篩選具有將大量存在的人參皂苷轉(zhuǎn)化為稀有人參皂苷的能力的菌株的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種篩選具有將大量存在的人參皂苷轉(zhuǎn)化為稀有人參皂苷的能力的菌株的方法。本發(fā)明提供的方法包括如下步驟：（1）將基因甲插入表達(dá)質(zhì)粒后轉(zhuǎn)化宿主菌，得到野生菌；將基因甲作為模板進(jìn)行易錯(cuò)PCR，將易錯(cuò)PCR的產(chǎn)物插入表達(dá)質(zhì)粒后轉(zhuǎn)化所述宿主菌，得到的所有單菌落組成突變菌株庫(kù)；基因甲為已知的具有將大量存在的人參皂苷轉(zhuǎn)化為稀有人參皂苷的能力的蛋白質(zhì)的編碼基因；（2）將野生菌和突變菌株庫(kù)中的每個(gè)菌分別進(jìn)行培養(yǎng)并收集發(fā)酵產(chǎn)物；（3）將所述發(fā)酵產(chǎn)物作用于所述大量存在的人參皂苷，得到反應(yīng)液；（4）采用DNS法篩選；（5）進(jìn)行（a）和/或（b）；（a）薄層層析；（b）HPLC。本發(fā)明具有高效、快速、具有高通量等優(yōu)點(diǎn)。
【專利說(shuō)明】篩選具有將大量存在的人參皂苷轉(zhuǎn)化為稀有人參皂苷的能 力的菌株的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種篩選具有將大量存在的人參皂苷轉(zhuǎn)化為稀有人參皂苷的能力的 菌株的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 人參是傳統(tǒng)的中醫(yī)藥材。據(jù)現(xiàn)代藥理研究報(bào)道，人參具有增強(qiáng)人體免疫力，改善營(yíng) 養(yǎng)、抗衰老和減緩疲勞等功效。研究發(fā)現(xiàn)一些稀有人參皂苷(如人參皂苷Rg 3、人參皂苷Rh2、 人參阜苷Compound K等）具有高生物活性，更易于被人體吸收，具有促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞衰 亡、遏制腫瘤擴(kuò)散或惡化等醫(yī)療功效，有較高的生產(chǎn)價(jià)值和應(yīng)用前景。
[0003] 稀有人參阜苷在天然的人參提取物中含量較低或者不存在。體外制備稀有人參 皂苷的方法通常有化學(xué)法和生物轉(zhuǎn)化法，主要是將大量存在的人參皂苷成分(如人參皂苷 Rbi、人參皂苷Rb2等）的特定位點(diǎn)的葡萄糖基或阿拉伯糖基等水解除去，從而生成稀有人參 皂苷。化學(xué)法(如酸水解或堿水解)催化缺乏專一性，終產(chǎn)物合成效率很低。生物轉(zhuǎn)化法(特 別是酶法）不僅反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)專一性強(qiáng)，而且得率較高、污染小，因此成為稀有人參皂 苷工業(yè)化生產(chǎn)的發(fā)展方向?，F(xiàn)有的生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)稀有人參皂苷的方法的轉(zhuǎn)化效率尚需要進(jìn) 一步提高，才能滿足工業(yè)生產(chǎn)的需求。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種篩選具有將大量存在的人參皂苷轉(zhuǎn)化為稀有人參皂苷 的能力的菌株的方法。
[0005] 本發(fā)明提供了一種篩選具有將大量存在的人參皂苷轉(zhuǎn)化為稀有人參皂苷的能力 的菌株的方法，包括如下步驟：
[0006] (1)將基因甲插入表達(dá)質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)后轉(zhuǎn)化宿主菌，得到野生菌；將基因甲 或含有所述基因甲的質(zhì)粒作為模板并將所述基因甲作為靶區(qū)域進(jìn)行易錯(cuò)PCR，將所述易錯(cuò) PCR的產(chǎn)物插入所述表達(dá)質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)后轉(zhuǎn)化所述宿主菌，得到的所有單菌落組成突 變菌株庫(kù)；所述基因甲為已知的具有將大量存在的人參皂苷轉(zhuǎn)化為稀有人參皂苷的能力的 蛋白質(zhì)的編碼基因；
[0007] (2)將野生菌和突變菌株庫(kù)中的每個(gè)菌分別進(jìn)行培養(yǎng)并收集發(fā)酵產(chǎn)物；
[0008] (3)將所述發(fā)酵產(chǎn)物作用于所述大量存在的人參皂苷，得到反應(yīng)液；
[0009] (4)采用DNS法檢測(cè)步驟（3)得到的反應(yīng)液中的還原糖含量，測(cè)量0D54(lnm吸光值； 對(duì)于突變菌株庫(kù)中的每個(gè)菌來(lái)說(shuō)，如果某個(gè)菌進(jìn)行步驟（3)得到的反應(yīng)液的0D 54tol吸光值 大于野生菌進(jìn)行步驟（3)得到的反應(yīng)液的0D54(tam吸光值，該菌株即為本步驟篩選得到的菌 株；
[0010] (5)進(jìn)行（a)和 / 或（b);
[0011] (a)將野生菌和步驟（4)篩選得到的菌株進(jìn)行步驟（3)得到的反應(yīng)液進(jìn)行薄層層 析；對(duì)于步驟（4)篩選得到的菌株來(lái)說(shuō)，如果某個(gè)菌進(jìn)行步驟（3)得到的反應(yīng)液中稀有人參 皂苷的含量高于野生菌進(jìn)行步驟（3)得到的反應(yīng)液中稀有人參皂苷的含量，該菌株即為本 步驟篩選得到的菌株；
