轉(zhuǎn)錄因子Os11g39000.2在改變水稻籽粒性狀中的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種水稻轉(zhuǎn)錄因子Os11g39000.2基因在改變水稻籽粒性狀方面應用。其是將轉(zhuǎn)錄因子基因Os11g39000.2的CDS序列通過Gateway系統(tǒng)構建到4個VP16序列下游，轉(zhuǎn)化水稻品種kitaake，使轉(zhuǎn)基因水稻的籽粒變長，變寬。本發(fā)明通過轉(zhuǎn)基因手段，使水稻籽粒變長，變寬，獲得的改善籽粒性狀，對于詳細闡明水稻籽粒變化調(diào)控的分子機理，具有重要的理論價值，因此在生產(chǎn)中對于提高水稻產(chǎn)量具有重要的應用價值。
【專利說明】轉(zhuǎn)錄因子0s11g39000. 2在改變水稻籽粒性狀中的應用

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及遺傳工程領域，具體地說，涉及水稻轉(zhuǎn)錄因子0sllg39000.2基因的應 用。

【背景技術】
[0002] 水稻（Oryza sativa L.)是我國和全世界重要的糧食作物，世界1/2以上人口以 水稻為主食，因此水稻產(chǎn)量性狀一直以來倍受科學家們的關注，而水稻籽粒大小則是影響 產(chǎn)量的主要因素之一。另外，水稻作為農(nóng)作物基因功能研究的模式植物，與其相關的遺傳學 和分子生物學研究一直受到研究者們的重視。水稻籽粒的生長發(fā)育是一個有次序的、選擇 性的基因表達過程，轉(zhuǎn)錄因子在其基因表達的精確調(diào)控中起到了關鍵性的作用。
[0003] 禾谷類作物的產(chǎn)量很大程度上取決于其籽粒的大小，因此水稻籽粒性狀的基因調(diào) 控是重要的研究領域。近年來，已經(jīng)通過基因克隆、QTL等技術手段揭示了至少8個基因在 控制粒型方面具有重要作用。SG1基因編碼一個功能未知的蛋白，主要在水稻根和發(fā)育的穗 中表達，該蛋白的過量表達出現(xiàn)短粒和矮化表型。SG1降低了對油菜素內(nèi)酯BR的應答，通過 減少細胞增殖從而降低諸如種子、穗軸節(jié)間等器官的伸長。SGL1是一個類SG1蛋白，具有與 SG1類似的功能，通過RNAi下調(diào)SG1及其同源基因 SGL1的表達，水稻粒長和穗軸的節(jié)間較 野生型變長（Nakagawa等，2012)。GS3位點是控制水稻粒重和粒長的主效QTL，同時也是控 制水稻粒寬和籽粒充實度的微效QTL (Fan, Xing等，2006; Mao, Sun等，2010)。PGL1是一個 非典型的不結合DNA的堿性螺旋-環(huán)-螺旋蛋白（bHLH)，過量表達PGL1增加了籽粒長度和 重量。APG是PGL1的拮抗性互作因子，兩者都定位在核內(nèi)。PGL1/APG介導的籽粒長度增加 是由于內(nèi)穎細胞長度增加引起的。APG和PGL1不影響已知籽粒長度調(diào)控基因 GS3和SRS3 的表達。PGL1-APG代表了一個新的籽粒長度和重量調(diào)控途徑，APG是一個負向調(diào)節(jié)子，其功 能受到PGL1的抑制（Heang等，2012)。Mi3(t)基因，來源于秈型水稻Y34,該基因能使粒長 縮短35. 7%?47. 4%，千粒重降低45. 9%?62. 4%，它主要控制籽粒長度，產(chǎn)生小粒（劉明偉 等，2005)。此外，控制水稻籽粒性狀的基因還有gGL7和gGL7-2?？傊刂扑咀蚜０l(fā)育 是一個復雜過程，涉及到多基因多條途徑的協(xié)調(diào)控制，目前發(fā)現(xiàn)調(diào)控該性狀的基因不多，調(diào) 控籽粒發(fā)育的分子機理尚未闡明，因此，尋找控制籽粒性狀發(fā)育的基因和新的發(fā)掘手段對 作物改良并提高作物產(chǎn)量具有重要意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了解決上述技術問題，本發(fā)明提供一種融合蛋白，該融合蛋白包括單純皰疹病 毒（Herpes simplex virus)的 VP16 蛋白和水稻轉(zhuǎn)錄因子 0sllg39000. 2。
[0005] 在本發(fā)明一實施例中，該融合蛋白為（VP16)4-Linker-0sllg39000. 2 ;其中Linker 由39個柔性氨基酸串聯(lián)而成（SEQ ID No. 3)，其核苷酸序列如SEQ ID No. 12所示；VP16 為來自單純皰疫病毒（Herpes simplex virus)的VP16蛋白（其氨基酸序列為Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu)，（VP16)4 即 VP64,是由 4 個 VP16 功能域基序由 GlySer間隔融合在一起組成，其核苷酸序列如SEQIDN0.4所示，氨基酸序列如SEQID No. 9,，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序 列；0sllg39000. 2為水稻轉(zhuǎn)錄因子0sllg39000. 2,其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，其氨 基酸序列如SEQ ID No. 2所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有 同等功能的氨基酸序列。
