一種基于磁珠富集法高通量開(kāi)發(fā)基因組ssr標(biāo)記的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種基于磁珠富集法高通量開(kāi)發(fā)基因組SSR標(biāo)記的方法，包括下列步驟：（1)提取目標(biāo)基因組DNA;(2)將所得基因組DNA隨機(jī)片段化；（3)構(gòu)建基因組隨機(jī)片段化DNA文庫(kù)；（4)對(duì)DNA文庫(kù)進(jìn)行擴(kuò)增；（5)利用生物素標(biāo)記的SSR探針與文庫(kù)中的目的片段雜交；（6)對(duì)含有SSR序列的DNA文庫(kù)片段進(jìn)行鏈霉親和素磁珠富集；（7)對(duì)富集的DNA文庫(kù)片段擴(kuò)增并純化；（8)將純化的DNA片段進(jìn)行乳液PCR擴(kuò)增及測(cè)序；（9)在所得的序列中搜索含有SSR位點(diǎn)的序列。該方法降低了文庫(kù)構(gòu)建難度，縮短了實(shí)驗(yàn)周期，提高了測(cè)序通量，降低了測(cè)序成本，可作為高通量開(kāi)發(fā)各物種SSR標(biāo)記的有效方法廣泛應(yīng)用。
【專(zhuān)利說(shuō)明】-種基于磁珠富集法高通量開(kāi)發(fā)基因組SSR標(biāo)記的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種基于磁珠富集法高通量開(kāi)發(fā)基因組SSR 標(biāo)記的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] SSR(Simple Sequence Repeat)，又叫微衛(wèi)星 DNA(Microsatellite DNA)。重復(fù)單 元很短，只有1?6bp ;重復(fù)數(shù)可變，總長(zhǎng)度為幾十個(gè)bp，分布于整個(gè)基因組的不同位置上。 微衛(wèi)星DNA兩端的序列一般是相對(duì)比較保守的單拷貝序列，據(jù)此可設(shè)計(jì)特異引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。根據(jù)串聯(lián)重復(fù)數(shù)不同，便可以揭示微衛(wèi)星DNA長(zhǎng)度的多態(tài)性，具長(zhǎng)度多態(tài)性的片段可 用作分子標(biāo)記。微衛(wèi)星標(biāo)記因具多態(tài)性豐富、重復(fù)性好、共顯性等優(yōu)點(diǎn)廣泛應(yīng)用于遺傳圖譜 構(gòu)建、種群遺傳學(xué)、指紋分析、系統(tǒng)發(fā)育等研究領(lǐng)域。
[0003] 雖然SSR標(biāo)記有諸多的優(yōu)點(diǎn)，但影響SSR使用的一個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)是SSR標(biāo)記的開(kāi)發(fā)。只 有開(kāi)發(fā)了一定量的多態(tài)性SSR標(biāo)記，才能對(duì)某一物種進(jìn)行SSR標(biāo)記的分析。特別是對(duì)沒(méi)有 參考基因組序列的物種（即該物種的基因組序列沒(méi)有被全基因組測(cè)序)，SSR標(biāo)記的開(kāi)發(fā)和 利用就更困難。
[0004] SSR標(biāo)記開(kāi)發(fā)的方法有很多，之前的傳統(tǒng)方法主要有：（1)從公共數(shù)據(jù)庫(kù)或相關(guān)文 獻(xiàn)中查找微衛(wèi)星位點(diǎn)；（2)參考近緣物種SSR位點(diǎn)的PCR引物進(jìn)行交叉擴(kuò)增；（3)從基因組 DNA(gDNA)、cDNA、EST中篩選微衛(wèi)星位點(diǎn)。第一種方法極大地受限于數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)量，不 適于未知基因組序列的物種；第二種方法效果不穩(wěn)定，具有較高的風(fēng)險(xiǎn)性和局限性；第三 種方法又可分為多種策略，包括經(jīng)典方法、富集法和省略篩庫(kù)法。對(duì)于測(cè)序很少的物種，基 本上只能選擇第三種方法。
[0005] 在從gDNA、cDNA、EST中篩選微衛(wèi)星位點(diǎn)的傳統(tǒng)方法中，富集法基于SSR探針和基 因組DNA文庫(kù)的液相雜交，提高了分離效率，是大規(guī)模篩選微衛(wèi)星位點(diǎn)較為常用的一種方 法?；诘谝淮鷾y(cè)序平臺(tái)的磁珠富集法需要經(jīng)過(guò)富含微衛(wèi)星的基因組文庫(kù)構(gòu)建、微衛(wèi)星位 點(diǎn)分離、陽(yáng)性克隆測(cè)序、PCR引物設(shè)計(jì)、引物預(yù)擴(kuò)增和多態(tài)性檢測(cè)等一系列步驟，流程繁瑣， 成本高,通量也不足。
