的5%，兒童及35歲以下成人惡性腫瘤死亡率排名第一位。白血病的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的過程，往往涉及多個(gè)基因的改變，包括正?；虻耐蛔兓蛉笔?、癌基因的異常擴(kuò)增和表達(dá)以及多個(gè)基因的協(xié)同作用，加之基因本身多效性和免疫因素，最終決定腫瘤表型是否表達(dá)。
[0003]根據(jù)病程、臨床表現(xiàn)白血病可分為兩大類急性白血病和慢性白血病。根據(jù)母細(xì)胞來源又可將急性白血病分為急性淋巴性白血病(Acute Lymphoblastic Leukemia, ALL),急性髓性白血病(Acute Myelogenous Leukemia, AML);慢性白血病分為慢性淋巴性白血病(Chronic Lymphocytic Leukemia, CLL),慢性髓性白血病(Chronic MyelogenousLeukemia, CML)0其中以急性白血病多見(70% )，各年齡均可發(fā)生，而且男性多于女性。成年人中最常見的是AML和CML，兒童中比較常見的是ALL。
[0004]部分白血病的發(fā)生可能與染色體易位所形成的融合基因有關(guān)，如染色體易位 t(9;22) (q34;qlI)BCR-ABL pl90、t(4;11) (q21;q23)MLL-AF4、t(12;21) (pl3;q22)TEL-AMLl、t(l; 19) (q23; pl3) E2A-PBX1 可能會(huì)與 ALL 相關(guān)；t(8;21) (q22; q22) AML1-ET0、inv(16)(pl3;q22)/t(16;16)(pl3;q22)CBFB-MYH11、 t(15;17)(q22;ql2)PML-RARA、t(9;ll) (p22;q23)MLL-AF9及其他一些llq23MLL基因重排可能會(huì)與AML相關(guān)。染色體異位形成的融合基因的檢測(cè)，結(jié)合臨床細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查、骨髓象檢查等，可進(jìn)行白血病的診斷、預(yù)后和治療方面的分析。
[0005]檢測(cè)白血病染色體異常的方法主要有常規(guī)G顯帶染色體核型分析、熒光原位雜交技術(shù)(Fluorescence in situ hybridizat1n, FISH)和 PCR 技術(shù)。常規(guī) G 顯帶染色體核型分析依舊是染色體遺傳病檢查的重要手段，它能夠可靠識(shí)別染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)的變化，盡管在靈敏度和操作性上有局限，比如白血病細(xì)胞分裂指數(shù)低、染色體形態(tài)短小、常顯帶不清、隱匿型易位，使得一些結(jié)構(gòu)復(fù)雜或細(xì)微的改變難以準(zhǔn)確識(shí)別。FISH是利用熒光標(biāo)記探針結(jié)合特定染色體序列，從而得以在顯微鏡下分析。通過探針熒光可以識(shí)別顯微甚至亞顯微的隱匿型結(jié)構(gòu)異常和染色體數(shù)目變化。FISH相對(duì)于核型分析更能直接觀察染色體異常，而且靈敏度更高，適用于分裂間期中期細(xì)胞，但其僅能對(duì)已知探針的基因位點(diǎn)進(jìn)行分析。PCR檢測(cè)急性白血病相當(dāng)普遍，不僅對(duì)白血病的診斷有用，而且更適用于對(duì)白血病微小殘留病灶的檢測(cè)。這些方法都具有各自的優(yōu)缺點(diǎn)，但是都不適合于多樣本的白血病融合基因篩查。
[0006] 因此，出現(xiàn)了一些新型檢測(cè)技術(shù)，尤其是基因芯片技術(shù)?；蛐酒夹g(shù)檢測(cè)的最大優(yōu)點(diǎn)是信息量大、操作自動(dòng)化、智能化，能快速靈敏地檢測(cè)出所需基因，不僅操作簡便，耗費(fèi)也不高，因此可能是一種很好的檢測(cè)方法，應(yīng)用于常規(guī)臨床評(píng)估和疾病控制方面有很大的前景。國外有采用基因芯片的方法檢測(cè)白血病融合基因的報(bào)道，而國內(nèi)尚未有相關(guān)報(bào)道。但是國外主要的幾款芯片局限性也相當(dāng)明顯，僅針對(duì)少數(shù)幾種白血病類型的其中一種融合形式，并且涉及PCR部分都是采用多管巢式PCR，這不利于稍具規(guī)模的臨床篩選。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之一是提供一種多重RT-PCR聯(lián)合基因芯片檢測(cè)白血病融合基因的方法，它可以提高白血病融合基因的檢測(cè)效率。
[0008]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的多重RT-PCR聯(lián)合基因芯片檢測(cè)白血病融合基因的方法，步驟包括:
[0009]I)抽提樣本細(xì)胞總RNA ；
[0010]2)將步驟I)得到的RNA特異性逆轉(zhuǎn)錄為cDNA ；
[0011]3)以cDNA為模板，進(jìn)行多重RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)；
[0012]4)用含有一條以上檢測(cè)白血病融合基因的特異性探針的基因芯片檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中是否含有相應(yīng)的白血病融合基因片段。
