烏賊內(nèi)臟酶解制備高抗氧化活性多肽的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種烏賊內(nèi)臟酶解制備高抗氧化活性多肽的方法，將烏賊內(nèi)臟組織搗碎，按1:3-5（m/v）的料液比加水勻漿，調(diào)節(jié)pH值至7.0-8.0，加入胰蛋白酶在溫度35℃-45℃下水解5-7h得酶解液，滅酶，離心，取上清液，經(jīng)超濾杯截取分子量≤5KD的多肽，冷凍干燥后，得高抗氧化活性多肽。本發(fā)明能有效利用烏賊加工的廢棄物，提高附加值，增加經(jīng)濟效益，且酶解反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)時間短、效率高，反應(yīng)過程易控制，通過本發(fā)明的方法能夠獲得具有很好抗氧化性的天然多肽，可以替代人工合成的抗氧化劑使用，毒副作用小。
【專利說明】烏賊內(nèi)臟酶解制備高抗氧化活性多肽的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及海洋生物活性物質(zhì)提取【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種烏賊內(nèi)臟酶解制備高抗氧化活性多肽的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]烏賊俗稱墨魚，屬軟體動物門、頭足綱、烏賊科，是我國四大經(jīng)濟魚類之一，據(jù)統(tǒng)計，僅2009年年捕撈量已超過20萬t (?？姑溃瑓浅Ｎ?曼氏無針烏賊的增值開發(fā)與利用的研究進展[J].中國水產(chǎn)，2008，30(2):55-58)。烏賊具有較高的食用和藥用價值，全身是寶，眾多學者對于烏賊肉、烏賊墨和烏賊骨的抗衰老、抗菌、抗腫瘤、提高免疫力等作用已有研究。烏賊內(nèi)臟是烏賊精深加工的廢棄品，常被加工成烏賊內(nèi)臟粉應(yīng)用于漁用飼料中(劉智禹，江琴.烏賊內(nèi)臟粉的營養(yǎng)價值及其安全性研究[J].福建農(nóng)業(yè)學報，2005,20(4):271-274)。但烏賊內(nèi)臟富含蛋白質(zhì)、多不飽和脂肪酸等營養(yǎng)成分，一種優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)資源，且氨基酸比例較為均衡(董亞輝，李和生，何燕飛，等.雙酶協(xié)同水解烏賊內(nèi)臟的工藝條件研究[J].中國釀造，2011，226:136-140)。然而其內(nèi)在的生物活性未被充分利用，造成蛋白質(zhì)資源的大量浪費，附加值低下。
[0003]在機體的新陳代謝過程中，可產(chǎn)生02_、H202、R00和-OH等自由基，體內(nèi)自由基的積聚可導致脂質(zhì)的過氧化，進而破壞細胞膜引起細胞的損傷致人體疾病發(fā)生。因此，清除體內(nèi)過剩的自由基是防御疾病發(fā)生的重要途徑。由于人工合成的抗氧化劑BHA、BHT、PC等具有毒副作用，人們將目光轉(zhuǎn)向天然產(chǎn)物，從海洋生物中提取抗氧化肽成為學者的研究熱點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種烏賊內(nèi)臟酶解制備高抗氧化活性多肽的方法，能有效利用烏賊加工的廢棄物，提高附加值，增加經(jīng)濟效益，且酶解反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)時間短、效率高，反應(yīng)過程易控制，通過 本發(fā)明的方法能夠獲得具有很好抗氧化性的天然多肽，可以替代人工合成的抗氧化劑使用，毒副作用小。
[0005]本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是:
一種烏賊內(nèi)臟酶解制備高抗氧化活性多肽的方法，將烏賊內(nèi)臟組織搗碎，按1:3-5(m/v)的料液比加水勻漿，調(diào)節(jié)pH值至7.0-8.0，加入胰蛋白酶在溫度35°C _45°C下水解5_7h得酶解液，滅酶，離心，取上清液，經(jīng)超濾杯截取分子量< 5KD的多肽，冷凍干燥后，得高抗氧化活性多肽。