[0006] 高通量測(cè)序技術(shù)是近年來(lái)快速發(fā)展的一項(xiàng)DNA序列分析技術(shù)，該技術(shù)相對(duì)于第一 代測(cè)序技術(shù)，最大的優(yōu)勢(shì)是通量高，相對(duì)成本低，速度快。其中Roche GS FLX+測(cè)序平臺(tái)的 讀長(zhǎng)最長(zhǎng)，較適合SSR標(biāo)記開(kāi)發(fā)中的特異性引物設(shè)計(jì)。該平臺(tái)基于焦磷酸測(cè)序原理，焦磷 酸測(cè)序技術(shù)是由4種酶催化的同一反應(yīng)體系中的酶級(jí)聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，在每一輪測(cè)序反應(yīng) 中，只加入一種dNTP，若該dNTP與模板配對(duì)，聚合酶就可以將其摻入到引物鏈中并釋放出 等摩爾數(shù)的焦磷酸基團(tuán)（PPi)。PPi可最終轉(zhuǎn)化為可見(jiàn)光信號(hào)，并通過(guò)光學(xué)系統(tǒng)生成一個(gè)峰 值。每個(gè)峰值的高度與反應(yīng)中摻入的核苷酸數(shù)據(jù)成正比，然后加入下一種dNTP，繼續(xù)DNA鏈 的合成。
[0007] 高通量測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用是SSR標(biāo)記開(kāi)發(fā)的一大趨勢(shì)，應(yīng)用方式包括：（1)直接的基 因組測(cè)序；（2)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。直接的基因組測(cè)序會(huì)得到大量的無(wú)用序列，特別是對(duì)大型的或 復(fù)雜的基因組來(lái)說(shuō)，成本高，效率低；轉(zhuǎn)錄組測(cè)序僅能獲得編碼區(qū)的SSR標(biāo)記信息，而編碼 區(qū)的SSR類(lèi)型往往具有三和六堿基重復(fù)的偏好性。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 因此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)目前開(kāi)發(fā)SSR標(biāo)記的方法流程繁瑣，成本 高，效率較低的缺陷，提供一種基于磁珠富集法高通量開(kāi)發(fā)基因組SSR標(biāo)記的方法。
[0009] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采取的技術(shù)方案之一為：一種基于磁珠富集法高通 量開(kāi)發(fā)基因組SSR標(biāo)記的方法，所述方法包括下列步驟：
[0010] (1)提取目標(biāo)基因組DNA ;
[0011] (2 )將步驟（1)所得基因組DNA隨機(jī)片段化；
[0012] (3)構(gòu)建基因組隨機(jī)片段化DNA文庫(kù)；
[0013] (4)以步驟（3)所得DNA文庫(kù)為模板,利用前引物,其序列如SEQ ID NO: 1所示,和 后引物，其序列如SEQ ID NO: 2所示，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得文庫(kù)擴(kuò)增片段；
[0014] (5)利用生物素標(biāo)記的SSR探針與文庫(kù)中含有SSR位點(diǎn)的目的片段進(jìn)行雜交；
[0015] (6)利用鏈霉親和素包被的磁珠對(duì)文庫(kù)中結(jié)合了生物素標(biāo)記的SSR探針的目的片 段進(jìn)行富集；
[0016] (7)以步驟（6)所得的目的片段為模板，利用前引物，其序列如SEQ ID N0:1所示， 和后引物，其序列如SEQ ID NO: 2所示，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，純化PCR擴(kuò)增所得的DNA片段；
[0017] (8)以步驟（7)所得的純化的DNA片段為模板進(jìn)行乳液PCR擴(kuò)增，將乳液PCR擴(kuò)增 所得序列進(jìn)行測(cè)序；
[0018] (9)在步驟（8)所得的序列中搜索含有SSR位點(diǎn)序列。
[0019] 其中步驟（1)為提取目標(biāo)基因組DNA。所述目標(biāo)基因組DNA提取的方法為常規(guī)提 取方法。較佳地為利用各種市售試劑盒或其他常規(guī)技術(shù)提取目標(biāo)基因組DNA。所述目標(biāo)基 因組DNA較佳地是動(dòng)物基因組DNA、植物基因組DNA或微生物基因組DNA ;所述目標(biāo)基因組 DNA包括具有參考基因組序列的基因組DNA，或者不具有參考基因組序列的基因組DNA。
