輪狀病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增檢測引物組及試劑盒和檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了輪狀病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增檢測引物組及試劑盒和檢測方法，其中檢測引物組包括上游外引物F3、下游外引物B3、上游內(nèi)引物FIP、下游內(nèi)引物BIP，分別如SEQ?ID?NO.1、2、3和4所示。本發(fā)明的LAMP檢測方法采用4條LAMP特異性引物及BstDNA聚合酶為等主要成分構(gòu)成的LAMP反應(yīng)液，建立的豬輪狀病毒環(huán)介導(dǎo)等溫擴增快速檢測方法，可提高臨床診斷的速度和準確性，且操作簡單，成本低廉，適合基層使用，能有效診斷該病原引起的豬輪狀病毒感染，該病得以控制后，將顯著提高生豬出欄率、降低生豬死亡率，提高生豬產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟效益。
【專利說明】輪狀病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增檢測引物組及試劑盒和檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種輪狀病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增檢測引物組及試劑盒和檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]輪狀病毒(Rotavirus)屬于呼腸孤病毒科(Reoviridae),輪狀病毒屬(Rotaviras)，是人畜共患重要病原之一，可感染多種動物。豬的輪狀病毒(porcinerotavirus, RV)感染最常見于仔豬，1_4周齡仔豬發(fā)病率超過80%，死亡率7%_20%?；钾i主要表現(xiàn)為嚴重腹瀉，排水樣糞便，呈黃色到白色，含不同程度的絮狀物，部分病例因嚴重脫水、酸堿平衡失調(diào)、 繼發(fā)感染而死亡。
[0003]目前輪狀病毒病原的檢測方法有電鏡技術(shù)、病毒分離培養(yǎng)技術(shù)、免疫學(xué)技術(shù)及分子生物學(xué)技術(shù)，但上述的前三種技術(shù)往往存在靈敏度較低、操作繁瑣耗時、需要大型昂貴的儀器設(shè)備等缺點，在應(yīng)用時往往有其局限性，尤其不能適用于大規(guī)模的病原篩查和檢測等實際應(yīng)用。分子生物學(xué)技術(shù)，其中尤其以RT-PCR檢測技術(shù)由于其快速、靈敏、適合處理大通量的樣品等特點，在病毒檢測中顯示出其優(yōu)越性并越來越多的得以應(yīng)用，但該方法從檢測到結(jié)果的判讀仍然需要多種專用儀器，操作較為繁瑣，所需時間仍然在5小時以上，常有非特異性出現(xiàn)等缺陷。
[0004]近年來，一種新型核酸擴增技術(shù)一環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(LAMP)技術(shù)，由于其快速、簡單、特異等特點，越來越多運用于疫病診斷。LAMP技術(shù)是T.Notomi于2000年發(fā)明的一種新型核酸擴增技術(shù)，該技術(shù)主要利用4種不同的特異性引物識別靶基因6個特定區(qū)域及一種具有鏈置換特性的DNA聚合酶在等溫條件下進行高效、快速、高特異地擴增靶基因。該技術(shù)可用于微生物的快速檢測，已廣泛應(yīng)用于食品、農(nóng)業(yè)、衛(wèi)生等領(lǐng)域。近年來，LAMP技術(shù)在動物疫病診斷方面發(fā)展迅速，已開發(fā)出豬瘟病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒等LAMP檢測方法，但目前尚未見有檢測豬輪狀病毒LAMP檢測技術(shù)的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種輪狀病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增檢測引物組及基于該環(huán)介導(dǎo)等溫擴增檢測引物組的檢測試劑盒，利用該檢測試劑盒可以特異性的檢測輪狀病毒(rotavirus)。
[0006]本發(fā)明輪狀病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增檢測引物組，其由下列引物組成；
[0007]上游引物F3:5' -ACCATTCCTTAACGCACAA-3' (SEQ ID N0.1)；
[0008]下游引物B3:5' -GGCAACATCAGCATAGTCTT-3' (SEQ ID N0.2)；
[0009]上游內(nèi)引物FIP:5'-
[0010]CAAGCACAAAGTCGAAGTTAGAAATAAATCTTCCAATTACTGGGTC-3' (SEQ ID N0.3)；
[0011]下游內(nèi)引物BIP:5' -CTGAAGCTGCAACAGAAATAAACGATCCTGTTGGCCATCCT-3' (SEQID N0.4)。