[0013]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之二是提供用于檢測(cè)白血病融合基因的特異性探針，該探針的序列包括SEQ ID NO: 31~80所示的序列或其互補(bǔ)鏈,且探針5’端修飾有氨基。
[0014]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之三是提供用于檢測(cè)白血病融合基因的基因芯片，該基因芯片含有一條以上上述檢測(cè)白血病融合基因的特異性探針。
[0015]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之四是提供用于上述多重RT-PCR聯(lián)合基因芯片檢測(cè)白血病融合基因方法的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA的引物組合，所述引物組合具有如SEQ ID No:1~16所示的序列或其互補(bǔ)鏈。
[0016]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之五是提供多重RT-PCR擴(kuò)增cDNA的引物組合，所述引物組合具有如SEQ ID No: 17~30所示的序列或其互補(bǔ)鏈。
[0017]本發(fā)明采用一管巢式多重PCR，擴(kuò)增樣本中可能含有的特異性融合基因片段，實(shí)現(xiàn)了 15個(gè)白血病融合基因的27種及以上不同融合形式的特異性片段的同時(shí)檢測(cè)，包括:t(8;21) (q22;q22)AMLl-ET0, inv(16) (pl3q22)/t (16; 16) (pl3; q22) CBFB—MYH11，t(15; 17)(q22;q2I)PML-RARA, t(ll;17)(q23;ql2)PLZF-RARA, t(5;17)(q35;ql2)NPM1-RARA,t(9;11) (p22;q23)MLL-AF9, t(6;11)(q27;q23)MLL_AF6，t(ll;19) (q23;pl3.3)MLL_ENL，t (11 ; 19) (q23;pl3.1)MLL_ELL，t(10; 11) (pl2 ; q23) MLL-AF10, t(12;21) (pl3; q22)TEL-AMLl，t(l;19) (q23;pl3)E2A-PBX1，t(4;11) (q21;q23)MLL-AF4, del(I) (p32;p32)SIL-TALl，t (9; 22) (q34, qlI) BCR-ABL pl90，p210 和p230，后續(xù)借助基因芯片雜交和芯片掃描圖像分析，就可以獲得融合基因檢測(cè)結(jié)果，從而大大提高了白血病融合基因的檢測(cè)效率，可用于大規(guī)模的臨床篩選。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1為基因芯片示意圖，其中A為芯片各探針的位置圖，B為整體芯片示意圖。
[0019]圖2為K-562細(xì)胞系的芯片雜交結(jié)果。其中A為K-562芯片雜交圖；B為芯片上各探針的信號(hào)值分布圖，虛線為閾值(背景信號(hào)和陰性信號(hào)平均值+3SD)。
[0020]圖3為多重RT-PCR特異性凝膠電泳結(jié)果。其中，M泳道為DL2000DNA Marker ;泳道1-6為細(xì)胞系，分別為KASUM1-1、NB-4、ME-1、THP-1、K-562、REH ;泳道7-14為樣本，分別為 PML-RARA S-form、MLL-AF4、MLL-ENL, MLL-ELL, MLL-AF6、MLL-AFlO, E2A-PBX1、BCR-ABLP190 ;泳道15為陰性對(duì)照；泳道16為H20。
[0021]圖4為KASUM1-1細(xì)胞系不同稀釋梯度的凝膠電泳圖和芯片雜交結(jié)果。其中A為KASUM1-1不同稀釋梯度的凝膠電泳結(jié)果；B為KASUM1-1各稀釋梯度對(duì)應(yīng)的芯片雜交圖；C為KASUM1-1稀釋梯度10_3和10_4對(duì)應(yīng)各探針的信號(hào)值分布圖，虛線為閾值(背景信號(hào)和陰性信號(hào)平均值+3SD)。
[0022]圖5為用本發(fā)明的多重RT-PCR聯(lián)合基因芯片檢測(cè)部分白血病臨床樣本的結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0023]下面通過具體實(shí)施例，并結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。下列實(shí)施例旨在舉例說明而不是限制本發(fā)明。
[0024]實(shí)施例1多重RT-PCR聯(lián)合基因芯片檢測(cè)K-562細(xì)胞系的白血病融合基因
[0025]1.細(xì)胞總RNA抽提
[0026]取K-562細(xì)胞系，采用Trizol的方法,按照Invitrogen公司Trizol說明書提取細(xì)胞總RNA，提取的具體步驟如下:
[0027](I)取保存在Trizol里的標(biāo)本400 μ 1，加入400 μ I氯仿，混勻，室溫放置5分鐘；
[0028](2) 15000rpm離心10分鐘，離心后吸取無色上清液；
[0029](3)在上述上清中加入等體積預(yù)冷的異丙醇，顛倒混勻后室溫放置10分鐘；
