一種褐牙鲆與其近緣外來物種種質(zhì)間的pcr鑒定方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)對物種鑒定的定性檢測方法，具體地說是利用分子生物學(xué)技術(shù)對褐牙鲆與其近緣外來物種種質(zhì)間的PCR鑒定方法。利用F、R1、R2三條特異性標(biāo)記的引物對褐牙鲆和其近緣外來種大西洋牙鲆的線粒體DNA基因進行擴增，通過擴增出的特異性片段進而區(qū)分褐牙鲆與大西洋牙鲆；本發(fā)明為在形態(tài)學(xué)上無法鑒別的褐牙鲆和大西洋牙鲆早期發(fā)育時期苗種定性鑒定提供了快速、經(jīng)濟、可靠的分子生物學(xué)檢測技術(shù)，為褐牙鲆苗種增殖放流鑒定及防止外來物種入侵提供了智力支持，同時將加快牙鲆苗種產(chǎn)業(yè)的質(zhì)量檢測進程。
CGMCC No.1985
2007.03.22
【專利說明】一種褐牙鲆與其近緣外來物種種質(zhì)間的PCR鑒定方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)對物種鑒定的定性檢測方法，具體地說是利用分子生 物學(xué)技術(shù)對褐牙鲆與其近緣外來物種種質(zhì)間的PCR鑒定方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 大西洋牙鲆（Paralichthys dentatus)隸屬于鰈形目、鲆科、牙鲆屬，主要分布于 北美洲大西洋沿岸，是一種冷水性經(jīng)濟魚類。褐牙鲆（P. olivaceus)與大西洋牙鲆為同屬 近緣物種，生物形態(tài)學(xué)上極其相似，主要分布西北太平洋沿岸，為亞洲重要的鲆鰈類養(yǎng)殖品 種。為改變我國牙鲆屬養(yǎng)殖品種單一局面，大西洋牙鲆于2002年首次從美國引入我國進行 人工培育和養(yǎng)殖。在養(yǎng)殖過程中，大西洋牙鲆呈現(xiàn)生長快速、抗病力強、耐高溫能力較牙鲆 高和成活率高等特點，近年來該魚種已經(jīng)在我國進行了工廠化、池塘高密度集約化養(yǎng)殖生 產(chǎn)。由于大西洋牙鲆與褐牙鲆的形態(tài)特征十分相似，尤其在苗種早期發(fā)育時期更是難以從 外部形態(tài)上進行快速的鑒別和區(qū)分，給牙鲆苗種產(chǎn)業(yè)的質(zhì)量檢測帶來了困難，對沒有任何 分類經(jīng)驗的褐牙鲆苗種養(yǎng)殖戶將造成巨大損失，會嚴(yán)重影響褐牙鲆苗種生產(chǎn)的管理及其養(yǎng) 殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。另外，隨著近年來褐牙鲆野生資源修復(fù)計劃的啟動和實施，褐牙鲆苗種增殖 放流工作以日趨常態(tài)化，大西洋牙鲆苗種生產(chǎn)量的劇增為如何確保放流牙鲆苗種為褐牙鲆 純種以及如何防止外來物種入侵而引起海洋生態(tài)失衡等提出了難題。
[0003] 線粒體DNA自20世紀(jì)60年代被證實以來，由于其具有結(jié)構(gòu)簡單、母性遺傳、幾乎 不發(fā)生重組和進化速率快等特點，呈現(xiàn)出較強的種屬特異性，被廣泛應(yīng)用于種間系統(tǒng)發(fā)育 進化、種屬分類鑒定等分子分類學(xué)領(lǐng)域。目前關(guān)于生物種質(zhì)資源檢測與鑒定的專利不多，尚 未見到有關(guān)褐牙鲆和大西洋牙鲆物種鑒別技術(shù)的報道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明針對大西洋牙鲆與褐牙鲆早期發(fā)育形態(tài)特征極其相似難以從外部形態(tài)上 進行快速鑒別和區(qū)分的難題，提供了一種新的簡便、快捷、準(zhǔn)確地褐牙鲆與其近緣外來物種 種質(zhì)間的PCR鑒定方法，即褐牙鲆與大西洋牙鲆幼魚種質(zhì)鑒定PCR檢測方法。
