基于隨機(jī)引物條碼技術(shù)建立分析免疫庫譜的方法
【專利摘要】本發(fā)明針對(duì)醫(yī)藥生物技術(shù)，涉及基于引物條碼技術(shù)的高通量測序方法及其用于免疫基因組學(xué)中的研究，具體為基于cDNA分子的標(biāo)記方法的T細(xì)胞受體高通量測序方法，具體包括以下步驟：提取樣本中的RNA，對(duì)RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，得cDNA，根據(jù)所得cDNA設(shè)計(jì)特異性引物，設(shè)計(jì)的特異性引物的下游引物、隨機(jī)條碼和測序接頭以串聯(lián)的方式組成隨機(jī)引物條碼，將所得隨機(jī)引物條碼過量加入所得cDNA分子中，利用隨機(jī)引物條碼中的測序接頭進(jìn)行高通量測序，測序數(shù)據(jù)進(jìn)行VDJ比對(duì)，分析CDR3序列，建立免疫庫譜；本方法降低了PCR擴(kuò)增過程中發(fā)生偏斜和誤差的方法，該方法根據(jù)特定的引物條碼對(duì)應(yīng)的給定的cDNA序列，使得cDNA分子的數(shù)量可以量化。
【專利說明】基于隨機(jī)引物條碼技術(shù)建立分析免疫庫譜的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明針對(duì)醫(yī)藥生物技術(shù)主題，屬于重大疾病的個(gè)體化診療技術(shù)，具體是一種基于條碼技術(shù)的高通量測序方法及其用于免疫基因組學(xué)中的研究。
【背景技術(shù)】
[0002]免疫基因組學(xué)是研究人體主要組織相容性復(fù)合體(MHC)、T細(xì)胞受體(TCR)和抗體的基因組學(xué)，可廣泛用于指導(dǎo)疫苗設(shè)計(jì)、個(gè)體化醫(yī)療等研究。免疫基因組學(xué)的研究中，T細(xì)胞是機(jī)體免疫功能的執(zhí)行者，TCR是T細(xì)胞表面識(shí)別抗原的分子，也是T細(xì)胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答的首個(gè)關(guān)鍵分子。T細(xì)胞在胸腺發(fā)育過程中，T C R通過V (D)J C基因重排和選擇，組成了外周多樣性的T細(xì)胞庫，使其能對(duì)外界各種各樣的抗原產(chǎn)生應(yīng)答。
[0003]T C R的⑶R3受體庫，在上世紀(jì)90年代以來，被廣泛應(yīng)用于機(jī)體生理?xiàng)l件下(T細(xì)胞的進(jìn)化、發(fā)育、分化、增殖、亞群、耐受、衰老等)的基礎(chǔ)研究。分析T C R的C D R 3受體庫，了解初始T細(xì)胞中T C R基因重排的情況，可以用以評(píng)價(jià)機(jī)體初始T細(xì)胞的多樣性，并可分析不同個(gè)體之間的T C R的CDR3受體庫的多樣性，進(jìn)一步研究T細(xì)胞發(fā)生、發(fā)育過程。同一個(gè)體不同年齡階段中樞外周T C R的CDR3受體庫差異，可以應(yīng)用于探討年齡與TC R多樣性的關(guān)系等。在多種情況下，個(gè)體T C R的CDR3庫的綜合基因表達(dá)分析對(duì)評(píng)價(jià)免疫應(yīng)答很有意義，通過研究T C R的CDR3的表達(dá)頻率，篩選克隆性增殖的T細(xì)胞和感染、腫瘤、自身免疫病、器官移植等等的關(guān)系，可為這些疾病的診斷和治療提供基礎(chǔ)和手段。在非T細(xì)胞腫瘤的研究中，可通過T C R的CDR3受體庫來尋找并分析抗腫瘤T細(xì)胞的分子特征，為患者個(gè)體化T細(xì)胞的回收治療和腫瘤疫苗的研制等提供基礎(chǔ)；在成熟的T細(xì)胞腫瘤中，可分析腫瘤T細(xì)胞T C R的⑶R3的組成，為T細(xì)胞腫瘤患者尋找治療靶標(biāo)和殘余病變的診斷等提供方法。同時(shí)動(dòng)態(tài)分析腫瘤病人體內(nèi)T C R的CDR3受體庫的變化情況，可了解腫瘤患者的免疫狀態(tài)和預(yù)后等。
[0004]T細(xì)胞在限制病毒、 細(xì)菌和寄生蟲感染等起到關(guān)鍵作用，T C R的CDR3受體庫的多樣性可能影響了 C T L的殺傷能力并調(diào)控著免疫自穩(wěn)狀態(tài)，通過研究急性和持續(xù)性病毒感染中，不同T C RCDR 3受體庫的產(chǎn)生和維持，追蹤不同的T細(xì)胞亞群，為提高T細(xì)胞在感染狀態(tài)下的應(yīng)答能力奠定基礎(chǔ)。對(duì)自身免疫病患者T C R的CDR3受體庫的全面深入分析，可了解自身應(yīng)答T細(xì)胞是如何打破自身耐受的機(jī)制，同時(shí)，通過自身應(yīng)答T細(xì)胞T CR的CDR3組成的研究，可為個(gè)體化的自身免疫診治提供切實(shí)可行的手段。近年來隨著干細(xì)胞研究的進(jìn)展，自體和異體造血干細(xì)胞移植在越來越多的疾病中得到應(yīng)用。檢測移植供者和受者的T細(xì)胞T C R的⑶R3受體庫，動(dòng)態(tài)監(jiān)測移植后不同時(shí)間段T C R的⑶R3受體庫變化，有助于對(duì)移植患者體內(nèi)移植排斥T細(xì)胞來源及移植后免疫重建的評(píng)估等提供基礎(chǔ)。另外，對(duì)T C R的CDR3受體庫的全面分析，可探討個(gè)體對(duì)疾病的易感性和抵抗性，即某些T C R的CDR3的缺失或高表達(dá)和機(jī)體T細(xì)胞對(duì)特異抗原(不同疾病)應(yīng)答密切相關(guān)。