[0012]本發(fā)明輪狀病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增檢測引物組是根據(jù)豬輪狀病毒VP4基因中較為保守的六個序列片段設(shè)計的兩個特異性內(nèi)引物(上游引物和下游引物)和兩個特異性外引物(上游內(nèi)引物和下游內(nèi)引物)，該保守基因序列為豬輪狀病毒所共有的，以保證基于該輪狀病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增檢測引物組的檢測試劑盒檢測不同來源的豬輪狀病毒的可靠性。
[0013]基于上述的輪狀病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增檢測引物組的檢測試劑盒，其包括RNA提取試劑、RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑和環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)試劑和顯色試劑，所述環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)試劑包括環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)液和Bst DNA聚合酶，所述環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)液由以下的組分組成:10ymol/L的上游引物F3、10 μ mol/L的下游引物B3、10 μ mol/L的上游內(nèi)引物FIP、10ymol/L 的下游內(nèi)引物 BIP、5mol/L Betaine、100mmol/L MgSO4U.6mmol/L dNTPs、IOXThermo pol反應(yīng)緩沖液。
[0014]所述的輪狀病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增檢測試劑盒的檢測方法，其包括以下步驟:
[0015]I)樣品病毒RNA的提取；
[0016]2)將步驟I提取的病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA ；
[0017]3)先建立環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)體系，然后在60-65°C等溫條件下保溫30_60min完成cDNA擴增反應(yīng)；
[0018]其中，環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)體系共25μ L,具體包括:10XBst Thermo polBuffer2.5 μ LUO μ mol/L 上游引物 F30.5 μ LUO μ mol/L 下游引物 B30.5 μ LUO μ mol/L 上游內(nèi)引物 FIP4y L、10ymol/L 下游內(nèi)引物 ΒΙΡ4μ L、l.6mmol/L dNTPs2 μ L、5mol/L Betaine5y L、100mmol/LMgS040.9 μ L、8U/y L Bst DNA 聚合酶 I μ L、cDNAl μ L，其余由ddH20 補充至 25 μ L ;
[0019]4)通過顯色劑或瓊脂糖凝膠電泳確認是否存在擴增產(chǎn)物。
[0020]本發(fā)明針對傳統(tǒng)檢測豬輪狀病毒技術(shù)操作繁瑣，需要昂貴儀器，敏感性差等問題，采用環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)，建立檢測豬輪狀病毒的LAMP檢測試劑盒及檢測方法，該方法使用儀器簡單、成本低、檢測快速、特異性強，敏感度高，可肉眼判斷結(jié)果，適于基層現(xiàn)場檢測，從而可解決其臨床上診斷困難的問題。本發(fā)明上述檢測方法中，所述步驟I的具體操作為:
[0021]I)每50-IOOmgRNA樣品用ImL Trizol液試劑對組織進行裂解；
[0022]2)將上述RNA樣品的Trizol液轉(zhuǎn)入EP管中，在15_30°C下放置5分鐘；
[0023]3)在上述EP管中，按照每ImL Trizol液加0.2mL氯仿的量加入氯仿，蓋上EP管蓋子，用力震蕩15秒，在15°C-30°C下放置2-3分鐘后，在2°C-8°C下以12000g的離心力離心15分鐘；取上層水相置于另一根EP管中，按照每ImL Trizol液加0.5mL異丙醇的量加入異丙醇，在15°C-30°C下放置10分鐘，然后在2°C-8°C下以12000g的離心力離心10分鐘；棄上清液，按照每ImL Trizol液加lmL75%乙醇進行洗滌，渦旋混合，在2°C-8°C下以7500g的離心力離心5分鐘，棄上清液；讓沉淀的RNA在室溫下自然干燥；然后用Rnase-free water 溶解 RNA 沉淀。
[0024]所述步驟I提取的RNA樣品0D26Q/0D28Q在1.7-2.0間，濃度為IO-1OOg/ μ L。