[0005] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：
[0006] 褐牙鲆與其近緣外來物種種質(zhì)間的PCR鑒定方法，其特征在于：利用F、Ri、R2三條 特異性標(biāo)記的引物對褐牙鲆和其近緣外來種大西洋牙鲆的線粒體DNA基因進行擴增，通過 擴增出的特異性片段進而區(qū)分褐牙鲆與大西洋牙鲆；
[0007] 上游正向引物序列為：F: 5' CCCACCACTAACTCCCAAAGC3' ；
[0008] 下游反向引物 1 序列為：R1:5' TTCACCGAGTGAAACCCCCAC3' ；
[0009] 下游反向引物 2 序列為：R2:5' GGTCTATAGGTTTTAGTCC3'。
[0010] 利用F、％、R2三條特異性標(biāo)記的引物對褐牙鲆和其近緣外來種的線粒體DNA基因 進行擴增，反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳條帶差異進行種質(zhì)判定。
[0011] 所述PCR擴增條件為：94°C預(yù)變性4min ;40個循環(huán)：94°C變性lmin，47°C退火50s， 72°C延伸 lmin ;然后 72°C延伸 lOmin。
[0012] 通過對擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示外來種大西洋牙鲆的DNA顯 示為2條亮帶，褐牙鲆的DNA則顯示為1條亮帶，進而區(qū)分褐牙鲆和大西洋牙鲆物種種質(zhì)。 即外來種大西洋牙鲆的DNA顯示為422bp和201bp的2條相應(yīng)亮帶，褐牙鲆的DNA則顯示 為422bp的1條陽性亮帶。
[0013] 本發(fā)明根據(jù)褐牙鲆和大西洋牙鲆線粒體基因組DNA上特異性堿基序列設(shè)計三條 特異性標(biāo)記的引物，因此只對褐牙鲆和大西洋牙鲆有擴增信號，而對其它對照材料沒有相 應(yīng)目的帶的擴增信號。
[0014] 線粒體DNA控制區(qū)進化速率約為蛋白編碼基因的2-5倍，具有較高的突變速率，通 常具有較高的種間多態(tài)呈現(xiàn)種屬特異性，成為研究近緣物種間遺傳分化和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系非 常理想的分子標(biāo)記，尤其是對于研究形態(tài)相似物種間的遺傳分化和發(fā)現(xiàn)隱存種是一個非常 重要的研究工具，對于補充和完善形態(tài)分類學(xué)研究具有重要的意義。
[0015] 上述PCR鑒定方法中的引物，可作為大西洋牙鲆和褐牙鲆的PCR鑒定鑒定試劑盒。
[0016] 本發(fā)明是對褐牙鲆和大西洋牙鲆早期發(fā)育時期苗種進行分子標(biāo)記進而得到鑒定， 即在線粒體DNA控制區(qū)部分測序的基礎(chǔ)上，本發(fā)明篩選并設(shè)計了針對牙鲆和大西洋牙鲆線 粒體控制區(qū)PCR差異擴增三條特異性引物（F、R1和R2)。通過一次普通PCR擴增，瓊脂糖凝 膠電泳檢測顯示種間特征帶的有無，即可準(zhǔn)確鑒定褐牙鲆及其近緣外來種大西洋牙鲆物種 種質(zhì)。同時不僅可以對褐牙鲆和大西洋牙鲆苗種及成體進行鑒別，在褐牙鲆苗種增殖放流 純種鑒定、水產(chǎn)品加工鑒定及食品檢測等方面都可以應(yīng)用。
[0017] 本發(fā)明所具有的優(yōu)點：