[0012] (b)將野生菌和步驟（4)篩選得到的菌株進(jìn)行步驟（2)得到的發(fā)酵產(chǎn)物作用于所 述大量存在的人參皂苷，然后用有機(jī)溶劑抽提，然后進(jìn)行HPLC ;對(duì)于步驟（4)篩選得到的菌 株來(lái)說(shuō)，如果某個(gè)菌進(jìn)行步驟（2)得到的發(fā)酵產(chǎn)物作用于所述大量存在的人參皂苷后稀有 人參皂苷的產(chǎn)量高于野生菌進(jìn)行步驟（2)得到的發(fā)酵產(chǎn)物作用于所述大量存在的人參皂苷 后稀有人參皂苷的產(chǎn)量，該菌株即為本步驟篩選得到的菌株。
[0013] 所述大量存在的人參皂苷具體可為人參皂苷Rbi。
[0014] 所述稀有人參皂苷具體可為人參皂苷compound K。
[0015] 所述基因甲可為編碼β -糖苷酶的基因。所述基因甲具體可為編碼硫磺礦硫化葉 菌的β-糖苷酶的基因。所述基因甲具體可為編碼序列表的序列1所示蛋白質(zhì)的基因。所 述基因甲具體可如序列表的序列2所示。
[0016] 所述表達(dá)質(zhì)粒具體可為pET-28a(+)載體。所述宿主菌具體可為大腸桿菌BL21 (DE3)。
[0017] 所述步驟（2)中，所述"培養(yǎng)"的方法具體如下：在培養(yǎng)體系中加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)。 所述步驟（2)中，所述"培養(yǎng)"的方法具體如下：簽挑取單菌落至800μ 1含50μ g/mL卡那 霉素的LB液體培養(yǎng)基，37°C、750rpm振蕩培養(yǎng)24h，得到種子液；將5 μ 1所述種子液轉(zhuǎn)接入 800 μ 1含50 μ g/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基，加入誘導(dǎo)劑IPTG至其濃度為0. ImM，然后在 30°C、750rpm振蕩培養(yǎng)24h (此時(shí)0D6(l(lnm約為2. 5)。所述步驟（2)中，所述"發(fā)酵產(chǎn)物"為整 個(gè)發(fā)酵體系、發(fā)酵上清或菌體破碎液。所述菌體破碎液菌體可為將所述發(fā)酵體系中的菌體 進(jìn)行破壁后得到的上清液。所述菌體破碎液具體可按如下方法制備：取完成所述培養(yǎng)的整 個(gè)的發(fā)酵體系，離心(離心條件具體可為3000g、10min)并收集菌體，將菌體置于-80°C放置 30min后室溫融化，隨后加入300 μ 1濃度為10mg/ml的溶菌酶溶液(溶劑具體可為pH8. 0、 50mM的Tris-HCl緩沖液)，37°C、750rpm振蕩反應(yīng)lh，3000g離心lOmin并收集上清液，即 為菌體破碎液。
[0018] 所述步驟（3)中，所述"將所述發(fā)酵產(chǎn)物作用于所述大量存在的人參皂苷"的方法 如下：將所述發(fā)酵產(chǎn)物和含有大量存在的人參皂苷的溶液混勻，85°C靜置30min后即刻置 于冰上冷卻。具體可將100 μ 1所述菌體破碎液與200 μ 1含有l(wèi)mg/ml人參皂苷Rh的溶液 (溶劑具體可為PH5. 5的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，其中磷酸氫二鈉濃度為200mM、檸檬 酸濃度為l〇〇mM)混勻。
[0019] 所述步驟（4)中，所述"采用DNS法檢測(cè)步驟（3)得到的反應(yīng)液中的還原糖含量" 的方法如下：在步驟（3)得到的反應(yīng)液中加入900μ 1 DNS溶液，85°C水浴靜置7min顯色。
[0020] 所述（a)中，所述薄層層析的展層劑如下：氯仿：甲醇：水=8:2:0. 1 (體積比)。人 參阜苷 compound K 的 Rf 值=0· 85。
[0021] 所述（b)中，所述有機(jī)溶劑可為正丁醇。所述（b)中，所述"將野生菌和步驟（4) 篩選得到的菌株進(jìn)行步驟（2)得到的發(fā)酵產(chǎn)物作用于所述大量存在的人參皂苷，然后用有 機(jī)溶劑抽提"的方法具體如下：將5〇 μ 1所述菌體破碎液、10〇μ 1含10mg/ml的人參皂苷 Rh的溶液（溶劑具體可為pH5. 5的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，其中磷酸氫二鈉濃度為 200mM、檸檬酸濃度為lOOmM)混合，80°C靜置20min，然后用正丁醇抽提并收集有機(jī)相。所 述（b)中，所述HPLC的參數(shù)如下：C18柱；洗脫液為乙腈或乙腈與水的混合液；洗脫過(guò)程：第 0-20min，乙腈在洗脫液中所占的體積百分?jǐn)?shù)由30%線性上升至40% ;第20-35min，乙腈在洗 脫液中所占的體積百分?jǐn)?shù)由40%線性上升至100% ;第35-40min，乙腈在洗脫液中所占的體 積百分?jǐn)?shù)為100% ;第40-45min，乙腈在洗脫液中所占的體積百分?jǐn)?shù)為30%。所述HPLC中的 流速具體可為1. 〇ml/min。人參阜苷compound K的峰值對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間為29. 766min。
[0022] 所述（a)和所述（b)可以為并列的關(guān)系，即僅進(jìn)行其中之一；也可以為相互驗(yàn)證的 關(guān)系，即如果所述（a)和所述（b)中篩選得到同一菌株，該菌株可以進(jìn)一步確認(rèn)為具有將大 量存在的人參皂苷轉(zhuǎn)化為稀有人參皂苷的能力的菌株。