[0006] 本發(fā)明還提供了用于擴增0sllg39000. 2基因的引物，正向引物F1 :
[0007] 5,-CAAAAAAGCAGGCTTC ATGTCGTCGAGCCGGCG-3'
[0008] 和反向引物R1:
[0009] 5'-CAAGAAAGCTGGGTCCATGAGTAGGCTACGGATGAGG-3' 。
[0010] 本發(fā)明還提供編碼所述融合蛋白的基因，以及在嚴格條件下，可與該基因的核苷 酸序列雜交的核苷酸序列；其中，所述嚴格條件為65°C，在0. 1XSSPE或0. 1XSSC、0. 1%SDS 的溶液中雜交并洗膜。
[0011] 本發(fā)明還提供含有編碼所述融合蛋白的基因的載體。所述載體為任一種可引導外 源基因在宿主中表達的載體。優(yōu)選地，所述載體為植物雙元表達載體(例如，PCAMBIA1301 )。 在將本發(fā)明編碼所述融合蛋白的基因構建到植物表達載體中時，可在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前 添加任一種強啟動子(例如，玉米強啟動子Ubiquitin)或誘導型啟動子。此外，在將本發(fā)明 編碼所述融合蛋白的基因構建到植物表達載體中時，還可以使用增強子，且這些增強子區(qū) 域必須與編碼序列的閱讀框相同，以確保整條序列的翻譯。
[0012] 本發(fā)明還提供含有編碼所述融合蛋白的基因的轉(zhuǎn)基因細胞系。
[0013] 本發(fā)明還提供含有編碼所述融合蛋白的基因的工程菌。
[0014] 本發(fā)明還提供所述融合蛋白、編碼所述融合蛋白的基因在增加水稻粒長、粒寬及 千粒重中的應用。
[0015] 本發(fā)明進一步提供水稻轉(zhuǎn)錄因子0sllg39000.2基因的應用，其是將水稻轉(zhuǎn)錄因 子0sllg39000. 2基因的⑶S序列（完整翻譯區(qū)）構建到4個轉(zhuǎn)錄因子激活基序VP16的下 游，轉(zhuǎn)化植物，篩選并最終獲得轉(zhuǎn)基因植物。
[0016] 前述的應用，其是將水稻轉(zhuǎn)錄因子0sllg39000. 2基因的⑶S序列通過Gateway系 統(tǒng)構建到4個轉(zhuǎn)錄因子激活基序VP16的下游，轉(zhuǎn)化水稻(例如，水稻品種'kitaake'），從而 使轉(zhuǎn)基因水稻籽粒變長、變寬。
[0017] 攜帶有編碼所述融合蛋白的基因的表達載體可通過使用Ti質(zhì)粒、植物病毒載體、 直接DNA轉(zhuǎn)化、微注射、電穿孔等常規(guī)生物技術方法導入植物細胞中（Weissbach，1998， Method for Plant Molecular Biology VIII，Academy Press，New York，第 411-463 頁； Geiserson 和 Corey,1998, Plant Molecular Biology, 2nd Edition)。
[0018] 本發(fā)明首次利用轉(zhuǎn)錄因子激活基序VP64 (即4個轉(zhuǎn)錄因子激活基序VP16)與水稻 轉(zhuǎn)錄因子0sllg39000. 2基因融合構建得到組成型轉(zhuǎn)錄因子，并轉(zhuǎn)化到農(nóng)作物，并使轉(zhuǎn)基因 水稻種子明顯變長、變寬、千粒重增加，具有較好的增產(chǎn)潛力。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0019] 圖1為本發(fā)明實施例1中nVP64-hyg_asRED載體圖譜；
[0020] 圖2為本發(fā)明實施例1中ubi :VP64-0sllg39000. 2載體圖譜；
[0021] 圖3為本發(fā)明Western blot檢測VP64-0sllg39000. 2轉(zhuǎn)基因陽性株系，其中WT 為野生型水稻 'kitaake'，V1282H-06、V1282H-13 為 VP64-0sllg39000. 2 轉(zhuǎn)基因水稻株系；
[0022] 圖4為本發(fā)明轉(zhuǎn)基因材料籽粒性狀的表型，其中WT為野生型水稻'kitaake'， V1282H-06、V1282H-13為轉(zhuǎn)基因水稻株系；
[0023] 圖5為本發(fā)明轉(zhuǎn)基因材料籽粒性狀數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，其中WT為野生型水稻 'kitaake'，V1282H-06、V1282H-13 為轉(zhuǎn)基因水稻株系。

【具體實施方式】
[0024] 以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神 和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。
[0025] 若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規(guī)手段。