[0025]本發(fā)明上述檢測方法中，所述步驟2的具體操作為:在1.5mL離心管中配制如下反應(yīng)液:將RNA溶液10 μ L、隨機弓丨物I μ L、DEPC水I μ L離心混勻；然后在_70°C孵育5min，立即置(TC冷卻，接著在離心管中加入5XM-MLV buffer4y L、RNA酶抑制I μ L、dNTP mixtureI μ L、M-MLV反轉(zhuǎn)錄晦I μ L、DEPC水5 μ L，將上述反應(yīng)液置42°C溫育60min，反轉(zhuǎn)錄完成后，95滅活M-MLV，即得cDNA產(chǎn)物。
[0026]本發(fā)明采用4條LAMP特異性引物及Bst DNA聚合酶為等主要成分構(gòu)成的LAMP反應(yīng)液，采用環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)，建立檢測豬輪狀病毒的LAMP檢測試劑盒及檢測方法。因環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)具有敏感、特異、快速、可靠、簡便的特點，使得它與其它診斷技術(shù)相t匕，更適合于臨床實驗室診斷。本發(fā)明建立的豬輪狀病毒環(huán)介導(dǎo)等溫擴增快速檢測方法，可提高臨床診斷的速度和準確性，且操作簡單，成本低廉，適合基層使用，能有效診斷該病原引起的豬輪狀病毒感染，該病得以控制后，將顯著提高生豬出欄率、降低生豬死亡率，提高生豬產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟效益。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0027]下面結(jié)合附圖和【具體實施方式】對本發(fā)明作進一步詳細的說明:
[0028]圖1為實施例3敏感性實驗的檢驗電泳圖；
[0029]圖2為實施例特異性實驗的檢驗電泳圖。 【具體實施方式】
[0030]下面結(jié)合【具體實施方式】對本發(fā)明作進一步詳細的說明:
[0031]本發(fā)明本發(fā)明輪狀病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增檢測引物組，其由下列引物組成；
[0032]上游引物F3:5' -ACCATTCCTTAACGCACAA-3'；
[0033]下游引物B3:5' -GGCAACATCAGCATAGTCTT-3'；
[0034]上游內(nèi)引物FIP:5'-
[0035]CAAGCACAAAGTCGAAGTTAGAAATAAATCTTCCAATTACTGGGTC-3'；
[0036]下游內(nèi)引物BIP:5' -CTGAAGCTGCAACAGAAATAAACGATCCTGTTGGCCATCCT-3'。
[0037]基于上述的輪狀病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增檢測引物組的檢測試劑盒，其包括RNA提取試劑、RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑和環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)試劑和顯色試劑，所述環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)試劑包括環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)液和Bst DNA聚合酶，所述環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)液由以下的組分組成:10 μ mol/L的上游引物F3 (SEQ ID N0.1)、10 μ mol/L的下游引物B3 (SEQ IDN0.2)、10ymol/L 的上游內(nèi)引物 FIP(SEQ ID N0.3)、10 μ mol/L 的下游內(nèi)引物 BIP(SEQ IDN0.4)、5mol/L Betaine、100mmol/L MgS04、1.6mmol/L dNTPs> 10X Thermo pol 反應(yīng)緩沖液。
[0038]所述的輪狀病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增檢測試劑盒的檢測方法，其包括以下步驟:
[0039]I)樣品病毒RNA的提取；
[0040]2)將步驟I提取的病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA ；
[0041]3)先建立環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)體系，然后在60-65°C等溫條件下保溫30_60min完成cDNA擴增反應(yīng)；
[0042]其中，環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)體系共25μ L,具體包括:10XBst Thermo polBuffer2.5 μ LUO μ mol/L 上游引物 F30.5 μ LUO μ mol/L 下游引物 B30.5 μ LUO μ mol/L 上游內(nèi)引物 FIP4y L、10ymol/L 下游內(nèi)引物 ΒΙΡ4μ L、l.6mmol/L dNTPs2 μ L、5mol/L Betaine5y L、100mmol/LMgS040.9 μ L、8U/y L Bst DNA 聚合酶 I μ L、cDNAl μ L，其余由ddH20 補充至 25 μ L ;