[0006]烏賊內(nèi)臟作為烏賊加工過程中的低值品一直未被很好利用，本發(fā)明采用烏賊精深加工的廢棄品烏賊內(nèi)臟作為原料進行開發(fā)，采用酶解法，針對烏賊內(nèi)臟的特性開發(fā)設(shè)計了具體的酶解工藝，包括采用胰蛋白酶，控制酶解溫度35°C _45°C，酶解時間5-7h等，這樣能夠有效提取出烏賊內(nèi)臟內(nèi)存在的抗氧化活性物質(zhì)，最終經(jīng)過超濾控制截取分子量< 5KD得到高抗氧化性的多肽，這樣能有效利用烏賊加工的廢棄物，提高附加值，增加經(jīng)濟效益，且酶解反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)時間短、效率高，反應(yīng)過程易控制，通過本發(fā)明的方法能夠獲得具有很好抗氧化性的天然多肽，可以替代人工合成的抗氧化劑使用，毒副作用小。
[0007]
作為優(yōu)選，所述烏賊內(nèi)臟為取自雌烏賊的纏卵腺和卵巢。不是所有烏賊內(nèi)臟都能提取到本發(fā)明所需的高抗氧化性多肽，烏賊內(nèi)臟包括雌烏賊的纏卵腺和卵巢，只有從雌烏賊的纏卵腺和卵巢才能提取得到所需的高抗氧化性多肽。
[0008]作為優(yōu)選，胰蛋白酶用量為:每克烏賊內(nèi)臟用4000-5000U?？刂埔鹊鞍酌赣昧繛槊靠藶踬\內(nèi)臟用4000-5000U，這樣水解效果好。
[0009]作為優(yōu)選，滅酶為90_95°C下加熱10_15min。
[0010]作為優(yōu)選，經(jīng)超濾杯截取3KD <分子量< 5KD的多肽，冷凍干燥后，得高抗氧化活性多肽。3KD <分子量< 5KD的多肽，其抗氧化活性最高。
[0011]本發(fā)明的有益效果是:能有效利用烏賊加工的廢棄物，提高附加值，增加經(jīng)濟效益，且酶解反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)時間短、效率高，反應(yīng)過程易控制，通過本發(fā)明的方法能夠獲得具有很好抗氧化性的天然多肽，可以替代人工合成的抗氧化劑使用，毒副作用小。 【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1是溫度對ANN含量的影響。
[0013]圖2是時間對ANN含量的影響。
[0014]圖3是加酶量對ANN含量的影響。
[0015]圖4是pH對ANN含量的影響。
[0016]圖5是不同分子量多肽對羥自由基的清除率。
[0017]圖6是不同分子量多肽對DPPH的清除率。
[0018]圖7是不同分子量多肽還原力值。
【具體實施方式】
[0019]下面通過具體實施例，并結(jié)合附圖，對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步的具體說明。
[0020]本發(fā)明中，若非特指，所采用的原料和設(shè)備等均可從市場購得或是本領(lǐng)域常用的。下述實施例中的方法，如無特別說明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。
[0021]實施例:
I材料與儀器
1.1材料
新鮮雌烏賊內(nèi)臟購自舟山本地農(nóng)貿(mào)市場，取纏卵腺和卵巢進行實驗。胰蛋白酶購自北京亞太恒信生物科技有限公司；鄰二氮菲、DPPH、鐵氰化鉀購自上海晶純試劑有限公司；其余試劑均為分析純購置國藥集團化學試劑有限公司。
[0022]1.2主要儀器
BSA124S型電子天平(德國Sartorius AG公司)；高速組織搗碎機(上海比朗公司)；CF16RXII高速冷凍離心機(日本HITACHI公司)；SSW型微電腦電熱恒溫槽(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);UV1600PC紫外分光光度計(上海美譜達有限公司);MSC300超濾杯及超濾膜(上海摩速科學器材有限公司)
2方法和結(jié)果將烏賊內(nèi)臟(雌烏賊的纏卵腺和卵巢)組織搗碎，按1:3-5 (m/v即質(zhì)量體積比:g/ml)的料液比加水勻衆(zhòng)，調(diào)節(jié)pH值至7.0-8.0，加入胰蛋白酶(胰蛋白酶用量為:每克烏賊內(nèi)臟用4000-5000U)在溫度35°C -45°C下水解5-7h得酶解液，滅酶(90-95°C下加熱10_15min)，離心，取上清液，經(jīng)超濾杯截取分子量≤5KD的多肽，冷凍干燥后，得高抗氧化活性多肽。
