一組用于檢測斑茅多態(tài)性的引物組、檢測方法和用途
【專利摘要】本發(fā)明提供一組SSR引物組及其該引物組在檢測斑茅多態(tài)性中的應(yīng)用，該SSR引物組的設(shè)計方法，和該SSR引物組用于檢測斑茅多態(tài)性的方法。本發(fā)明能夠檢測到斑茅的一些基因組SSR位點的信息，同時通過對設(shè)計引物的多態(tài)性研制，其設(shè)計的引物能有效的用于斑茅的遺傳多樣性研究及遺傳圖譜構(gòu)建，研制多態(tài)性采用了先進的基因分析儀，提高了引物多態(tài)性檢測的精確度。
【專利說明】—組用于檢測斑茅多態(tài)性的引物組、檢測方法和用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及引物組，特別一組用于檢測斑茅多態(tài)性的引物組及其用于檢測斑茅多態(tài)性的方法及用途。
【背景技術(shù)】
[0002]斑茅是禾本科蔗茅屬高大禾草，具有生物量大、抗逆性強、纖維素含量豐富等特點。由于其抗逆性強，能夠與甘蔗進行種間雜交，常作為甘蔗育種中的優(yōu)良基因來源，是甘蔗育種的主要材料之一。同時由于生物量大、纖維素含量高，已經(jīng)被視為我國本土優(yōu)良的生物質(zhì)能源材料，其能源用潛力巨大。我國熱帶、亞熱帶地區(qū)分布大量的野生斑茅資源，搞清楚其遺傳多樣性規(guī)律是合理保護利用該資源的前提。在遺傳多樣性研究及遺傳圖譜構(gòu)建中分子標(biāo)記至關(guān)重要。分子標(biāo)記是以個體間遺傳物質(zhì)內(nèi)核苷酸序列變異為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記，材料間DNA水平上的多態(tài)性的直接反映。主要常用的分子標(biāo)記方法有RAPD、RFLP, AFLP,SRAP、SSR等，目前斑茅遺傳多樣性的研究并不多，使用的標(biāo)記有SRAP、ISSR、RAPD和RFLP，未見SSR標(biāo)記用于斑茅的遺傳多樣性研究。
[0003]在研究斑茅遺傳多樣性中，使用了 RAPD、RFLP, ISSR和SRAP等分子標(biāo)記。這些標(biāo)記中RAro標(biāo)記是利用一個隨機序列的寡核苷酸作引物，以基因組DNA作模板進行PCR擴增反應(yīng)，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳來檢測DNA序列的多態(tài)性，其缺點是但其重現(xiàn)性差；RFLP標(biāo)記利用基因組DNA經(jīng)特定限制性內(nèi)切酶酶切后所產(chǎn)生相當(dāng)多的大小不等的DNA片段，以同位素或生物素標(biāo)記的DNA片段作探針，用雜交的方法，把與被標(biāo)記的DNA相關(guān)的片段檢測出來，從而構(gòu)建出多態(tài)性圖譜，簡單的說RFLP就是酶切產(chǎn)生的某一特異DNA片段的長度在個體間的差異，該標(biāo)記的缺點是操作繁瑣，檢測周期長，成本高昂，不適于大規(guī)模；ISSR標(biāo)記主要是以一條與微衛(wèi)星(SSRs)序列互補的并在3’或5’端含有2-4個隨機堿基的DNA序列為引物對基因組DNA進行PCR擴增 的一種分子標(biāo)記技術(shù)，SRAP標(biāo)記利用引物設(shè)計對ORFs (openreading frames，開放閱讀框架)進行擴增，上游引物對外顯子進行特異擴增，下游引物對內(nèi)含子區(qū)域、啟動子區(qū)域進行特異擴增，由于內(nèi)含子、啟動子和間隔序列在不同物種甚至不同個體間變異很大，這就使得有可能擴增出基于內(nèi)含子與外顯子的SRAP多態(tài)性標(biāo)記，ISSR標(biāo)記和SRAP標(biāo)記雖然一定程度上解決了以上兩種標(biāo)記的缺點，但是他們均為隨機的顯性遺傳標(biāo)記，不能區(qū)分顯性純合基因型和雜合基因型。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明專利針對斑茅基因組DNA，開發(fā)出斑茅遺傳多樣性研究、遺傳圖譜構(gòu)建及分子輔助育種研究中多態(tài)性高、重復(fù)性好，標(biāo)記穩(wěn)定可靠，易于區(qū)分純合基因型和雜合基因型的基因組SSR標(biāo)記引物。