[0043]4)通過顯色劑或瓊脂糖凝膠電泳確認是否存在擴增產(chǎn)物。
[0044]具體實施例1對某一例疑似RV感染樣品進行LAMP檢測
[0045](I)樣品RNA的提??；
[0046]I)組織樣品，每50-IOOmgRNA樣品用ImL Trizol液試劑對組織進行裂解；
[0047]2)將上述RNA樣品的Trizol液轉(zhuǎn)入EP管中，在15_30°C下放置5分鐘；
[0048]3)在上述EP管中，按照每ImL Trizol液加0.2mL氯仿的量加入氯仿，蓋上EP管蓋子，用力震蕩15秒，在15°C-30°C下放置2-3分鐘后，在2°C-8°C下以12000g的離心力離心15分鐘；取上層水相置于另一根EP管中，按照每ImL Trizol液加0.5mL異丙醇的量加入異丙醇，在15°C-30°C下放置10分鐘，然后在2°C-8°C下以12000g的離心力離心10分鐘；棄上清液，按照每ImL Trizol液加lmL75%乙醇進行洗滌，渦旋混合，在2°C-8°C下以7500g的離心力離心5分鐘，棄上清液；讓沉淀的RNA在室溫下自然干燥；然后再用Rnase-free water 溶解 RNA 沉淀。
[0049](2 )將步驟I提取的病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA ；
[0050]在1.5mL離心管中配制如下反應(yīng)液:將RNA溶液10 μ L、隨機引物I μ L、DEPC水I μ L離心混勻；然后在_70°C孵育5min，立即置0°C冷卻，接著在離心管中加入5XM-MLVbuffer4y L.RNA 酶抑制 I μ L、dNTP mixture I μ L、M_MLV 反轉(zhuǎn)錄晦 I μ L、DEPC 水 5μ L，將上述反應(yīng)液置42°C溫育60min，反轉(zhuǎn)錄完成后，95滅活M-MLV，即得cDNA產(chǎn)物。
[0051](3)先建立環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)體系，然后在60-65°C等溫條件下保溫30_60min完成cDNA擴增反應(yīng)；其中，環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)體系共25 μ L，具體包括:10XBst Thermopol Buffer2.5μ L、10ymol/L 上游弓丨物 F30.5 μ L、10 μ mol/L 下游弓丨物 B30.5 μ L、10 μ mol/L 上游內(nèi)引物 FIP4 μ LUOy mol/L 下游內(nèi)引物 BIP4 μ L、1.6mmol/L dNTPs2 μ L、5mol/L Betaine5y LUOOmmol/L MgSO40.9 μ L、8U/μ L Bst DNA 聚合酶 I μ L、cDNAl μ L，其余由ddH20補充至25yL；
[0052](4)通過顯色劑確認是否存在擴增產(chǎn)物。
[0053]在待檢的每個反應(yīng)管中加入I μ L SYBR Green I染料，肉眼觀察顏色變化，若陽性對照呈綠色，陰性對照呈橙色，說明反應(yīng)有效。若被檢測樣品反應(yīng)液顏色變?yōu)榫G色，說明待檢樣品為含有豬輪狀病毒。
[0054]其結(jié)果為:陰極對照(模板為豬流行性腹瀉病毒核酸)黃色，不含有豬輪狀病毒，2號樣品為本實施例的疑似RV感染樣品，其顏色為綠色，含有豬輪狀病毒。
[0055]具體實施例2對另一例疑似RV感染樣品進行LAMP檢測
[0056](I)樣品RNA的提??；
[0057]I)每50-IOOmgRNA樣品用ImL Trizol液試劑對組織進行裂解；
[0058]2)將上述RNA樣品的Trizol液轉(zhuǎn)入EP管中，在15_30°C下放置5分鐘；
[0059]3)在上述EP管中，按照每ImL Trizol液加0.2mL氯仿的量加入氯仿，蓋上EP管蓋子，用力震蕩15秒，在15°C-30°C下放置2-3分鐘后，在2°C-8°C下以12000g的離心力離心15分鐘；取上層水相置于另一根EP管中，按照每ImL Trizol液加0.5mL異丙醇的量加入異丙醇，在15°C-30°C下放置10分鐘，然后在2°C-8°C下以12000g的離心力離心10分鐘；棄上清液，按照每ImL Trizol液加lmL75%乙醇進行洗滌，渦旋混合，在2°C-8°C下以7500g的離心力離心5分鐘，棄上清液；讓沉淀的RNA在室溫下自然干燥；用Rnase-freewater溶解RNA沉淀。
[0060](2)將步驟I提取的病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA ；
[0061]在1.5mL離心管中配制如下反應(yīng)液:將RNA溶液10 μ L、隨機引物I μ L、DEPC水I μ L離心混勻；然后在_70°C孵育5min，立即置0°C冷卻，接著在離心管中加入5XM-MLVbuffer4y L.RNA 酶抑制 I μ L、dNTP mixture I μ L、M_MLV 反轉(zhuǎn)錄晦 I μ L、DEPC 水 5μ L，將上述反應(yīng)液置42°C溫育60min，反轉(zhuǎn)錄完成后，95滅活M-MLV，即得cDNA產(chǎn)物。