[0020] 其中所述參考基因組是本領(lǐng)域常規(guī)概念，是指物種的基因組序列被全基因組測(cè) 序。具有參考基因組序列的物種基因組DNA是指該物種已經(jīng)被全基因測(cè)序；不具有參考基 因組序列的基因組DNA是指該物種沒(méi)有被全基因測(cè)序。
[0021] 其中步驟（2)為將步驟（1)所得基因組DNA隨機(jī)片段化。所述基因組DNA隨機(jī)片 段化的方法為本領(lǐng)域常規(guī)方法，較佳地為高壓氮?dú)夥ɑ蚶闷位瘍x器進(jìn)行片段化。其中 所述的片段化儀器較佳地為 ：Bi〇rupt〇r Plus或Covaris等片段化儀器，所述片段化儀器 均市售可得。
[0022] 所述高壓氮?dú)夥ㄝ^佳地包括以下步驟：取約4 μ g的基因組DNA( 100 μ I gDNA)，在 600 μ 1的片段化體系（gDNA :100 μ I ;片段化緩沖液：500 μ 1，片段化緩沖液的組分為：50% 甘油，5mM Tris-HCl，0. 5mM EDTA，pH8. 0)中，施加0. 3?0. 4MPa的高壓氮?dú)?，持續(xù)50? 70s。
[0023] 所述片段化儀器較佳地為：BioruptOT Plus隨機(jī)片段化儀器，所述隨機(jī)片段化儀 器的參數(shù)設(shè)置較佳地為：Cycle conditions(0n/0ff times in 86(：.):30/90，循環(huán)數(shù)：3? 6cycles。隨機(jī)片段化儀器較佳地為：Covaris M220microTUBE AFA Fiber Screw-Cap ; 該儀器參數(shù)設(shè)置較佳地為：Peak Incident Power (W) : 50, Duty Factor :20%, Cycles per Burst: 200, Treatment Time (s) : 25 ~ 50s, Temperature (°C ) : 20, Sample volume ( μ I) : 50。
[0024] 隨機(jī)片段化結(jié)束后較佳地還包括對(duì)片段化產(chǎn)物進(jìn)行純化，所述純化步驟較佳地為 利用各種市售試劑盒對(duì)所得片段化產(chǎn)物進(jìn)行純化。所述Kit較佳地為Axygen AxyPrepTM PCR Clean-up Kit。利用所述試劑盒純化片段的具體方法可參閱該試劑盒的使用說(shuō)明書(shū)。 對(duì)所有純化的片段化產(chǎn)物進(jìn)行1. 5% (質(zhì)量體積比)瓊脂糖凝膠電泳，120V，持續(xù)20min，切下 400?700bp范圍的片段，使用Axygen AxyPrep DNA Gel Extraction Kit對(duì)目的片段進(jìn)行 膠回收純化，使用20?25 μ 1的洗脫液進(jìn)行洗脫，具體方法可參閱該試劑盒的使用說(shuō)明書(shū)。
[0025] 其中步驟（3)為構(gòu)建基因組隨機(jī)片段化DNA文庫(kù)。所述構(gòu)建基因組隨機(jī)片段化 DNA文庫(kù)的方法為常規(guī)方法。較佳地為利用市售試劑盒進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建。所述構(gòu)建方法優(yōu)選 地為使用Roche GS Rapid Library Prep Kit (試劑盒)利用上述純化所得的片段化產(chǎn)物進(jìn) 行基因組隨機(jī)片段化DNA文庫(kù)構(gòu)建，具體方法可參閱羅氏公司該試劑盒最新的使用手冊(cè)： 〈〈Rapid Library Preparation Method Manual_XL+_May2011〉〉。
[0026] 其中步驟（4)為以步驟（3)所得DNA文庫(kù)為模板，利用前引物，其序列如SEQ ID NO: 1所示，和后引物，其序列如SEQ ID NO: 2所示，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得文庫(kù)擴(kuò)增片段。所 述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系較佳地為：基因組DNA文庫(kù)：8?15ng ;10XPCR緩沖液：5μ I ;dNTP (2. 5mM ea. ) :4μ I ;前引物（10μΜ) :2μ I ;后引物（10μΜ) :2μ I ;DNA 聚合酶：0· 5μ I ;力口 水至50 μ 1。
[0027] 其中所述前引物為L(zhǎng)ibL-Primer-A :