[0005]DNA條形碼技術(shù)(DNA barcode)是利用生物體DNA中一段保守片段對(duì)物種進(jìn)行快速準(zhǔn)確鑒定的新興技術(shù)，是指生物體內(nèi)能夠代表該物種的，標(biāo)準(zhǔn)的、有足夠變異的、易擴(kuò)增且相對(duì)較短的DNA片段。DNA條形碼已經(jīng)成為生態(tài)學(xué)研究的重要工具，不僅用于物種鑒定，同時(shí)也幫助生物學(xué)家進(jìn)一步了解生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)發(fā)生的相互作用。通常，在發(fā)現(xiàn)一種未知物種或者物種的一部分時(shí)，研究人員便描繪其組織的DNA條形碼，而后與國際數(shù)據(jù)庫內(nèi)的其他條形碼進(jìn)行比對(duì)；如果與其中一個(gè)相匹配，研究人員便可確認(rèn)這種物種的身份。理想的DNAbarcdoing應(yīng)當(dāng)符合下列標(biāo)準(zhǔn):(I)具有足夠的變異性以區(qū)分不同的物種，同時(shí)具有相對(duì)的保守性；(2)必須是一段標(biāo)準(zhǔn)的DNA區(qū)來盡可能鑒別不同的分類群；(3)目標(biāo)DNA區(qū)應(yīng)當(dāng)包含足夠的系統(tǒng)進(jìn)化信息以定位物種在分類系統(tǒng)(科、屬等)中的位置；(4)應(yīng)該是高度保守的引物設(shè)計(jì)區(qū)以便于通用引物的設(shè)計(jì)；(5)目標(biāo)DNA區(qū)應(yīng)該足夠的短以便于有部分降解的DNA的擴(kuò)增。DNA barcoding作為生物“種水平species-level”鑒定的工具引人注目。Genbank數(shù)據(jù)庫中CO I序列正在快速增加。Min等分析了 CO I序列及其來源基因組核苷酸含量之間的關(guān)系，結(jié)果表明849個(gè)CO I基因的5端的DNA barcoding序列令人驚奇地準(zhǔn)確地代表了其來源完整線粒體基因mtDNA的重要信息，也就是說對(duì)于未測序的基因組，從DNAbarcoding能快速預(yù)知完整基因組的組成。
[0006]另外，目前用于免疫基因組研究的高通量測序技術(shù)存在兩個(gè)缺陷:1)建庫過程中的擴(kuò)增偏斜；2)低拷貝數(shù)序列的測序誤差較大。針對(duì)以上問題，申請(qǐng)者建立了一種新的基于條碼技術(shù)的高通量測序技術(shù)。
[0007]本發(fā)明是基于上述現(xiàn)有技術(shù)，并針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足進(jìn)行改進(jìn)發(fā)明的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]有鑒于此，本發(fā)明提供一種隨機(jī)引物條碼標(biāo)記cDNA分子的方法，并提供基于方法下的T細(xì)胞受體高通量測序方法；用上述方法建立免疫庫譜效率高，誤差小。
[0009]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為:
[0010]cDNA分子的標(biāo)記方法，在cDNA兩端加入過量的隨機(jī)弓I物條碼，使cDNA分子兩端各標(biāo)記對(duì)應(yīng)的隨機(jī)引物條碼 。
[0011]用所述的標(biāo)記方法獲得的cDNA分子。
[0012]進(jìn)一步，所述的cDNA分子，所述隨機(jī)引物條碼由根據(jù)cDNA分子設(shè)計(jì)的特異性引物的下游引物、隨機(jī)條碼和測序接頭以串聯(lián)的方式組成。
[0013]基于cDNA分子的標(biāo)記方法的T細(xì)胞受體高通量測序方法，具體包括以下步驟:
[0014]I)提取樣本中的RNA;
[0015]2)對(duì)RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，得cDNA;