[0062](3)先建立環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)體系，然后在60-65°C等溫條件下保溫30_60min完成cDNA擴增反應(yīng)；其中，環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)體系共25 μ L，具體包括:10XBst Thermopol Buffer2.5μ L、10ymol/L 上游弓丨物 F30.5 μ L、10 μ mol/L 下游弓丨物 B30.5 μ L、10 μ mol/L 上游內(nèi)引物 FIP4 μ LUOy mol/L 下游內(nèi)引物 BIP4 μ L、1.6mmol/L dNTPs2 μ L、5mol/L Betaine5y LUOOmmol/L MgSO40.9 μ L、8U/μ L Bst DNA 聚合酶 I μ L、cDNAl μ L，其余由ddH20補充至25yL；
[0063](4)通過瓊脂糖凝膠電泳確認是否存在擴增產(chǎn)物。
[0064]待LAMP反應(yīng)結(jié)束后，取I μ L反應(yīng)產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，陽性對照呈階梯狀特異擴增，而陰性對照無擴增說明反應(yīng)有效，在此基礎(chǔ)上，若待檢測樣品呈階梯狀特異擴增則為RV陽性，若無擴增則為RV陰性。
[0065]其結(jié)果為:陰極對照(模板為豬流行性腹瀉病毒核酸)無階梯狀特異擴增，不含有豬輪狀病毒，2號樣品為本實施例的疑似RV感染樣品，其呈階梯狀特異擴增，含有豬輪狀病毒。
[0066]實施例3敏感 性試驗:
[0067]將實施例2樣品的RNA從10°-10_7進行10倍梯度稀釋，然后按照實施例2中的步驟2到4的方法進行反轉(zhuǎn)錄、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增和擴增產(chǎn)物的檢驗，驗證本發(fā)明的靈敏度。如圖1所示，采用瓊脂糖凝膠電泳進行檢驗發(fā)現(xiàn)，1-5泳道分別為10_3，10_4，10_5，10_6，10_7稀釋度的cDNA模板，其中，10_3，10_4，10_5，10_6稀釋度的cDNA模板都呈階梯狀特異擴增。試驗結(jié)果表明，本發(fā)明LAMP法檢測靈敏度可達到ΙΟ—6稀釋度(含量為IOpg)。
[0068]實施例4特異性試驗
[0069]將豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬瘟病毒及實施例2確定含有豬輪狀病毒陽性的樣品，按照實施例2步驟2到4的LAMP法再次檢測。檢測結(jié)果如圖2所示，1-3泳道分別為豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬瘟病毒，無階梯狀特異擴增，為陰性；這三種已知陰性的樣品，在LAMP檢測結(jié)果中仍然呈現(xiàn)陰性；4泳道為豬輪狀病毒，呈階梯狀特異擴增，該樣品在LAMP檢測結(jié)果中仍然呈現(xiàn)陽性。表明LAMP檢測結(jié)果和PCR檢測結(jié)果相吻合，驗證了本發(fā)明所建立方法和試劑盒的特異性。
[0070]序列表
[0071]〈110〉龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院
[0072]〈120〉輪狀病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增檢測引物組及試劑盒和檢測方法
[0073]<160>4
[0074]<210>1
[0075]<211>19
【權(quán)利要求】
1.輪狀病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增檢測引物組，其特征在于:其由下列引物組成； 上游引物 F3:5' -ACCATTCCTTAACGCACAA-3'； 下游引物 B3:5' -GGCAACATCAGCATAGTCTT-3'； 上游內(nèi)引物FIP:5'-
CAAGCACAAAGTCGAAGTTAGAAATAAATCTTCCAATTACTGGGTC-3'； 下游內(nèi)引物 BIP:5' -CTGAAGCTGCAACAGAAATAAACGATCCTGTTGGCCATCCT-3'。