[0028] 5 ' -CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACGACT-3 '，其序列如序列表中 SEQ ID NO: 1 所 示；
[0029] 其中所述后引物為 LibL-Primer-B :5' -CCTATCCCCTGTGTGCCTTG-3'，其序列如序 列表中SEQ ID NO:2所示。
[0030] 所述前引物和后引物的制備方法為本領(lǐng)域常規(guī)方法，較佳地為全序列合成即得。
[0031] 其中PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序較佳地為：開(kāi)啟熱蓋至100°C;(1)94°C變性4min ;(2)94°C 變性30s，（3) 55?62°C退火45s，（4) 72°C延伸lmin，步驟（2)?（4)進(jìn)行12?20個(gè)循 環(huán)；（5)72 °C延伸8min。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，較佳地還包括：取3μ 1擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%(質(zhì)量體 積比）瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，檢測(cè)產(chǎn)物分布范圍。
[0032] 其中步驟（5)為利用生物素標(biāo)記的SSR探針與文庫(kù)中含有SSR片段的目的片段進(jìn) 行雜交。其中所述SSR探針為常規(guī)探針，所述SSR探針較佳地為5'端修飾有生物素標(biāo)記 的SSR探針。當(dāng)檢測(cè)的目的基因組為黃蓋鰈（Limanda aspera)基因組時(shí)，所述生物素標(biāo)記 的SSR探針較佳地為5'端修飾有生物素標(biāo)記且序列如下的探針的混合物，所述的序列分別 為序列表中 SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID NO:8 和 SEQ ID NO:9 所示，即分別為（AC) 12、（AG) 12、（AAT) 8、（AGG) 8、（AGC) 8、（AGAT) 6 和（ACAG) 6。
[0033] 所述SSR探針優(yōu)選地為5'端修飾有生物素標(biāo)記且序列如下的探針的混合物，所述 的序列分別為序列表中 SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16 和 SEQ ID NO: 17 所示，即分別為（AG) 10、（AC) 10、 (AAC) 8、（AGG) 8、（ACG) 8、（AAG) 8、（ACAT) 6和（ATCT) 6。所述探針組合考慮到了各物種分類(lèi) 中各SSR位點(diǎn)類(lèi)型的豐度情況和各SSR探針之間的兼容性，而且在磁珠富集體系和條件較 優(yōu)化狀態(tài)下該探針組合性能表現(xiàn)更佳。所述SSR探針的制備方法為本領(lǐng)域常規(guī)制備方法， 較佳地為人工合成制備。所述SSR探針合適用于靈長(zhǎng)類(lèi)、其它哺乳類(lèi)、嚙齒類(lèi)、魚(yú)類(lèi)、其它脊 椎動(dòng)物、節(jié)肢動(dòng)物、陸生植物以及真菌等廣泛的物種。
[0034] 所述SSR探針與文庫(kù)中的目的片段雜交的方法為常規(guī)方法，所述雜交的反應(yīng)體 系：擴(kuò)增后的基因組DNA文庫(kù)50 μ 1 (100?500ng);等摩爾混合的SSR探針（SSR探針的 濃度為1〇μΜ)10μ I ;20XSSC30y I ;10%SDSly 1，雜交體系總體積為100μ 1。所得雜交體 系在PCR儀上運(yùn)行雜交程序，該雜交程序較佳地包括以下步驟：開(kāi)啟熱蓋并預(yù)熱至KKTC， 95°C變性IOmin,然后每個(gè)循環(huán)下降2°C，每個(gè)循環(huán)孵育Imin,降至58°C過(guò)夜。I X SSC的配 方為：檸檬酸鈉 15mM，NaC1150mM，pH7. 0。
[0035] 其中步驟（6)為利用鏈霉親和素包被的磁珠對(duì)文庫(kù)中結(jié)合了生物素標(biāo)記的SSR探 針的目的片段進(jìn)行富集。所述磁珠富集的方法為本領(lǐng)域常規(guī)方法，所述磁珠為包被有鏈霉 親和素的磁珠。
[0036] 所述磁珠富集的方法較佳地包括以下步驟：
[0037] (1)準(zhǔn)備磁珠：漩渦混勻包被有鏈霉親和素的磁珠，立即吸取100μ 1,使用 200 μ 16 X SSC withO. 1%SDS洗滌三次，每次1?2min。每次洗滌完畢使用磁力架固定磁珠， 吸除洗滌液，至磁珠光滑。洗滌完成后加入100 μ 16 X SSC withO. 1%SDS，重懸浮備用。
