專利名稱：一種快捷構(gòu)建amiRNA干擾載體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明所涉及的技術(shù)領(lǐng)域為基礎(chǔ)分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及到小干擾RNA載體的構(gòu)建，其應(yīng)用涉及到動物、植物、微生物。
背景技術(shù)：
體內(nèi)的miRNA是基因表達調(diào)控的重要手段之一，在基因功能分析中，RNA干擾技術(shù)是實現(xiàn)基因轉(zhuǎn)錄后沉默(PTGS)的重要方式，而人工miRNA的構(gòu)建與應(yīng)用是成熟利用miRNA技術(shù)實現(xiàn)基因沉默的標志，具有較高的效率和特異性。關(guān)于人工miRNA構(gòu)建方法最初采用了多輪PCR的方法，全部采用PCR方法進行構(gòu)建人工miRNAI，此技術(shù)容易產(chǎn)生非特異性條帶，需要設(shè)計多對引物，多次PCR整體思路復(fù)雜。后來發(fā)現(xiàn)了酶切連接法，但是用到了稀有的限制性內(nèi)切酶，酶切位點不可選擇，其使用受到了一定的限制，而且價格昂貴2;2009年報道了通過PCR反向擴增供給載體然后重組的方法，此方法操作步驟復(fù)雜而且無法避免將供給載體的部分序列構(gòu)建到轉(zhuǎn)基因載體中3。針對這些已有的方法存在的問題和不足，本方法采用typeIIS型限制性內(nèi)切酶(此類內(nèi)切酶識別位點與酶切位點不在同一位點)作為粘末端產(chǎn)生酶，直接將退火得到的miRNA中間部分與骨架側(cè)翼部分進行連接，而且酶切連接一步法實現(xiàn)，無需凝膠回收酶切片段，簡單、方便、快捷地將整個構(gòu)建過程合并在一個體系中，只需1_2個小時即可完成。I
Schwab， R., et al., Highly specific gene silencing by artificialmicroRNAs in Arabidopsis.Plant Cell, 2006.18(5): p.1121—32Wang，X.， et al., A highly efficient method for construction of riceartificial MicroRNA vectors.Mol Biotechnol，2010.46(3): p.211—8
3Chen, S.，· et al.，A versatile zero background T~vector system for genecloning and functional genomics.Plant Physiol, 2009.150(3): p.1111—21。

發(fā)明內(nèi)容
針對這些已有的方法存在的問題和不足，本發(fā)明提供了一種快捷構(gòu)建人工小RNA載體的方法。本方法用于構(gòu)建人工miRNA干擾載體，其特點是基于能夠?qū)崿F(xiàn)無縫連接的技術(shù)原理，將靶標序列與骨架序列進行連接，從而產(chǎn)生與天然miRNA前體在結(jié)構(gòu)上一致的amiRNA前體。具體地，該方法采用了含有amiRNA前體骨架的載體以及含有正向靶標-環(huán)部骨架-反向靶標的DNA片段，所述載體上的兩側(cè)翼序列之間有一對相同但方向相反的typells型內(nèi)切酶酶切序列，所述DNA片段兩端含有預(yù)設(shè)的typeIIS內(nèi)切酶酶切序列，并且載體上酶切產(chǎn)生的粘末端和合成的DNA上酶切產(chǎn)生的粘末端可以完全互補，通過此typeIIS酶切并連接酶切產(chǎn)物，即可完成載體構(gòu)建。上述DNA片段可同通過將三條單鏈DNA退火并延伸得到，這三條分別為A序列:含有正向靶標和typells型內(nèi)切酶酶切正向序列的單鏈DNA，B序列:中間骨架序列，C序列:含有反向靶標和typells型內(nèi)切酶酶切反向序列的單鏈DNA，B序列的兩端分別和A序列以及C序列的一端部分重疊。所述DNA片段的兩個內(nèi)切酶識別序列的排列方向為“正向-反向”的排列，所述載體上的兩側(cè)翼序列之間有一對分別為“反向-正向”排列的typells型內(nèi)切酶識別序列。可以通過typells型內(nèi)切酶和T4連接酶同時酶切和連接含有amiRNA前體骨架(側(cè)翼部分)的載體和此DNA，以完成載體構(gòu)建。含祀標干擾序列的DNA片段可從WMD3網(wǎng)站(http://wmd3.weigelworld.0rg/cg1-bin/webapp.cgi page= Designer;project=stdwmd)上得到對所干擾的基因的革巴序列，為此特異性的21bp的靶干擾序列設(shè)計引物兩條，還有一條可重復(fù)使用的骨架環(huán)引物，用此三條引物進行退火，可得到長116bp的DNA片段。