[0023] 本發(fā)明還保護(hù)以上任一所述方法在篩選具有將大量存在的人參皂苷轉(zhuǎn)化為稀有 人參皂苷的能力的蛋白質(zhì)中的應(yīng)用。所述應(yīng)用的方法具體如下：采用以上任一所述方法篩 選具有將大量存在的人參皂苷轉(zhuǎn)化為稀有人參皂苷的能力的菌株，然后將篩選得到的菌株 提取質(zhì)粒并對(duì)其中基因甲對(duì)應(yīng)的區(qū)域進(jìn)行測(cè)序，得到與所述基因甲對(duì)應(yīng)的突變基因序列， 所述突變基因編碼的蛋白質(zhì)即為目的蛋白。
[0024] 為了高效快速地篩選轉(zhuǎn)化稀有人參皂苷的生物催化劑，有必要建立高通量篩選平 臺(tái)，提高篩選效率，以期快速、有效的獲得新型轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。本發(fā)明提供的方法為由檢測(cè)還原 糖入手的稀有人參皂苷生物轉(zhuǎn)化體系的高通量篩選方法，輔之以薄層層析、高壓液相色譜 定性定量檢測(cè)產(chǎn)物生成量的操作方法。本發(fā)明不僅可應(yīng)用本文實(shí)施案例中突變文庫(kù)的篩 選，還可應(yīng)用于其他催化合成稀有人參皂苷的生物催化系統(tǒng)的篩選，如環(huán)境微生物篩選、環(huán) 境基因組文庫(kù)篩選、發(fā)酵條件優(yōu)化篩選等。
[0025] 本發(fā)明還保護(hù)另一種篩選具有將大量存在的人參皂苷轉(zhuǎn)化為稀有人參皂苷的能 力的菌株的方法，包括如下步驟：
[0026] ( 1)將野外采集的菌株進(jìn)行培養(yǎng)并收集發(fā)酵產(chǎn)物；
[0027] (2)將所述發(fā)酵產(chǎn)物作用于所述大量存在的人參皂苷，得到反應(yīng)液；
[0028] (3)采用DNS法檢測(cè)步驟（2)得到的反應(yīng)液中的還原糖含量，測(cè)量0D54(lnm吸光值； 如果如果某個(gè)菌進(jìn)行步驟（3)得到的反應(yīng)液的0D 54(tam吸光值大于空白對(duì)照的0D54tol吸光值， 該菌株即為本步驟篩選得到的菌株；
[0029] (4)進(jìn)行（a)和 / 或（b);
[0030] (a)將步驟（3)篩選得到的菌株進(jìn)行步驟（2)得到的反應(yīng)液進(jìn)行薄層層析；對(duì)于步 驟（3)篩選得到的菌株來(lái)說(shuō)，如果某個(gè)菌進(jìn)行步驟（2)得到的反應(yīng)液中具有稀有人參皂苷， 該菌株即為本步驟篩選得到的菌株；
[0031] (b)將步驟（3)篩選得到的菌株進(jìn)行步驟（1)得到的發(fā)酵產(chǎn)物作用于所述大量存 在的人參皂苷，然后用有機(jī)溶劑抽提，然后進(jìn)行HPLC;對(duì)于步驟（3)篩選得到的菌株來(lái)說(shuō)， 如果某個(gè)菌進(jìn)行步驟（1)得到的發(fā)酵產(chǎn)物作用于所述大量存在的人參皂苷后得到了稀有人 參皂苷，該菌株即為本步驟篩選得到的菌株。
[0032] 本發(fā)明還保護(hù)將序列表的序列1自N末端第218氨基酸殘基由纈氨酸突變?yōu)楦拾?酸、第325位氨基酸殘基由蘇氨酸突變?yōu)楸彼岬玫降牡鞍踪|(zhì)。
[0033] 編碼所述蛋白的基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述基因具體可為如下（1)或 (2)或（3)所述的DNA分子：
[0034] (1)序列表中序列2所示的DNA分子；
[0035] (2)在嚴(yán)格條件下與（1)限定的DNA序列雜交且編碼與所述蛋白質(zhì)的DNA分子；
[0036] (3)與（1)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且編碼所述蛋白質(zhì)的DNA分 子。
[0037] 上述嚴(yán)格條件可為在6XSSC，0. 5%SDS的溶液中，在65° C下雜交，然后用 2XSSC、0. 1%SDS 和 1XSSC、0. 1%SDS 各洗膜一次。
[0038] 含有所述基因的表達(dá)盒、重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌均屬于本發(fā)明的保護(hù) 范圍。所述重組菌具體可為將所述基因通過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)導(dǎo)入大腸桿菌BL2KDE3) 得到的重組菌。
[0039] 本發(fā)明還保護(hù)所述的重組菌的應(yīng)用，為如下（I )或（II) :( I )制備所述蛋白質(zhì)； (Π )以大量存在的人參皂苷為原料制備稀有人參皂苷。具體可利用所述重組菌的發(fā)酵產(chǎn)物 將大量存在的人參皂苷轉(zhuǎn)化為稀有人參皂苷。所述大量存在的人參皂苷具體可為人參皂苷 Rh。所述稀有人參皂苷具體可為人參皂苷compound K。所述發(fā)酵產(chǎn)物的制備方法如下： 將所述重組菌進(jìn)行培養(yǎng)并收集發(fā)酵產(chǎn)物；所述"培養(yǎng)"的方法具體如下：在培養(yǎng)體系中加入 IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)。所述"培養(yǎng)"的方法具體如下：簽挑取單菌落至800 μ 1含50 μ g/mL卡那 霉素的LB液體培養(yǎng)基，37°C、750rpm振蕩培養(yǎng)24h，得到種子液；將5 μ 1所述種子液轉(zhuǎn)接入 800 μ 1含50 μ g/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基，加入誘導(dǎo)劑IPTG至其濃度為0. ImM，然后 在30°C、750rpm振蕩培養(yǎng)24h (此時(shí)約為2. 