[0038] (2) SSR文庫(kù)富集：將100 μ 1雜交產(chǎn)物從PCR儀中取出，加入準(zhǔn)備好的100 μ 1磁 珠，輕輕吹打混勻。室溫（20?25°C，下同)孵育30min，每5min輕輕混勻一次，防止磁珠落 至管底。
[0039] (3 )SSR文庫(kù)清洗：先將富集體系放至磁力架上，室溫靜置2?3min，吸除上清。使 用200μ 16XSSC withO. 1%SDS洗滌三次，每次室溫孵育10min，磁力架上靜置2min。然后 使用200μ 158°C預(yù)熱的3XSSC withO. 1%SDS洗滌三次，每次58°C孵育15min，磁力架上靜 置2min。然后再使用200μ 16XSSC withO. 1%SDS洗滌三次，每次室溫孵育10min，磁力架 上靜置2min。最后使用200 μ 1超純水或0. IX TE洗滌兩次，直接混勻后在磁力架上靜置 2min，吸除上清。（4) SSR富集文庫(kù)洗脫：向清洗后的磁珠中加入25 μ 1洗脫緩沖液（IOmM Tris-HCl，ρΗ8. 5)，混勻后95°C變性5min，立即放置在磁力架上2min至溶液澄清，吸出上清 留用，重復(fù)一次，將兩次洗脫液混合，得到共約50 μ 1的洗脫產(chǎn)物。
[0040] 其中步驟（7)為以步驟（6)所得的目的片段為模板，利用前引物，其序列如SEQ ID NO: 1所示，和后引物，其序列如SEQ ID NO: 2所示，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，純化PCR擴(kuò)增所得的DNA 片段。
[0041] 其中所述PCR擴(kuò)增的體系為本領(lǐng)域常規(guī)PCR體系，所述PCR擴(kuò)增的體系較佳地包 括：基因組DNA文庫(kù)10?15ng;10XPCR緩沖液5μ1 ;dNTP (2.5mM ea. )4μ1 ;前引物 (10μΜ)2μ I ;后弓I物（10μΜ)2μ I ;DNA聚合酶0· 5μ I ;補(bǔ)充超純水至50μ 1。其中所述前 引物的序列如SEQ ID NO: 1所示，后引物的序列如SEQ ID Ν0:2所示。
[0042] 其中所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序較佳地為：首先開(kāi)啟熱蓋并預(yù)熱至100°C，（1)94°C 變性 4min，（2)94°C變性 30s，（3)58°C退火 45s，（4)72°C延伸 lmin，其中步驟（2)?（4) 共進(jìn)行18個(gè)循環(huán)，（5)72°C延伸8min。
[0043] 其中所述PCR產(chǎn)物純化為本領(lǐng)域常規(guī)純化方法，所述純化較佳地為利用磁珠進(jìn)行 純化。所述磁珠純化的方法較佳地包括以下步驟：向PCR反應(yīng)產(chǎn)物中加入90 μ 1混勻的 AMPure XP Beads (購(gòu)自貝克曼庫(kù)爾特商貿(mào)（中國(guó)）有限公司），混勻后室溫孵育15min，磁力 架上靜置5min后吸除上清。然后使用200 μ 1新鮮配制的80%乙醇清洗兩次，每次室溫孵育 30s，磁力架上靜置至澄清，吸除上清。最后靜置在磁力架上15min至磁珠干燥，加入25 μ 1 洗脫緩沖液（IOmM Tris-HCl，ρΗ8. 5)洗脫兩次，所得洗脫體系共約50μ 1。
[0044] 其中步驟（8)為以步驟（7)所得的純化的DNA片段為模板進(jìn)行乳液PCR擴(kuò)增，將乳 液PCR擴(kuò)增所得序列進(jìn)行測(cè)序。其中所述乳液PCR擴(kuò)增的方法較佳地可參閱Roche公司相 關(guān)操作手冊(cè)《emPCR Amp-Lib L SV Method Manual_XL+_May2011》。其中所述測(cè)序?yàn)楸绢I(lǐng) 域常規(guī)測(cè)序技術(shù)，較佳地為利用各種商用測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序，所述測(cè)序儀優(yōu)選地為：Roche GS FLX+測(cè)序儀。
[0045] 其中步驟（9)為在步驟（8)所得的序列中搜索含有SSR位點(diǎn)序列。所述在搜索含有 SSR位點(diǎn)序列的方法為本領(lǐng)域常規(guī)方法，較佳地為利用各種市售軟件搜索SSR位點(diǎn)，更佳地 為使用MISA軟件在測(cè)序片段中搜索SSR位點(diǎn)，該軟件的參數(shù)較佳地為：definition (unit_ size, min_repeats):1-102-63-54-55-56-5 ; interruptions(max_difference_between_2_ SSRs):100。