[0016]3)根據(jù)所得cDNA設(shè)計(jì)特異性引物，設(shè)計(jì)的特異性引物的下游引物、隨機(jī)條碼和測序接頭以串聯(lián)的方式組成隨機(jī)引物條碼；
[0017]4)將所得隨機(jī)引物條碼過量加入步驟2)所得cDNA分子中；
[0018]5)利用隨機(jī)引物條碼中的測序接頭進(jìn)行高通量測序，測序數(shù)據(jù)進(jìn)行VDJ比對(duì)，分析CDR3序列。
[0019]進(jìn)一步，步驟I)中的樣本源自被病原感染后不同階段的患者。
[0020]更進(jìn)一步，步驟I)中的樣本源自被乙肝病毒感染后不同階段的患者。
[0021]進(jìn)一步，根據(jù)分析同一樣本的CDR3序列的結(jié)果，得到單個(gè)完整的免疫庫譜。
[0022]進(jìn)一步，根據(jù)分析不同樣本的CDR3序列的結(jié)果，得到多個(gè)集合的完整的免疫庫P曰。
[0023]更進(jìn)一步，所述免疫庫譜為慢性乙型肝炎免疫庫譜。
[0024]進(jìn)一步,步驟3)中的測序接頭與Illumina的平臺(tái)兼容。
[0025]本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明涉及的方法降低PCR擴(kuò)增過程中發(fā)生偏斜和誤差的方法。在獲得PCR擴(kuò)增的cDNA文庫時(shí)，使用帶有隨機(jī)序列作為條碼的特異性下游引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，因而每個(gè)cDNA模板得到一個(gè)唯一的條碼序列，經(jīng)過PCR擴(kuò)增，深度測序，然后通過計(jì)算原樣品中的獨(dú)特的條形碼序列的數(shù)目，以及該特定條碼對(duì)應(yīng)的給定的cDNA序列，使得cDNA分子的數(shù)量可以量化。
【具體實(shí)施方式】
[0026]以下將對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)描述。優(yōu)選實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版，J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，科學(xué)出版社，2002年)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件進(jìn)行。
[0027]一慢性乙肝患者樣本選取
[0028](I)選取慢性乙肝輕度 患者一名:癥狀較輕、較少，如輕度乏力、輕度腹脹、輕度肝區(qū)不適等，肝功能有損傷。轉(zhuǎn)氨酶在3倍(正常值為40單位)，膽紅素在2倍正常值左右(正常值為17.1微摩爾/升)，白蛋白大于或等于35克/升(正常值為35-55克/升)。
[0029](2)選取慢性乙肝中度一名:癥狀和體征及肝功能改變介于輕度和重度之間。轉(zhuǎn)氨酶超過正常值的3倍，膽紅素超過正常值的4倍、白蛋白在35克/升之間。
[0030](3)選取慢性乙肝重度一名:有明顯或持續(xù)的肝炎癥狀，如乏力、食欲差、腹脹、便溏、尿黃、肝區(qū)疼痛、面色灰暗、肝掌、蜘蛛痣等，肝功能損傷較重，轉(zhuǎn)氨酶超過正常值5倍，膽紅素超過正常值5倍，白蛋白等于32克/升。
[0031]二樣本總RNA提取
[0032]1.從陽性病人全血中提取總RNA
[0033]取_70°C保存的全血冰上融化，取3ml加入15ml離心管，加入6mlTRNzol_A+，3ml三氯甲燒，充分顛倒混勻5分鐘。10，OOOg離心10分鐘,吸取上清約2.5ml加入新15ml離心管，加入2.5ml異丙醇和250 μ I醋酸鈉，顛倒混勻后放置冰上I小時(shí)。10，OOOg離心20分鐘，沉淀用70%乙醇洗滌2次后37°C烘干，加50 μ I TE溶解并轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管。測定提取總RNA的0D260值。根據(jù)陽性全血樣本2份共約120ml左右，補(bǔ)充訂購200mlTRNzol-A+總RNA提取試劑，50ml除RNase螺口高速離心管，按預(yù)實(shí)驗(yàn)步驟，分3批次，每次提取40ml全血RNA。
[0034]三.逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA分子
[0035]主要試劑為M-MLV Reverse Transcriptase (CatN0.:28025-013，Invtrogen 公司)，01igOtex? mRNA Mini Kits (CatN0.: 70022，Qiagen 公司)，DNA 純化試劑盒(Roche
公司)。按照Oligotex? mRNA Mini Kits試劑盒說明書，將總共24.1 μ g的總RNA抽提純
化得到mRNA。以純化的mRNA為模板，根據(jù)設(shè)計(jì)的特異性引物，設(shè)計(jì)得到9段cDNA分子。