5)。所述"發(fā)酵產(chǎn)物"為整個(gè)發(fā)酵體系、 發(fā)酵上清或菌體破碎液。所述菌體破碎液菌體可為將所述發(fā)酵體系中的菌體進(jìn)行破壁后得 到的上清液。所述菌體破碎液具體可按如下方法制備：取完成所述培養(yǎng)的整個(gè)的發(fā)酵體系， 尚心（尚心條件具體可為3000g、lOmin)并收集囷體，將囷體直于 _80 C放直30min后室溫融 化，隨后加入300 μ 1濃度為10mg/ml的溶菌酶溶液(溶劑具體可為pH8. 0、50mM的Tris-HCl 緩沖液)，37°C、750rpm振蕩反應(yīng)lh，3000g離心lOmin并收集上清液，即為菌體破碎液。 [0040] 本發(fā)明還保護(hù)所述的蛋白質(zhì)的應(yīng)用，為如下(m)或αν)或（v):(m)作為β-糖苷 酶；（IV)制備β -糖苷酶；（V)以大量存在的人參皂苷為原料制備稀有人參皂苷。所述大 量存在的人參皂苷具體可為人參皂苷Rbi。所述稀有人參皂苷具體可為人參皂苷compound K〇
[0041] 本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)與現(xiàn)有野生型蛋白質(zhì)相比，將大量存在的人參皂苷轉(zhuǎn)化為稀 有人參皂苷的能力大大增加，本發(fā)明對(duì)于稀有人參皂苷的制備具有重大價(jià)值。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0042] 圖1為實(shí)施例2中的薄層層析譜圖。
[0043] 圖2為實(shí)施例2中的HPLC譜圖。

【具體實(shí)施方式】
[0044] 以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn) 方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平 均值。
[0045] 硫橫礦硫化葉菌（Sulfolobus solfataricus) DSM1616 : ATCC* 35091?。 pET-28a (+)載體購(gòu)自Novagen公司，產(chǎn)品編號(hào)為69864-3。大腸桿菌BL21 (DE3 ):購(gòu)自 默克公司（Merck),產(chǎn)品目錄號(hào)為69450。人參皂甙Rbl，分子式為C54H920 23，CAS登錄號(hào) 41753-43-9,購(gòu)自北京百靈威化學(xué)技術(shù)有限公司，產(chǎn)品編號(hào)ASB-00007190-010。人參皂苷 compound K (簡(jiǎn)稱CK)，分子式為C36H6108, CAS登錄號(hào)39262-14-1，購(gòu)自成都普瑞法科技開(kāi) 發(fā)有限公司，產(chǎn)品編號(hào)G4038。溶菌酶：購(gòu)自江晨生物，單位為20000U/mg。
[0046] S0C培養(yǎng)基：溶劑為水，含有如下溶質(zhì)：2g/100mL蛋白胨、0. 5g/100mL酵母提取物、 10mM氯化鈉、2. 5mM氯化鉀、10mM氯化鎂、10mM硫酸鎂和20mM葡萄糖。
[0047] LB液體培養(yǎng)基：溶劑為水，含有如下溶質(zhì)：胰蛋白胨10g/L、NaC110g/L和酵母提取 物 5g/L。
[0048] DNS溶液：溶劑為水，含有如下溶質(zhì)：酒石酸鉀鈉182g/L、3, 5-二硝基水楊酸 6. 3g/L、氫氧化鈉21g/L、亞硫酸鈉5g/L和結(jié)晶酚5g/L。
[0049] 硫磺礦硫化葉菌的糖苷酶又稱LacS蛋白，如序列表的序列1所示，其編碼基 因又稱lacS基因，如序列表的序列2所不。
[0050] 實(shí)施例1、通過(guò)構(gòu)建含有現(xiàn)有蛋白的菌株的突變體庫(kù)篩選具有將大量存在的人參 皂苷轉(zhuǎn)化為稀有人參皂苷的能力的菌株的方法。
[0051] 一、構(gòu)建突變體文庫(kù)
[0052] 1、提取硫磺礦硫化葉菌DSM1616的基因組DNA。
[0053] 2、以步驟1提取的基因組DNA為模板，用F1和R1組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回 收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(約1470bp)。
[0054] F1 :5，-atggctagcatgtactcatttccaaatagc-3,；
[0055] R1 :5，-gtgctcgagttagtgccttaatggctttac-3,〇
[0056] PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序：95°C預(yù)變性 4min ;95°C 45s、55°C 30s、72°C lmin30s，30 個(gè)循 環(huán)；72°C 延伸 10min。
[0057] 3、用限制性內(nèi)切酶Nhel和Xhol雙酶切步驟2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。
[0058] 4、用限制性內(nèi)切酶Nhel和Xhol雙酶切pET_28a(+)載體，回收約5. 3kb的載體骨 架。
[0059] 5、將步驟3的酶切產(chǎn)物和步驟4的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒pET28a_lacS。根 據(jù)測(cè)序結(jié)果，對(duì)重組質(zhì)粒pET28a_lacS進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：在pET_28a(+)載體的Nhel和 Xhol酶切位點(diǎn)之間插入了序列表的序列2所示的雙鏈DNA分子。