[0046] 較佳地，該方法還包括在所得含有SSR位點(diǎn)序列的側(cè)翼序列上設(shè)計(jì)特異性PCR擴(kuò) 增引物的步驟。其中所述特異性PCR擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)方法為常規(guī)方法，較佳地為利用市售 軟件設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物，更佳地為使用PrimeU軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。使用該軟件時(shí)，設(shè)計(jì)參 數(shù)較佳地為：引物設(shè)計(jì)區(qū)域?yàn)橹貜?fù)序列前一個(gè)堿基之前和后五個(gè)堿基之后，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度 在100?400bp之間，其余采用默認(rèn)設(shè)置。
[0047] 在符合本領(lǐng)域常識(shí)的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實(shí) 例。
[0048] 本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。
[0049] 本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于：經(jīng)過(guò)本發(fā)明所述磁珠富集方法處理過(guò)的文庫(kù)，其中 不含重復(fù)序列位點(diǎn)的文庫(kù)片段大大下降，從而使重復(fù)序列位點(diǎn)的檢測(cè)效率大大提高。在此 基礎(chǔ)上，結(jié)合高通量測(cè)序平臺(tái)的文庫(kù)構(gòu)建方式和測(cè)序通量，大幅降低了文庫(kù)構(gòu)建難度，降低 了實(shí)驗(yàn)成本，縮短了實(shí)驗(yàn)周期，同時(shí)由于了測(cè)序通量大幅提高，從而降低了測(cè)序成本。本方 法應(yīng)用范圍廣泛，可作為高通量開(kāi)發(fā)多種物種SSR位點(diǎn)標(biāo)記的有效方法進(jìn)行應(yīng)用。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0050] 圖1為基因組DNA文庫(kù)擴(kuò)增產(chǎn)物示意圖。其中"1"為樣本，"C"為陰性對(duì)照，"M" 為 ladder marker，條帶大小從下到上依次為 100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp。
[0051] 圖2為SSR富集文庫(kù)擴(kuò)增產(chǎn)物示意圖。其中"1"為樣本，"C"為陰性對(duì)照，"Μ" 為 ladder marker，條帶大小從下到上依次為 100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、 700bp、800bp、900bp、lOOObp、1500bp。
[0052] 圖3為一種GT重復(fù)序列。該序列為完美型SSR序列，重復(fù)次數(shù)共12次，微衛(wèi)星序 列位于測(cè)序片段的315bp?318bp之間。
[0053] 圖4為一種GT重復(fù)序列的測(cè)序峰形。其中測(cè)序序列總長(zhǎng)為459bp，重復(fù)序列位于 315bp?338bp之間，測(cè)序信號(hào)正常，序列質(zhì)量好。
[0054] 圖5為一種GT重復(fù)序列及引物設(shè)計(jì)序列。該序列中微衛(wèi)星序列位于測(cè)序片段的 315bp?338bp之間，在它兩側(cè)可以設(shè)計(jì)特異性PCR擴(kuò)增引物，其中前引物位于150bp? 169bp之間，后引物位于428bp?447bp之間，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為298bp。

【具體實(shí)施方式】
[0055] 下面通過(guò)實(shí)施例的方式進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實(shí) 施例范圍之中。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商 品說(shuō)明書(shū)選擇。
[0056] 實(shí)施例1 一種基于磁珠富集法高通量開(kāi)發(fā)黃蓋鰈SSR標(biāo)記的方法