[0036]四.隨機(jī)引物條碼的制備
[0037]測序接頭來自Illumina的平臺(tái)提供的序列，由博奧生物公司提供。根據(jù)上述設(shè)計(jì)得到9段cDNA分子，設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)的特異性引物，利用分別的下游引物、隨機(jī)條碼和測序接頭以串聯(lián)的方式組成隨機(jī)引物條碼。將隨機(jī)引物條碼與設(shè)計(jì)得到9段cDNA分子各自的兩末端連接，得9段被隨機(jī)引物條碼標(biāo)記的cDNA分子。)利用隨機(jī)引物條碼中的測序接頭進(jìn)行，利用Illumina的平臺(tái)高通量測序，測序數(shù)據(jù)進(jìn)行VDJ比對(duì)，分析CDR3序列。得到單個(gè)完整的免疫庫譜和集合免疫庫譜。
[0038]最后說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的宗旨和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范 圍當(dāng)中。
【權(quán)利要求】
1.CDNA分子的標(biāo)記方法，其特征在于:在CDNA兩端加入過量的隨機(jī)引物條碼，使cDNA分子兩端各標(biāo)記對(duì)應(yīng)的隨機(jī)引物條碼。
2.用權(quán)利要求1所述的標(biāo)記方法獲得的cDNA分子。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的cDNA分子，其特征在于:所述隨機(jī)引物條碼由根據(jù)cDNA分子設(shè)計(jì)的特異性引物的下游引物、隨機(jī)條碼和測序接頭以串聯(lián)的方式組成。
4.基于cDNA分子的標(biāo)記方法的T細(xì)胞受體高通量測序方法，其特征在于，具體包括以下步驟:1)提取樣本中的RNA;2)對(duì)RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，得cDNA;3)根據(jù)所得cDNA設(shè)計(jì)特異性引物，設(shè)計(jì)的特異性引物的下游引物、隨機(jī)條碼和測序接頭以串聯(lián)的方式組成隨機(jī)引物條碼；4)將所得隨機(jī)引物條碼過量加入步驟2)所得cDNA分子中；5)利用隨機(jī)引物條碼中的測序接頭進(jìn)行高通量測序，測序數(shù)據(jù)進(jìn)行VDJ比對(duì)，分析CDR3序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基于cDNA分子的標(biāo)記方法的T細(xì)胞受體高通量測序方法，其特征在于:步驟I)中的樣·本源自被病原感染后不同階段的患者。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的基于cDNA分子的標(biāo)記方法的T細(xì)胞受體高通量測序方法，其特征在于:步驟I)中的樣本源自被乙肝病毒感染后不同階段的患者。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的基于cDNA分子的標(biāo)記方法的T細(xì)胞受體高通量測序方法，其特征在于:根據(jù)分析同一樣本的CDR3序列的結(jié)果，得到單個(gè)完整的免疫庫譜。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的基于cDNA分子的標(biāo)記方法的T細(xì)胞受體高通量測序方法，其特征在于:根據(jù)分析不同樣本的CDR3序列的結(jié)果，得到多個(gè)集合的完整的免疫庫譜。
9.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的基于cDNA分子的標(biāo)記方法的T細(xì)胞受體高通量測序方法，其特征在于:所述免疫庫譜為慢性乙型肝炎免疫庫譜。
10.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基于cDNA分子的標(biāo)記方法的T細(xì)胞受體高通量測序方法，其特征在于:步驟3)中的所述測序接頭與Illumina的平臺(tái)兼容。
【文檔編號(hào)】C12N15/10GK103436523SQ201310230809
【公開日】2013年12月11日 申請(qǐng)日期:2013年6月9日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月9日
【發(fā)明者】尚小云, 吳玉章, 董惠, 王昊亮 申請(qǐng)人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)