[0060] 6、以重組質(zhì)粒pET28a_lacS為模板，用F1和R1組成的引物對(duì)進(jìn)行易錯(cuò)PCR，得到 含有多種突變形式的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0061] 易錯(cuò) PCR 的反應(yīng)體系：10 μ llOXrTaq DNA polymerase buffer (購(gòu)自寶生物公 司）、9μ1 dNTP混合物（2.5mM，購(gòu)自北京全式金公司，編號(hào)為AD101)、9yl dCTP(lOyM)、 9以1(11113(1(^]\〇(均購(gòu)自寶生物公司）、5.5 4 10.1]\11%(：12水溶液、54 1?1(2.54]\〇、 5μ1 R1 (2· 5μΜ)、1·5μ15πιΜ MnCl^jC溶液、1 μ 1 rTaq DNA polymerase，補(bǔ)水至終體積 100 μ 1。
[0062] 易錯(cuò) PCR 的反應(yīng)程序：95°C預(yù)變性 4min ;95°C 45s、55°C 30s、72°C lmin30s，30 個(gè) 循環(huán)；72°C延伸10min。
[0063] 7、用限制性內(nèi)切酶Nhel和Xhol雙酶切步驟6得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn) 物。
[0064] 8、用限制性內(nèi)切酶Nhel和Xhol雙酶切pET_28a(+)載體，回收約5. 3kb的載體骨 架。
[0065] 9、將步驟7的酶切產(chǎn)物和步驟8的載體骨架連接，然后將連接產(chǎn)物電擊轉(zhuǎn)化大腸 桿菌BL21 (DE3)的感受態(tài)細(xì)胞，然后在S0C培養(yǎng)基中37°C、250rpm振蕩培養(yǎng)lh以進(jìn)行復(fù) 蘇，然后均勻涂布于含50 μ g/mL卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基平板，從平板上長(zhǎng)出約2000個(gè) 單菌落，這些單菌落組成突變文庫(kù)。
[0066] 10、將重組質(zhì)粒pET28a_lacS代替步驟9的連接產(chǎn)物進(jìn)行與步驟9相同的操作，隨 機(jī)取5個(gè)單菌落，作為野生型對(duì)照菌。
[0067] 二、通過(guò)高通量篩選獲得具有將大量存在的人參皂苷轉(zhuǎn)化為稀有人參皂苷的能力 的突變體菌株
[0068] 將步驟一的9中的各個(gè)單菌落、5個(gè)野生型對(duì)照菌的單菌落分別進(jìn)行如下步驟：
[0069] 1、用無(wú)菌牙簽挑取單菌落至800μ 1含50μ g/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基， 37°C、750rpm振蕩培養(yǎng)24h，得到種子液。
[0070] 2、將約5 μ 1步驟1得到的種子液轉(zhuǎn)接入800 μ 1含50 μ g/mL卡那霉素的LB液體 培養(yǎng)基，加入誘導(dǎo)劑IPTG至其濃度為0. 1禮，然后在30°C、750rpm振蕩培養(yǎng)24h(此時(shí) 約為2. 5)。
[0071] 3、取步驟2得到的培養(yǎng)體系，3000g離心lOmin并收集菌體，將菌體置于-80°C放 置30min后室溫融化(本步驟的目的是細(xì)胞破壁)，隨后加入300 μ 1濃度為10mg/ml的溶 菌酶溶液(溶劑為pH8. 0、50mM的Tris-HCl緩沖液)，37°C、750rpm振蕩反應(yīng)lh，3000g離心 lOmin并收集上清液，即為粗酶液。
[0072] 4、將100 μ 1步驟3得到的粗酶液和200 μ llmg/ml的人參皂苷叫溶液（溶劑為 pH5. 5的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，其中磷酸氫二鈉濃度為200mM、檸檬酸濃度為lOOmM) 混勻，85°C靜置30min后即刻置于冰上冷卻。
[0073] 5、通過(guò)二硝基水楊酸法（DNS法）檢測(cè)步驟4得到的反應(yīng)液中的還原糖含量，具體 方法為：在步驟4得到的反應(yīng)液中加入900 μ 1 DNS溶液，85°C水浴靜置7min顯色（生成較 多還原糖的突變體顯棕紅色)，測(cè)量〇D54(lnm吸光值。如果某反應(yīng)液的0D 54(lnm吸光值大于5個(gè) 野生型對(duì)照菌步驟4得到的反應(yīng)液的0D54tol吸光值的平均值，用于制備該反應(yīng)液的單菌落 即為篩選得到的菌株。從突變體庫(kù)中篩選得到5株菌(依次命名為菌株-1、菌株-2、菌株-3、 菌株-4和菌株-5)。
[0074] 6、將野生型對(duì)照菌進(jìn)行上述步驟4得到的反應(yīng)液以及步驟5篩選得到的5株菌進(jìn) 行上述步驟4得到的反應(yīng)液分別進(jìn)行薄層層析（TLC)。
[0075] 展層劑如下：氯仿：甲醇：水=8:2:0. 1 (體積比）。
[0076] 目標(biāo)物為人參皂苷compound K，其Rf值=0· 85。
[0077] 目測(cè)，如果某株菌步驟4得到的反應(yīng)液中目標(biāo)物的含量高于5個(gè)野生型對(duì)照菌中 的每個(gè)菌步驟4得到的反應(yīng)液的目標(biāo)物的含量，該菌株即為篩選得到的菌株。從步驟5得 到的5株菌中篩選得到3株菌(菌株-1、菌株-2和菌株-3)。