DNA片段克隆到載體骨架的方法可以是:將含有amiRNA前體骨架的載體和含靶標干擾序列的DNA片段按照合適(1:10到10:1之間)的摩爾比同時進行酶切和連接，在內(nèi)切酶的作用下載體和片段的兩端產(chǎn)生相同的黏末端，再在連接酶的作用下可以相互連接，因此可以形成最終的針對所選基因的特異性amiRNA干擾載體。本方法采用typeIIS型限制性內(nèi)切酶(此類內(nèi)切酶識別位點與酶切位點不在同一位點)作為粘末端產(chǎn)生酶，直接將退火得到的miRNA中間部分與骨架側(cè)翼部分進行連接，而且酶切連接一步法實現(xiàn)，無需凝膠回收酶切片段，簡單、方便、快捷地將整個構(gòu)建過程合并在一個體系中，只需1-2個小時即可完成。


圖1是pAS干擾表達載體的圖譜。圖2顯示的是在煙草中驗證此方法產(chǎn)生的載體對⑶S基因的干擾。左側(cè)為對照組，為含質(zhì)粒PCAMBIA1301的農(nóng)桿菌(可表達⑶S基因)，右側(cè)為含質(zhì)粒pCAMBIA1301的農(nóng)桿菌和含質(zhì)粒pAS-gus的農(nóng)桿菌的混合實驗`組，由此可見干擾載體對于⑶S基因的干擾效果十分顯著。圖3顯示的是定量PCR結(jié)果驗證煙草葉片中⑶S基因的表達量。柱狀圖表示對照組(圖2左側(cè)葉片)和實驗組(圖2右側(cè)葉片)⑶S基因的相對表達量，圖上的短橫線表示所得數(shù)據(jù)的標準差，由此可得干擾載體對靶基因GUS所表達的蛋白可抑制56%左右。圖4是amiRNA的骨架示意圖。
具體實施例方式以下實施例用于進一步說明本發(fā)明，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。實施例1:PAS(pre - amiRNA on typeIIS)系統(tǒng)的建立 針對植物轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)設(shè)計了 PAS干擾表達載體，其圖譜如圖1。此載體是將pCAMBIA1300用QuikChange突變試劑盒消除了 typeIIS (BsaI)后加了一段 cassette,此 cassette 包括 CaMV35s-pre528-ccdB-pre528_Nos ter 全序列通過人工合成得到。CaMV35s表示花椰菜花葉病毒35s啟動子；pre528_l表示水稻內(nèi)源干擾miRNA(0sMIR528)的一部分骨架，序列為 CAGCAGCAGCCACAGCAAAAITTGGITTGGGATAGGTAGGTGTTATGTT AGGTCTGGTTTTTTGGCTGTAGCAGCAGCAGT ;ccdB表示大腸桿菌致死基因，但它對DB3.1菌株不會致毒，雖然圖譜中未標出，但其中含有其自身的啟動子及終止子，序列為:
AGAGACCAATTCTCGACTAAGTTGGCAGCATCACCCGACGCACTTTGCGCCGAATAAATACCTGTGACGGAAGATCACTTCGCAGAATAAATAAATCCTGGTGTCCCTGTTGATACCGGGAAGCCCTGGGCCAACTTTTGGCGAAAATGAGACGTTGATCGGCACGTAAGAGGTTCCAACTTTCACCATAATGAAATAAGATCACTACCGGGCGTATTTTTTGAGTTATCGAGATTTTCAGGAGCTAAGGAAGCTAAACTTTTGCTGACGAGAACAGGGACTGGTGAAATGCAGTTTAAGGTTTACACCTATAAAAGAGAGAGCCGTTATCGTCTGTTTGTGGATGTACAGAGTGATATTATTGACACGCCTGGGCGACGGATGGTGATCCCCCTGGCCAGTGCACGTCTGCTGTCAGATAAAGTCTCCCGTGAACTTTACCCGGTGGTGCATATCGGGGATGAAAGCTGGCGCATGATGACCACCGATATGGCCAGTGTGCCGGTATCCGTTATCGGGGAAGAAGTGGCTGATCTCAGCCACCGCGAAAATGACATCAAAAACGCCATTAACCTGATGTTCTGGGGAATATAAATGTCAGGCTCCCTTATACACAGGTCGACGGTCTCAACGAGCCCTTGGTCTCA ;pre528_2 表示水稻內(nèi)源干擾 miRNA (OsMIR528)的另一部分骨架，序列為 GTTCCTGCTGCTAGGCTGTTCTGTGGAAGITTGCAGAGITTATATTATGGGITTAATCGTCCATGGCATCAGCATCAGCAGC ；Nos ter 表示終止子。實施例2:用PAS系統(tǒng)干擾基因⑶S