[0018] 與其他分子生物學(xué)方法相比，本技術(shù)發(fā)明具有快速穩(wěn)定、可靠、經(jīng)濟實用等特點， 即采用分子生物學(xué)手段，根據(jù)線粒體DNA種屬特異性，設(shè)計出特異分子標(biāo)記，采用普通PCR 檢測方法，在擴增產(chǎn)物凝膠電泳檢測結(jié)果中，外來種大西洋牙鲆的DNA顯示為2條亮帶，褐 牙鲆的DNA顯示則為1條亮帶，從而定性的檢測褐牙鲆及其近緣外來物種大西洋牙鲆，因 此，本發(fā)明技術(shù)簡便易行，特異性高，采用本技術(shù)發(fā)明，可以很容易地將褐牙鲆和其近緣外 來物種大西洋牙鲆區(qū)分開來，同時不僅可以加快牙鲆魚苗種產(chǎn)業(yè)種質(zhì)質(zhì)量檢測進程，而且 可以在褐牙鲆苗種增殖放流純種鑒定、水產(chǎn)品加工鑒定及食品檢測等方面得到快速應(yīng)用。
[0019] 本發(fā)明采用普通PCR檢測方法，不僅可以鑒別褐牙鲆和大西洋牙鲆苗種及成體， 還可以鑒別其加工產(chǎn)品，具有快速、可靠、經(jīng)濟實用等特點，填補了國內(nèi)將分子生物學(xué)技術(shù) 用于褐牙鲆和大西洋牙鲆物種鑒定的空白。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020] 圖1為本發(fā)明實施例提供的褐牙鲆和大西洋牙鲆DNA進行PCR擴增產(chǎn)物凝膠電泳 檢測結(jié)果的實際圖像；
[0021] 圖2為本發(fā)明實施例提供的圖1的反轉(zhuǎn)圖。

【具體實施方式】
[0022] 實施例1
[0023] 1.線粒體基因組DNA提?。?br> [0024] 分別以褐牙鲆及其近緣種大西洋牙鲆幼魚背部肌肉材料為原料，各取lOOmg并分 別用無菌水處理后，在液氮中研磨成粉末，裝入1. 5ml的離心管中，參照分子克隆實驗指南 精編版（J.薩姆布魯克，D.W.拉塞爾）采用標(biāo)準(zhǔn)酚/氯仿抽提法分別提取原料線粒體基因 組DNA，待用。
[0025] 2.特異引物設(shè)計：
[0026] 基于GENBANK數(shù)據(jù)庫公布的褐牙鲆和大西洋牙鲆線粒體全序列及部分控制區(qū)序 列，采用DNASTAR8. 0軟件進行同源序列比較，利用PRMER5. 0軟件輔助設(shè)計特異性引物。
[0027] 2.1擴增引物：
[0028] (1)褐牙鲆擴增引物名稱及序列：
[0029] 上游引物 F : 5 ' CCCACCACTAACTCCCAAAGC3 '
[0030] 下游引物札：5 ' TTCACCGAGTGAAACCCCCAC3 '
[0031] 褐牙鲆擴增片段長度：約422bp
[0032] (2)大西洋牙鲆擴增引物名稱及序列：
[0033] 上游引物 F : 5，CCCACCACTAACTCCCAAAGC3 '
[0034] 下游引物札：5 ' TTCACCGAGTGAAACCCCCAC3 '
[0035] 下游引物R2:5'GGTCTATAGGTTTTAGTCC3'（大西洋牙鲆種屬特異引物）
[0036] 大西洋牙鲆擴增片段長度：F/%約422bp ;F/R2約201bp
[0037] 3. PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件：
[0038] 3. 1反應(yīng)體系如下：
[0039] 總反應(yīng)體系為 20mL，其中 10XPCR 反應(yīng)緩沖液（lOXbuffer :Tris-HCl (ρΗ8· 3) 10 0mM;KC1500mM;MgCl215mM)2· 5mL，2. 5mM 脫氧核苷三磷酸 2mL, F(10uM) 1. OmL, R1 (10uM) 1. Om L,R2(10uM)0.2mL，Taq DNA 聚合酶（5U/ul)0.2mL，DNA2mL,無菌超純水補足體系至 20mL。
[0040] 3· 2反應(yīng)條件如下：
[0041] 94°C預(yù)變性 4min ;40 個循環(huán)：94°C變性 lmin，47°C退火 50s，72°C延伸 lmin ;然后 72°C延伸 lOmin。