2.基于權(quán)利要求1所述的輪狀病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增檢測引物組的檢測試劑盒，其特征在于:其包括RNA提取試劑、RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑和環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)試劑和顯色試劑，所述環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)試劑包括環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)液和Bst DNA聚合酶，所述環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)液由以下的組分組成:10iimol/L的上游引物F3、10iimol/L的下游引物B3、10 u mol/L 的上游內(nèi)引物 FIPUO u mol/L 的下游內(nèi)引物 BIP、5mol/L BetaineUOOmmol/LMgS04、1.6mmol/L dNTPs、10XThermo pol 反應(yīng)緩沖液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的輪狀病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增檢測試劑盒的檢測方法，其特征在于:其包括以下步驟: 1)樣品病韋RNA的提?。? 2)將步驟I提取的病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA； 3)先建立環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)體系，然后在60-65°C等溫條件下保溫30-60min完成cDNA擴增反應(yīng)； 其中，環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)體系共25 ii L,具體包括:10 X Bst Thermo polBuffer2.5 ii L、10ii mol/L 上游引物 F30.5 u LUO u mol/L 下游引物 B30.5 u LUO u mol/L 上游內(nèi)引物 FIP4ii L、10ii mol/L 下游內(nèi)引物 BIP4y L、l.6mmol/L dNTPs2 y L、5mol/L Betaine5ii L、100mmol/LMgS040.9 L、8U/ii L Bst DNA 聚合酶 I y L、cDNAl y L，其余由ddH20 補充至 25 ii L ; 4)通過顯色劑或瓊脂糖凝膠電泳確認是否存在擴增產(chǎn)物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的輪狀病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增檢測試劑盒的檢測方法，其特征在于:所述步驟I的具體操作為: 1)每50-IOOmgRNA樣品用ImLTrizol液試劑對組織進行裂解； 2)將上述RNA樣品的Trizol液轉(zhuǎn)入EP管中，在15_30°C下放置5分鐘； 3)在上述EP管中，按照每ImLTrizol液加0.2mL氯仿的量加入氯仿，蓋上EP管蓋子，用カ震蕩15秒，在15°C-30°C下放置2-3分鐘后，在2°C-8°C下以12000g的離心カ離心15分鐘；取上層水相置于另ー根EP管中，按照每ImL Trizol液加0.5mL異丙醇的量加入異丙醇，在15°C-30°C下放置10分鐘，然后在2°C-8°C下以12000g的離心カ離心10分鐘；棄上清液，按照每ImL Trizol液加lmL75%こ醇進行洗滌，渦旋混合，在2°C-8°C下以7500g的離心カ離心5分鐘，棄上清液；讓沉淀的RNA在室溫下自然干燥；然后用Rnase-free water 溶解 RNA 沉淀。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的輪狀病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增檢測試劑盒的檢測方法，其特征在于:所述步驟I提取的RNA樣品0D26Q/0D28Q在1.7-2.0間，濃度為IO-1OOg/yし
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的輪狀病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增檢測試劑盒的檢測方法，其特征在于:所述步驟2的具體操作為:在1.5mL離心管中配制如下反應(yīng)液:將RNA溶液10yL、隨機引物I μ L、DEPC水I μ L離心混勻；然后在_70°C孵育5min，立即置0°C冷卻，接著在離心管中加入5XM-MLVbuffer4y L、RNA 酶抑制 lyL、dNTP mixture I μ L、M-MLV 反轉(zhuǎn)錄晦 I μ L、DEPC 水 5 μ L，將上述反應(yīng)液置 42°C溫育60min，反轉(zhuǎn)錄完成后，95滅活M-MLV，即得cDNA產(chǎn)物。
【文檔編號】C12Q1/70GK103451315SQ201310258549
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年6月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月26日
【發(fā)明者】鄭新添, 楊小燕, 黃翠琴 申請人:龍巖學(xué)院