選靶基因⑶S ( ￠-葡萄糖苷酸酶基因)進行干擾實驗(GenBank注冊編號AY292368)。(I)通過WMD3在線軟件篩選出⑶S基因的特異靶位點為TAATAACATACGGCGTGACAT
(2)針對此靶位點設(shè)計引物:
pam1-F:caggagg tctcaggaaTAATAACATACGGCGTGACATcaggagattcagttpam1-R:gtcctggtctcagcagTAATAACATACCGCGAGACATagagaggcaaaagpami—M:caggagattcagtttgaagctggacttcacttttgcctctct
(3)將此三條單鏈引物退火延伸，可得到一條116bp的DNA片段，即為caggaggtctcaggaaTAATAACATACGGCGTGACATcaggagattcagtttgaagctggacttcacttttgcctctctATGTCTCGCGGTATGTTATTActgctgagaccaggac。(4)將3得到的DNA片段和pAS-amiRNA用BsaI和T4 DNA Iigase同時反應(yīng)一段時間(0.5-5h)后，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)中，若此片段未能克隆入載體中，此載體在大腸桿菌中不能生長，能長出來的菌斑表示此片段已成功克隆到pAS-amiRNA中，一般情況下都是正確的重組子并命名為pAS-gus。(5)將載體pAS-gus轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105中，侵染煙草植株以驗證干擾效果，如圖2所示。在煙草中驗證此方法產(chǎn)生的載體對⑶S基因的干擾。左側(cè)為對照組，為含質(zhì)粒PCAMBIA1301的農(nóng)桿菌(可表達⑶S基因)，右側(cè)為含質(zhì)粒pCAMBIA1301的農(nóng)桿菌和含質(zhì)粒pAS-gus的農(nóng)桿菌的混合實驗組，由此可見干擾載體對于GUS基因的干擾效果十分顯著。(6)qRT-PCR結(jié)果定量分析干擾效果，如圖3所示。定量PCR結(jié)果驗證煙草葉片中⑶S基因的表達量。柱狀圖表示對照組(圖2左側(cè)葉片)和實驗組(圖2右側(cè)葉片)⑶S基因的相對表達量，圖上的短橫線表示所得數(shù)據(jù)的標準差，由此可得干擾載體對靶基因GUS所表達的蛋白可抑制56%左右。
權(quán)利要求
1.一種構(gòu)建miRNA干擾載體的方法，該方法采用了含有amiRNA前體骨架的載體以及含有正向靶標-環(huán)部骨架-反向靶標的DNA片段，所述載體上的兩側(cè)翼序列之間有一對相同但方向相反的typells型內(nèi)切酶酶切序列，所述DNA片段兩端含有預(yù)設(shè)的typeIIS內(nèi)切酶酶切序列，并且載體上酶切產(chǎn)生的粘末端和合成的DNA上酶切產(chǎn)生的粘末端可以完全互補,通過此typeIIS酶切并連接酶切產(chǎn)物，即可完成載體構(gòu)建。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述DNA片段的構(gòu)建方法是通過將三條單鏈DNA退火并延伸得到，這三條分別為A序列含有正向靶標和typells型內(nèi)切酶酶切正向序列的單鏈DNA，B序列中間骨架序列，C序列含有反向靶標和typells型內(nèi)切酶酶切反向序列的單鏈DNA，B序列的兩端分別和A序列以及C序列的一端部分重疊。
3.權(quán)利要求I方法構(gòu)建得到的miRNA干擾載體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種構(gòu)建人工小RNA(amiRNA)表達載體的方法，其通過人工合成含有正向靶標-環(huán)部骨架-反向靶標的DNA，且此DNA片段兩端含有預(yù)設(shè)的typeIIS內(nèi)切酶酶切位點，將其克隆到含有此typeIIS限制性內(nèi)切酶的含有amiRNA前體骨架的載體中得到小RNA(amiRNA)表達載體。該方法具有高效率、高通量的優(yōu)點，而且操作簡單，用此方法構(gòu)建一個干擾載體只需要設(shè)計一對50bp左右的引物，1-2小時即可完成構(gòu)建。
文檔編號C12N15/63GK103255158SQ20131020516
公開日2013年8月21日 申請日期2013年5月28日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月28日
發(fā)明者李陽, 李陽生, 盧楠, 李楊 申請人:武漢大學(xué)