[0005]本發(fā)明旨在至少在一定程度上解決上述技術(shù)問題之一或至少提供一種有用的商業(yè)選擇。
[0006]本發(fā)明旨在解決現(xiàn)有技術(shù)問題的至少之一。本發(fā)明一方面提供一組SSR引物組，
【權(quán)利要求】
1.一組SSR引物組，其特征在于，所述引物組包括核苷酸序列SEQ ID NO:1-30所示引物。
2.如權(quán)利要求1所述SSR引物組在檢測斑茅多態(tài)性中的應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求1所述的SSR引物組的設(shè)計方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟: A、提取待測斑茅樣品基因組DNA； B、用酶切基因組DNA，回收并純化，回收的產(chǎn)物用接頭連接； C、將連有接頭的DNA片段作為模版進行擴增； D、將步驟C中擴增產(chǎn)物與生物素探針進行雜交，同時用磁珠對雜交產(chǎn)物進行富集，構(gòu)建SSR富集文庫； E、將步驟D中產(chǎn)物連接到載體上轉(zhuǎn)入到大腸桿菌感受態(tài)細胞中，挑取陽性克隆進行DNA測序分析； F、利用微衛(wèi)星DNA位點查找軟件對陽性克隆進行搜索，篩選出含微衛(wèi)星的序列，然后用引物分析軟件在微衛(wèi)星兩翼設(shè)計引物； G、用不同斑茅材料對開發(fā)的SSR引物進行多態(tài)性驗證。
4.如權(quán)利3所述的SSR引物組的設(shè)計方法，其特征在于，步驟B中采用內(nèi)切酶。
5.如權(quán)利3所述的SSR引物組的設(shè)計方法，其特征在于，步驟B中酶切后進行純化，并用接頭連接。
6.如權(quán)利3所述的SSR引物組的設(shè)計方法，其特征在于，步驟C中預(yù)擴增后用瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物。
7.如權(quán)利3所述的SSR引物組的設(shè)計方法，其特征在于，步驟D的雜交過程中平衡磁珠，在雜交產(chǎn)物中加入處理好的磁珠溫育，然后用磁力柱吸附，洗滌，加入TBST洗脫磁珠，留上清液，沉降DNA，對富集產(chǎn)物進行擴增。
8.如權(quán)利要求1所述的SSR引物組用于檢測斑茅多態(tài)性的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟:提取斑茅DNA，用所述的SSR引物對斑茅DNA進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電泳完成后銀染，再用高分辨率數(shù)碼相機拍照保存。
9.一種檢測斑茅多態(tài)性的試劑盒，其特征在于，包含如權(quán)利要求1所述的引物組。
10.如權(quán)利要求9所述的試劑盒檢測斑茅多態(tài)性的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟:提取斑茅DNA，用所述的試劑盒對斑茅DNA進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電泳完成后銀染，再用高分辨率數(shù)碼相機拍照保存。
【文檔編號】C12N15/11GK103468790SQ201310219086
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年6月4日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月4日
【發(fā)明者】鄢家俊, 張建波, 白史且, 張勁, 刀志學(xué), 常丹, 張昌兵 申請人:四川省草原科學(xué)研究院, 貴州省草業(yè)研究所