[0078] 7、采用高壓液相色譜（HPLC)進(jìn)行定量分析檢測(cè)
[0079] 將野生型對(duì)照菌進(jìn)行上述步驟3得到的粗酶液以及步驟5篩選得到的5株菌進(jìn)行 上述步驟3得到的粗酶液進(jìn)行如下步驟：
[0080] (1)將50μ1粗酶液、100yll0mg/ml的人參皂苷Rbl溶液（溶劑為PH5.5的磷酸 氫二鈉-檸檬酸緩沖液，其中磷酸氫二鈉濃度為200mM、檸檬酸濃度為100mM)混合，80°C靜 置 20min。
[0081] (2)取250μ 1完成步驟（1)的反應(yīng)液，與250μ 1正丁醇混合，渦旋震蕩30s， 12000g離心2min，吸取有機(jī)相。
[0082] (3)在步驟（2)的剩余物中再加入250 μ 1正丁醇，渦旋震蕩30s，12000g離心 2min，吸取有機(jī)相。
[0083] (4)在步驟（3)的剩余物中再加入250 μ 1正丁醇，渦旋震蕩30s，12000g離心 2min，吸取有機(jī)相。
[0084] (5)將步驟（2)得到的有機(jī)相、步驟（3)得到的有機(jī)相和步驟（4)得到的有機(jī)相混 合，旋轉(zhuǎn)蒸干后用400 μ 1甲醇重溶。
[0085] (6 )將步驟（5 )得到的溶液進(jìn)行HPLC。
[0086] HPLC 參數(shù)：C18 柱（Waters Symmetry, 250mm X 4. 6mm, 5 μ m);
[0087] 柱溫為 35°C ;
[0088] 洗脫液為乙腈或乙腈與水的混合液；
[0089] 洗脫過(guò)程：第0_20min，乙腈在洗脫液中所占的體積百分?jǐn)?shù)由30%線性上升至40% ; 第20-35min，乙腈在洗脫液中所占的體積百分?jǐn)?shù)由40%線性上升至100% ;第35-40min，乙 腈在洗脫液中所占的體積百分?jǐn)?shù)為100% ;第40-45min，乙腈在洗脫液中所占的體積百分?jǐn)?shù) 為 30% ;
[0090] 流速為 1. Oml/min ;
[0091] 檢測(cè)波長(zhǎng)為203nm。
[0092] 人參皂苷compound K標(biāo)準(zhǔn)品的峰值對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間29. 766min。根據(jù)人參皂苷 compound K標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積與濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：人參阜苷compound K標(biāo)準(zhǔn)品濃度（mg/ml) =0. 00006. 75 X峰面積。
[0093] 對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，5株野生型對(duì)照菌的粗酶液進(jìn)行上述實(shí)驗(yàn)，步驟（5)得到的溶 液中的人參阜苷compound K的平均濃度為0· 62mg/ml。
[0094] 對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，菌株-1的粗酶液進(jìn)行上述實(shí)驗(yàn)，步驟（5)得到的溶液中的人參皂 苷 compound K 的濃度為 1. 62mg/ml。
[0095] 對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，菌株-2的粗酶液進(jìn)行上述實(shí)驗(yàn)，步驟（5)得到的溶液中的人參皂 苷 compound K 的濃度為 1. 22mg/ml。
[0096] 對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，菌株-3的粗酶液進(jìn)行上述實(shí)驗(yàn)，步驟（5)得到的溶液中的人參皂 苷 compound K 的濃度為 0· 93mg/ml。
[0097] 對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，菌株-4的粗酶液進(jìn)行上述實(shí)驗(yàn)，步驟（5)得到的溶液中的人參皂 苷 compound K 的濃度為 0· 88mg/ml。
[0098] 對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，菌株-5的粗酶液進(jìn)行上述實(shí)驗(yàn)，步驟（5)得到的溶液中的人參皂 苷 compound K 的濃度為 0· 91mg/ml。
[0099] 菌株-1得到的粗酶液將人參皂苷Rbl轉(zhuǎn)化為人參皂苷compound K的活性最高。
[0100] 8、將菌株-1提取質(zhì)粒，以提取得到的質(zhì)粒為模板，用F1和R1組成的引物對(duì)進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物并進(jìn)行測(cè)序，該P(yáng)CR擴(kuò)增產(chǎn)物與序列表的序列2的差異僅在于 將序列2自5'末端第653核苷酸由T突變?yōu)榱?G、第973位核苷酸由A突變?yōu)榱?G，相應(yīng)的 編碼將序列表的序列1自N末端第218氨基酸殘基由纈氨酸突變?yōu)楦拾彼?、?25位氨基 酸殘基由蘇氨酸突變?yōu)楸彼岬玫降牡鞍踪|(zhì)(將其命名為L(zhǎng)a CSV218e/T325A蛋白）。