[0042] 反應(yīng)結(jié)束后擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳判定結(jié)果。
[0043] 4.擴增產(chǎn)物檢測：
[0044] PCR擴增產(chǎn)物采用濃度為1. 5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，加入終濃度為lug/ml的溴 化乙錠（EB)。電泳緩沖液為1XTAE，以AS2000DNA Mark作為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。電壓為120 伏特，電泳30分鐘。采用UVP⑶S-8000凝膠成像系統(tǒng)拍照檢測。
[0045] 5、結(jié)果：
[0046] 以褐牙鲆和大西洋牙鲆幼魚背部肌肉DNA為模版，分別用三條特異性引物對線粒 體基因進行PCR擴增，結(jié)果褐牙鲆和大西洋牙鲆在422bp左右位置都有擴增條帶出現(xiàn)（F/% 組合擴增)，在201bp左右位置只有大西洋牙鲆物種有條帶（F/R 2組合擴增)，褐牙鲆無條帶 (參見圖2)。
[0047] 實施例2
[0048] 以褐牙鲆和其近緣外來種大西洋牙鲆幼魚背部肌肉的DNA為模版，基于實施例1 中的PCR反應(yīng)條件，以常見養(yǎng)殖鲆鰈類魚種大菱鲆為陰性對照，通過PCR反應(yīng)結(jié)果顯示大西 洋牙鲆樣品在422bp和201bp處具有特異性擴增的陽性條帶，褐牙鲆樣品在422bp處存在 一條陽性擴增條帶，而大菱鲆樣品則沒有出現(xiàn)相應(yīng)的特異性條帶(參見圖1)。
[0049] 由上述可知線粒體DNA控制區(qū)引物的F/%組合對大西洋牙鲆和褐牙鲆都具有擴 增作用，引物f/r2組合只對大西洋牙鲆具有種屬特異性擴增作用，因此，在褐牙鲆和大西洋 牙鲆種間呈現(xiàn)PCR擴增條帶的差異，而F/Ri和F/R2組合對大菱鲆等其他鲆鰈類而言是非特 異性的，基于本技術(shù)發(fā)明手段可以有效的對外來物種大西洋牙鲆進行準(zhǔn)確的物種鑒定。
【權(quán)利要求】
1. 一種褐牙鲆與其近緣外來物種種質(zhì)間的PCR鑒定方法，其特征在于：利用 條特異性標(biāo)記的引物對褐牙鲆和其近緣外來種大西洋牙鲆的線粒體DNA基因進行擴增，通 過擴增出的特異性片段進而區(qū)分褐牙鲆與大西洋牙鲆； 上游正向引物序列為：F:5' CCCACCACTAACTCCCAAAGC3' ； 下游反向引物 1 序列為TTCACCGAGTGAAACCCCCAC3' ； 下游反向引物 2 序列為：R2:5' GGTCTATAGGTTTTAGTCC3'。
2. 按權(quán)利要求1所述的褐牙鲆與其近緣外來物種種質(zhì)間的PCR鑒定方法，其特征在于： 利用F、Rp R2三條特異性標(biāo)記的引物對褐牙鲆和其近緣外來種大西洋牙鲆的線粒體DNA基 因進行擴增，反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳條帶差異進行種質(zhì)判定。
3. 按權(quán)利要求1或2所述的鑒定的方法，其特征在于：PCR擴增條件為：94°C預(yù)變性 4min ;40 個循環(huán)：94°C變性 lmin，47°C退火 50s，72°C延伸 lmin ;然后 72°C延伸 lOmin。
【文檔編號】C12Q1/68GK104232747SQ201310246976
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2013年6月20日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月20日
【發(fā)明者】肖永雙, 李軍, 肖志忠, 馬道遠(yuǎn), 徐世宏, 劉清華 申請人:中國科學(xué)院海洋研究所