[0030] (4) 15000rpm離心10分鐘，吸棄上清；
[0031](5)在上述離心管中，加入300μ I預(yù)冷的70%乙醇，15000rpm離心5分鐘，吸棄上清；室溫放置10分鐘，使乙醇揮發(fā)；
[0032](6)加入30-60 μ I DEPC (焦碳酸二乙酯)水混勻溶解，定量，RNA的0D26(l/0D28。在
1.8 ~2.0 ;
[0033](7)取2 μ g總RNA，用于下一步的特異性逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。
[0034]2.RNA特異性逆轉(zhuǎn)錄為cDNA
[0035]逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為25 μ 1，包括:2μ g總RNA、2.5~3pmol各種特異性逆轉(zhuǎn)錄引物(見表1，由上海捷瑞生物工程有限公司合成)、200U M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、25U RNA酶抑制劑、ImMdNTPUOmM DTT (二硫蘇糖醇)、50mM Tris-HCl (ρΗ8.3)、75mM KCl、3mM MgCl20
[0036]反應(yīng)條件:RNA與逆轉(zhuǎn)錄引物先于70°C反應(yīng)5分鐘，置于冰上，混入其他反應(yīng)成分于42°C孵育I小時(shí)。
[0037]表1逆轉(zhuǎn)錄引物序列
[0038]

【權(quán)利要求】
1.多重RT-PCR聯(lián)合基因芯片檢測(cè)白血病融合基因的方法，其特征在于，步驟包括: 1)抽提樣本細(xì)胞總RNA； 2)將步驟I)得到的RNA特異性逆轉(zhuǎn)錄為cDNA； 3)以cDNA為模板，進(jìn)行多重RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)； 4)用含有一條以上檢測(cè)白血病融合基因的特異性探針的基因芯片檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中是否含有相應(yīng)的白血病融合基因片段。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)，RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA的引物組合具有如SEQ ID No:1~16所示的序列或其互補(bǔ)鏈。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)，進(jìn)行兩輪巢式多重RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟3)，第一輪PCR體系20μ 1，包括:.1μ I cDNA、3pmol 各種 PCR 弓丨物、4pmol SP6、llmM Tris_HCl、55mM KCl、1.5mM MgCl2,15%DMS0、0.4mM dNTP 和 1.25U ExTaq HS 酶；第二輪 PCR 體系 20 μ 1，包括:1 μ I 第一輪 PCR產(chǎn)物、1mM Tris-HCl、50mM KCl、1.5mM MgCl2、0.2mM dNTP、2pmol T7和2pmol標(biāo)記生物素的SP6和IU ExTaq HS酶；第一輪PCR程序包括25圈循環(huán)，第二輪PCR程序包括30圈循環(huán)，每圈循環(huán)包括:95°C變性30秒，55°C退火40秒，72°C延伸I分鐘；循環(huán)結(jié)束后，均在72°C延伸7分鐘。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或3或4所述的方法，其特征在于，步驟3)，PCR引物組合具有如SEQID No: 17~30所示的序列或其互補(bǔ)鏈。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟4)，所述特異性探針的序列包括SEQID NO:31~80所示的序列或其互補(bǔ)鏈，探針5’端修飾有氨基。
7.用于檢測(cè)白血病融合基因的特異性探針，其特征在于，探針的序列包括SEQIDNO: 31~80所示的序列或其互補(bǔ)鏈，且探針5’端修飾有氨基。
8.用于檢測(cè)白血病融合基因的基因芯片，其特征在于，含有一條以上權(quán)利要求7所述的探針。
9.RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA的引物組合，其特征在于，具有如SEQ ID No:l~16所示的序列或其互補(bǔ)鏈。
10. 多重RT-PCR擴(kuò)增cDNA的引物組合，其特征在于，具有如SEQID No: 17~30所示的序列或其互補(bǔ)鏈。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104178557SQ201310204497
【公開日】2014年12月3日 申請(qǐng)日期:2013年5月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月28日
【發(fā)明者】熊斐斐, 張春秀, 張慶華, 熊慧 申請(qǐng)人:上海生物芯片有限公司, 上海華盈生物醫(yī)藥科技有限公司