[0057] 1、實(shí)驗(yàn)材料：黃蓋鰈（Limanda aspera)肝臟組織樣品4份。取3條黃蓋鰈，處死 后取肝臟組織，保存于無(wú)水乙醇溶液中，室溫存放。其中混合樣1份，為三個(gè)黃蓋鰈個(gè)體的 等量的肝臟組織混合物，該物種無(wú)參考基因組序列。
[0058] 2、基因組DNA提取：基因組DNA的提取使用天根TIANamp Genomic DNA Kit試劑 盒，具體提取方法參照該試劑盒的使用說(shuō)明書(shū)操作。
[0059] 3、基因組DNA隨機(jī)片段化：具體方法包括以下步驟：
[0060] (1)利用高壓氮?dú)鈱?duì)基因組DNA進(jìn)行片段化：取4μ g的基因組DNA，加入TE緩沖 液至10(^1，加入片段化杯中，然后加入50(^1的片段化溶液（50%甘油，511111^ 8-!1(：1， 0. 5mM EDTA，pH8. 0)，吹打混勻，安裝好片段化裝置。連接高壓氮?dú)馄亢推位b置，施加 0· 35MPa的壓力，持續(xù)5〇s。
[0061] (2)收集片段化裝置中的溶液，使用Axygen AxyPrep PCR Clean-up Kit對(duì)片段化 溶液進(jìn)行過(guò)柱純化，具體純化方法參照該試劑盒的使用說(shuō)明書(shū)。使用20 μ 1的洗脫液洗脫 兩次。
[0062] (3)對(duì)片段化DNA洗脫液進(jìn)行1. 5% (質(zhì)量體積比）的瓊脂糖凝膠電泳，120V電泳 20min。切下 400 ?700bp 范圍的目的片段，使用 Axygen AxyPrep DNA Gel Extraction Kit 對(duì)目的片段進(jìn)行膠回收純化，具體純化方法參照該試劑盒的使用說(shuō)明書(shū)。使用20 μ 1的洗 脫液洗脫。
[0063] 4、構(gòu)建基因組隨機(jī)片段化DNA文庫(kù)：吸取16 μ 1片段化洗脫液，使用Roche GS Rapid Library Prep Kit進(jìn)行基因組DNA文庫(kù)構(gòu)建，具體文庫(kù)構(gòu)建方法參照該試劑盒的使 用手冊(cè)-《Rapid Library Preparation Method Manual_XL+_May2011》。
[0064] 5、基因組DNA文庫(kù)的擴(kuò)增及檢測(cè)，具體方法為：
[0065] (1)配制PCR體系，如表1所示：
[0066] 表 IPCR 體系

【權(quán)利要求】
1. 一種基于磁珠富集法高通量開(kāi)發(fā)基因組SSR標(biāo)記的方法，其特征在于，所述方法包 括下列步驟： (1) 提取目標(biāo)基因組DNA; (2) 將步驟（1)所得基因組DNA隨機(jī)片段化； (3) 構(gòu)建基因組隨機(jī)片段化DNA文庫(kù)； (4) 以步驟（3)所得DNA文庫(kù)為模板，利用前引物，其序列如SEQ ID NO: 1所示，和后引 物，其序列如SEQ ID NO: 2所示，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得文庫(kù)擴(kuò)增片段； (5) 利用生物素標(biāo)記的SSR探針與文庫(kù)中含有SSR位點(diǎn)的目的片段進(jìn)行雜交； (6) 利用鏈霉親和素包被的磁珠對(duì)文庫(kù)中結(jié)合了生物素標(biāo)記的SSR探針的目的片段進(jìn) 行富集； (7) 以步驟（6)所得的目的片段為模板，利用前引物，其序列如SEQ ID N0:1所示，和后 引物，其序列如SEQ ID NO: 2所示，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，純化PCR擴(kuò)增所得的DNA片段； (8) 以步驟（7)所得的純化的DNA片段為模板進(jìn)行乳液PCR擴(kuò)增，將乳液PCR擴(kuò)增所得 序列進(jìn)行測(cè)序； (9) 在步驟（8)所得的序列中搜索含有SSR位點(diǎn)的序列。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（1)所述目標(biāo)基因組DNA是動(dòng)物基因組 DNA、植物基因組DNA或微生物基因組DNA。
3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（2)所述DNA隨機(jī)片段化的方法為高壓 氮?dú)夥?，所述隨機(jī)片段化的方法包括以下步驟：向片段化體系施加〇. 3?0. 4MPa的高壓氮 氣，持續(xù)50?70秒。
4. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（4)所述PCR擴(kuò)增的程序?yàn)椋洪_(kāi)啟熱蓋 至 100°C;(1)94°C變性 4 分鐘；（2)94°C變性 30 秒，（3)55 ?62°C退火 45 秒，（4)72°C延 伸1分鐘，步驟（2)?（4)進(jìn)行12?20個(gè)循環(huán)；（5) 72°C延伸8分鐘。
5. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（5)所述生物素標(biāo)記的SSR探針為5'端 修飾有生物素標(biāo)記且序列如下的探針的混合物，所述的序列分別為序列表中SEQ ID N0:3、 SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8 和 SEQ ID NO:9 所 /Jn 〇
6. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（5)所述生物素標(biāo)記的SSR探針為 5'端修飾有生物素標(biāo)記且序列如下的探針的混合物，所述的序列分別為序列表中SEQ ID NO: 10,SEQ ID NO: IUSEQ ID NO: 12,SEQ ID NO: 13,SEQ ID NO: 14,SEQ ID NO: 15,SEQ ID NO: 16 和 SEQ ID NO: 17 所示。
7. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（6)所述利用鏈霉親和素包被的磁珠對(duì) 文庫(kù)中結(jié)合了生物素標(biāo)記的SSR探針的目的片段進(jìn)行富集的方法包括以下步驟： (1) 準(zhǔn)備磁珠：漩渦混勻包被有鏈霉親和素的磁珠，立即吸取1〇〇μ 1，使用 200 μ 16X SSC withO. 1%SDS洗滌三次，每次1?2分鐘，每次洗滌完畢使用磁力架固定磁 珠，吸除洗滌液，至磁珠光滑，洗滌完成后加入100 μ 16 X SSC withO. 1%SDS，重懸浮備用； (2) SSR文庫(kù)富集：向100 μ 1步驟（5)所得雜交產(chǎn)物中加入準(zhǔn)備好的100 μ 1磁珠，輕 輕吹打混勻，20?25°C孵育30分鐘，每5分鐘輕輕混勻一次，防止磁珠落至管底； (3) SSR文庫(kù)清洗：先將富集體系放至磁力架上，室溫靜置2?3分鐘，吸除上清，使用 200μ 16XSSC withO. 1%SDS洗滌三次，每次20?25°C孵育10分鐘，磁力架上靜置2分鐘， 然后使用200μ 158°C預(yù)熱的3XSSC withO. 1%SDS洗滌三次，每次58°C孵育15分鐘，磁力 架上靜置2分鐘，然后再使用200 μ 16 X SSC withO. 1%SDS洗滌三次，每次20?25°C孵育 lOmin，磁力架上靜置2分鐘；最后使用200 μ 1超純水或0. I X TE洗滌兩次，直接混勻后在 磁力架上靜置2分鐘，吸除上清； (4) SSR富集文庫(kù)洗脫：向清洗后的磁珠中加入25μ 1洗脫緩沖液（IOmM Tri s-HCl，ρΗ8. 5 )，混勻后95 °C變性5分鐘，立即放置在磁力架上2分鐘至溶液澄清，吸出上 清留用，重復(fù)一次，將兩次洗脫液混合，得到共約50 μ 1的洗脫產(chǎn)物。
8. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（7)所述的PCR擴(kuò)增的體系為：結(jié)合了 生物素標(biāo)記的SSR探針的片段10μ I ;10XPCR緩沖液5μ I ;dNTP4y 1 ;前引物2μ 1 ;后引 物2μl;DNA聚合酶0.5μl;加水至50μl，所述前引物序列如SEQIDN0 :l所示，所述后 引物序列如SEQ ID NO: 2所示，所述PCR擴(kuò)增的程序?yàn)椋海?)94°C變性4分鐘，（2)94°C變 性30秒，（3) 55?62°C退火45秒，（4) 72°C延伸1分鐘，步驟（2)?（4)進(jìn)行12?20個(gè) 循環(huán)；（5)72°C延伸10分鐘。
9. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（8)所述測(cè)序是通過(guò)Roche GS FLX+測(cè) 序儀進(jìn)行的。
10. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟（9)所得含有SSR位點(diǎn)序列的側(cè)翼 序列上設(shè)計(jì)特異性PCR擴(kuò)增引物。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104212879SQ201310222359
【公開(kāi)日】2014年12月17日 申請(qǐng)日期:2013年6月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月5日
【發(fā)明者】孫子奎, 陳永燦 申請(qǐng)人:上海派森諾生物科技有限公司