[0023]水解度的測定、羥自由基清除率的測定、DPPH自由基清除活性測定和還原力的測定均參照文獻(郁迪，許新建，楊最素，等.菲律賓蛤仔木瓜蛋白酶水解物抗氧化活性研究[J].浙江海洋學院學報自然科學版，2011，30(6):515-519)方法進行。
[0024]2.1單因素實驗
選用胰蛋白酶，考慮到酶解溫度、酶解時間，加酶量和溶液PH四個因素，實驗分四組進行，每組均取相同量(IOg)的烏賊內(nèi)臟勻漿液5份，比較胰蛋白酶在不同水解條件下的水解度，從而確定胰蛋白酶比較適合的水解條件范圍。
[0025]酶解工藝流程如下:
雌烏賊內(nèi)臟(纏卵腺和卵巢)組織搗碎一勻漿一lmol/L氫氧化鈉調(diào)pH值一加酶后水解—滅酶一離心(10000r/min，15min)—上清液定容一氨基氮含量(AAN)測定。
[0026]實驗一:溫度單因素:調(diào)pH至7.5，加5000u/g的酶，在不同溫度下(30°C，35°C，40。。，45。。，50。。)酶解 5h。
[0027]實驗二:時間單因素:調(diào)pH至7.5，加5000u/g的酶，在40°C下恒溫酶解不同時間(3 h,4h,5h,6h,7h)0
[0028]實驗三:加酶量單因素:調(diào)pH至7.5，加入不同量(3000u/g，3500u/g，4000 u/g，4500u/g,5000u/g)的酶，在40°C下恒溫酶解5h。
[0029]實驗四巾11值單因素:不同？11值(6.0，6.5，7.0，7.5，8)，加入5000μ/g的酶，在40°C下恒溫酶解5h。
[0030]為了確定胰蛋白酶比較適合的水解條件范圍，本試驗以水解物的ANN生成量為指標，對每個因素分別進行試驗，結(jié)果見圖1-4。
[0031]從圖1-4中可知，當溫度位于35°C-45°C之間時、水解時間在5_7h之間、pH在
7.0-8.0時、加酶量位于4000-5000 u/g時時水解效果較好，得到的游離ANN量最多。
[0032]2.2正交實驗
在經(jīng)過單因素實驗確定較佳實驗條件范圍后，選擇酶解溫度、PH值、時間和加酶量四個因素設(shè)計三水平(L9 (34))正交試驗，以確定最佳酶解工藝。正交試驗結(jié)果見表1。用羥自由基清除率來評價不同水解條件下的抗氧化活性。
【權(quán)利要求】
1.一種烏賊內(nèi)臟酶解制備高抗氧化活性多肽的方法，其特征在于:將烏賊內(nèi)臟組織搗碎，按1:3-5 (m/v)的料液比加水勻漿，調(diào)節(jié)pH值至7.0-8.0，加入胰蛋白酶在溫度350C _45°C下水解5-7h得酶解液，滅酶，離心，取上清液，經(jīng)超濾杯截取分子量< 5KD的多肽，冷凍干燥后，得高抗氧化活性多肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的烏賊內(nèi)臟酶解制備高抗氧化活性多肽的方法，其特征在于:所述烏賊內(nèi)臟為取自雌烏賊的纏卵腺和卵巢。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的烏賊內(nèi)臟酶解制備高抗氧化活性多肽的方法，其特征在于:胰蛋白酶用量為:每克烏賊內(nèi)臟用4000-5000U。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的烏賊內(nèi)臟酶解制備高抗氧化活性多肽的方法，其特征在于:滅酶為90-95°C下加熱10-15min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的烏賊內(nèi)臟酶解制備高抗氧化活性多肽的方法，其特征在于:經(jīng)超濾杯截取 3KD <分子量< 5KD的多肽，冷凍干燥后，得高抗氧化活性多肽。
【文檔編號】C12P21/06GK103451257SQ201310236326
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年6月17日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月17日
【發(fā)明者】楊最素, 葉叢林, 丁國芳, 徐律, 李 榮, 黃芳芳 申請人:浙江海洋學院