[0101] 實(shí)施例2、通過(guò)構(gòu)建現(xiàn)有蛋白編碼基因的突變體庫(kù)篩選具有將大量存在的人參皂 苷轉(zhuǎn)化為稀有人參皂苷的能力的突變蛋白的方法。
[0102] 1、取實(shí)施例1的步驟二的5得到的5株菌和5株野生型對(duì)照菌在實(shí)施例1的步驟 二的3得到的粗酶液，進(jìn)行親和層析。
[0103] 親和層析采用鎳離子親和層析柱（Novagen公司生產(chǎn)，產(chǎn)品編號(hào)為70666-3,柱體 積為lml)。具體洗脫過(guò)程，先用3ml漂洗緩沖液(含20mM咪唑、300mM NaCl的pH8、50mM Tris-HCl緩沖液）洗滌以去除雜蛋白，然后用2ml洗脫緩沖液(含250mM咪唑、300mM NaCl 的pH8、50mM Tris-HCl緩沖液）洗滌并收集過(guò)柱后溶液，透析(透析液為pH5. 5的MC緩沖 液，由終濃度為200mM磷酸氫二鈉、終濃度為lOOmM檸檬酸和水組成；透析袋的截留分子量 為8000-14000)后得到純化酶液。
[0104] 用緩沖液（pH5. 5的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，其中磷酸氫二鈉濃度為200mM、 檸檬酸濃度為l〇〇mM)調(diào)整每種純化酶液的蛋白濃度均為0. 78mg/ml，即為調(diào)整后純化酶 液。
[0105] 2、將步驟1得到的調(diào)整后純化酶液取代粗酶液，其它同實(shí)施例1的步驟二的4。
[0106] 3、將5株野生型對(duì)照菌進(jìn)行上述步驟1和2后得到的反應(yīng)液以及實(shí)施例1的步驟 二的5得到的5株菌進(jìn)行上述步驟1和2后得到的反應(yīng)液分別進(jìn)行薄層層析（TLC)。
[0107] 展層劑如下：氯仿：甲醇：水=8:2:0. 1 (體積比）。
[0108] 目標(biāo)物為人參皂苷compound K，其Rf值=0· 85。
[0109]目測(cè)，如果某株菌進(jìn)行上述步驟得到的反應(yīng)液中目標(biāo)物的含量高于5個(gè)野生型對(duì) 照菌中的每個(gè)菌進(jìn)行上述步驟得到的反應(yīng)液的目標(biāo)物的含量，該菌株即為篩選得到的菌 株。從步驟5得到的5株菌中篩選得到3株菌(菌株-1、菌株-2和菌株-3)。菌株-1進(jìn)行 上述步驟得到的反應(yīng)液的薄層層析圖譜見(jiàn)圖1 (WT代表1株野生菌，Mutant代表菌株-1)。
[0110] 4、采用高壓液相色譜（HPLC)進(jìn)行定量的分析檢測(cè)
[0111] 用步驟1得到的調(diào)整后純化酶液取代粗酶液，其它同實(shí)施例1的步驟二的7。
[0112] 對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，5株野生型對(duì)照菌的調(diào)整后純化酶液進(jìn)行上述實(shí)驗(yàn)，步驟（5) 得到的溶液中的人參阜苷compound K的平均濃度為1. lmg/ml。
[0113] 對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，菌株-1的調(diào)整后純化酶液進(jìn)行上述實(shí)驗(yàn)，步驟（5)得到的溶液的 HPLC圖譜見(jiàn)圖2 (橫坐標(biāo)13. 496min對(duì)應(yīng)的峰為人參皂苷Rd，橫坐標(biāo)26. 042min對(duì)應(yīng)的峰 為溶劑峰，橫坐標(biāo)29. 766min對(duì)應(yīng)的峰為人參阜苷compound K)，其中的人參阜苷compound K的濃度為3. 5mg/ml。
[0114] 對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，菌株-2的調(diào)整后純化酶液進(jìn)行上述實(shí)驗(yàn)，步驟（5)得到的溶液中 的人參阜苷compound K的濃度為3. 2mg/ml。
[0115] 對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，菌株-3的調(diào)整后純化酶液進(jìn)行上述實(shí)驗(yàn)，步驟（5)得到的溶液中 的人參阜苷compound K的濃度為1. 4mg/ml。
[0116] 對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，菌株-4的調(diào)整后純化酶液進(jìn)行上述實(shí)驗(yàn)，步驟（5)得到的溶液中 的人參阜苷compound K的濃度為1. 5mg/ml。
[0117] 對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，菌株-5的調(diào)整后純化酶液進(jìn)行上述實(shí)驗(yàn)，步驟（5)得到的溶液中 的人參阜苷compound K的濃度為1. 4mg/ml。
[0118] 即菌株-1所表達(dá)的LaCSV218G/T325A蛋白將人參皂苷Rbl轉(zhuǎn)化為人參皂苷compound K的活性最尚。
【權(quán)利要求】
1. 一種篩選具有將大量存在的人參皂苷轉(zhuǎn)化為稀有人參皂苷的能力的菌株的方法，包 括如下步驟： (1) 將基因甲插入表達(dá)質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)后轉(zhuǎn)化宿主菌，得到野生菌；將基因甲或含有 所述基因甲的質(zhì)粒作為模板并將所述基因甲作為靶區(qū)域進(jìn)行易錯(cuò)PCR，將所述易錯(cuò)PCR的 產(chǎn)物插入所述表達(dá)質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)后轉(zhuǎn)化所述宿主菌，得到的所有單菌落組成突變菌株 庫(kù)；所述基因甲為已知的具有將大量存在的人參皂苷轉(zhuǎn)化為稀有人參皂苷的能力的蛋白質(zhì) 的編碼基因； (2) 將野生菌和突變菌株庫(kù)中的每個(gè)菌分別進(jìn)行培養(yǎng)并收集發(fā)酵產(chǎn)物； (3) 將所述發(fā)酵產(chǎn)物作用于所述大量存在的人參皂苷，得到反應(yīng)液； (4) 采用DNS法檢測(cè)步驟（3)得到的反應(yīng)液中的還原糖含量，測(cè)量0D54(tam吸光值；對(duì)于 突變菌株庫(kù)中的每個(gè)菌來(lái)說(shuō)，如果某個(gè)菌進(jìn)行步驟（3)得到的反應(yīng)液的0D 54(tam吸光值大于 野生菌進(jìn)行步驟（3)得到的反應(yīng)液的0D54(tam吸光值，該菌株即為本步驟篩選得到的菌株； (5) 進(jìn)行（a)和/或（b); (a) 將野生菌和步驟（4)篩選得到的菌株進(jìn)行步驟（3)得到的反應(yīng)液進(jìn)行薄層層析；對(duì) 于步驟（4)篩選得到的菌株來(lái)說(shuō)，如果某個(gè)菌進(jìn)行步驟（3)得到的反應(yīng)液中稀有人參皂苷 的含量高于野生菌進(jìn)行步驟（3)得到的反應(yīng)液中稀有人參皂苷的含量，該菌株即為本步驟 篩選得到的菌株； (b) 將野生菌和步驟（4)篩選得到的菌株進(jìn)行步驟（2)得到的發(fā)酵產(chǎn)物作用于所述大 量存在的人參皂苷，然后用有機(jī)溶劑抽提，然后進(jìn)行HPLC ;對(duì)于步驟（4)篩選得到的菌株來(lái) 說(shuō)，如果某個(gè)菌進(jìn)行步驟（2)得到的發(fā)酵產(chǎn)物作用于所述大量存在的人參皂苷后稀有人參 皂苷的產(chǎn)量高于野生菌進(jìn)行步驟（2)得到的發(fā)酵產(chǎn)物作用于所述大量存在的人參皂苷后稀 有人參皂苷的產(chǎn)量，該菌株即為本步驟篩選得到的菌株。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述大量存在的人參皂苷為人參皂苷Rbp 所述稀有人參皂苷為人參皂苷compound K。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述基因甲為編碼β-糖苷酶的基因。
4. 權(quán)利要求1至3中任一所述方法在篩選具有將大量存在的人參阜苷轉(zhuǎn)化為稀有人參 皂苷的能力的蛋白質(zhì)中的應(yīng)用。
5. -種篩選具有將大量存在的人參皂苷轉(zhuǎn)化為稀有人參皂苷的能力的菌株的方法，包 括如下步驟： (1) 將野外采集的菌株進(jìn)行培養(yǎng)并收集發(fā)酵產(chǎn)物； (2) 將所述發(fā)酵產(chǎn)物作用于所述大量存在的人參皂苷，得到反應(yīng)液； (3) 采用DNS法檢測(cè)步驟（2)得到的反應(yīng)液中的還原糖含量，測(cè)量0D54(tam吸光值；如果 如果某個(gè)菌進(jìn)行步驟（3)得到的反應(yīng)液的0D 54tol吸光值大于空白對(duì)照的0D54(tam吸光值，該 菌株即為本步驟篩選得到的菌株； (4) 進(jìn)行（a)和/或（b); (a) 將步驟（3)篩選得到的菌株進(jìn)行步驟（2)得到的反應(yīng)液進(jìn)行薄層層析；對(duì)于步驟 (3)篩選得到的菌株來(lái)說(shuō)，如果某個(gè)菌進(jìn)行步驟（2)得到的反應(yīng)液中具有稀有人參皂苷，該 菌株即為本步驟篩選得到的菌株； (b) 將步驟（3)篩選得到的菌株進(jìn)行步驟（1)得到的發(fā)酵產(chǎn)物作用于所述大量存在的 人參皂苷，然后用有機(jī)溶劑抽提，然后進(jìn)行HPLC ;對(duì)于步驟（3)篩選得到的菌株來(lái)說(shuō)，如果 某個(gè)菌進(jìn)行步驟（1)得到的發(fā)酵產(chǎn)物作用于所述大量存在的人參皂苷后得到了稀有人參皂 苷，該菌株即為本步驟篩選得到的菌株。
6. 將序列表的序列1自N末端第218氨基酸殘基由纈氨酸突變?yōu)楦拾彼?、?25位氨 基酸殘基由蘇氨酸突變?yōu)楸彼岬玫降牡鞍踪|(zhì)。
7. 編碼權(quán)利要求6所述蛋白的基因。
8. 含有權(quán)利要求7所述基因的表達(dá)盒、重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
9. 權(quán)利要求8所述的重組菌的應(yīng)用，為如下（I )或（II) : ( I )制備權(quán)利要求6所述蛋 白質(zhì)；（II)以大量存在的人參皂苷為原料制備稀有人參皂苷。
10. 權(quán)利要求6所述的蛋白質(zhì)的應(yīng)用，為如下(III)或(IV)或（ν):(ΙΙΙ)作為β-糖苷 酶；（IV)制備β -糖苷酶；（V)以大量存在的人參皂苷為原料制備稀有人參皂苷。
【文檔編號(hào)】C12N9/42GK104232671SQ201310246807
【公開(kāi)日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2013年6月20日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月20日
【發(fā)明者】梁朝寧, 熊丹丹, 唐雙焱 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院微生物研究所