[0026] 實施例10sllg39000. 2基因的分離和植物表達載體構建
[0027] 在植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫 http://planttfdb. cbi. edu. cn/index. php?sp=0sj 中找 到0sllg39000. 2基因，根據(jù)其序列設計PCR擴增引物：
[0028] F1:5'-CAAAAAAGCAGGCTTC ATGTCGTCGAGCCGGCG-3'
[0029] 和反向引物R1:
[0030] 5' -CAAGAAAGCTGGGTCCATGAGTAGGCTACGGATGAGG-3'，以野生型日本晴水稻總 cDNA 為模板，進行PCR獲得0sllg39000. 2全序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0031] 按照PrimeSTAR聚合酶擴增體系和反應程序進行PCR。此過程中包含兩輪PCR，第 一輪PCR的引物用加部分adaptor attB接頭的基因引物F1和R1，而第二輪的模板用第一 輪的 PCR 產(chǎn)物，并且引物用完整的 adaptor attB 引物，attB5' adaptor :5' -GTGGGGACAAGTT TGTACAAAAAAGCAGGCTTC-3'，attB3' adaptor : 5' -GTGGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTC-3'。 將PCR產(chǎn)物克隆到連接pDONER克隆載體(購自Invitrogen)上，經(jīng)測序鑒定得到與目的基 因完全相同的序列。通過LR反應將0sllg39000. 2構建到nVP64-hyg-asRED (圖1，載體全 序列如SEQ ID No. 5所示，該載體以雙元表達載體pCAMBIA1300左右邊界包含的序列為骨 架序列，通過體外重組，將ubi promoter-VP64-Gateway表達單兀、35S promoter-asRED表 達單元和35S promoter-hyg表達單元與之融合構建，得到載體nVP64-hyg-asRED)上，獲得 載體 ubi :VP64-0sllg39000. 2 (圖 2,載體全序列如 SEQ ID No. 6 所示）。
[0032] 實施例2轉(zhuǎn)基因水稻植株的獲得
[0033] 取水稻'kitaake'成熟種子，人工或機械脫殼，挑選飽滿光潔無菌斑的種子經(jīng)消毒 之后接種到誘導培養(yǎng)基上進行誘導培養(yǎng)。選擇外觀良好，生長力好的水稻愈傷組織為受體 材料，采用農(nóng)桿菌介導法將ubi :VP64-0sllg39000. 2轉(zhuǎn)入水稻愈傷組織中，用含有100 μ Μ 的乙酰丁香酮和0. D.值為0. 7的農(nóng)桿菌的ΑΑΜ轉(zhuǎn)化液進行轉(zhuǎn)化，將轉(zhuǎn)化液浸泡過的愈傷組 織置于共培養(yǎng)基上進行共培養(yǎng)，25°C暗培養(yǎng)3d后置于篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)約30d，每10d繼代 一次。然后將篩出的抗性愈傷轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上分化約20d，每10d繼代一次。將分化出 綠色小苗的抗性愈傷轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上生根，待約7d長出發(fā)達根系后煉苗，并計算轉(zhuǎn)化 所獲轉(zhuǎn)基因苗數(shù)。煉苗7d后轉(zhuǎn)移至大田生長。
[0034] 其中，誘導培養(yǎng)基配方為：N6大量+B5微量+NB有機+鐵鹽+銅鈷母液+2. 5mg/ L2, 4D+0. 6g/L酸水解酪蛋白+2. 878g/L脯氨酸+0. 5g/L谷氨酰胺+30g/L蔗糖，以水配制， 調(diào)pH至5. 8?5. 9后加入植物凝膠4g/L。
[0035] 共培養(yǎng)基配方為：N6大量+B5微量+NB有機+鐵鹽+2. 5mg/L2, 4D+0. 5g/L谷氨酰 胺+0. 6g/L酸水解酪蛋白+10g/L葡萄糖+30g/L鹿糖，以水配制，調(diào)pH至5. 2后加入植物 凝膠4g/L。滅菌后，50°C左右加入AS (乙酰丁香酮）100?200μ8/ιΛ。
[0036] 篩選培養(yǎng)基配方為：Ν6大量+Β5微量+ΝΒ有機+鐵鹽+銅鈷母液+2. 5mg/ L2, 4D+0. 6g/L酸水解酪蛋白+2. 878g/L脯氨酸+0. 5g/L谷氨酰胺+30g/L蔗糖，以水配制， 調(diào)pH至5. 8?5. 9后加入植物凝膠4g/L。滅菌后加入35mg/L潮霉素(購自上海紐津生物 技術有限公司）。
[0037] 分化培養(yǎng)基配方為：MS無機+MS-B5微量+MS有機+鐵鹽+MS-銅鈷母液+0. 05mg/ L NAA+2. Omg/L Kinetin (激動素）+30g/L山梨醇+2g/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖，以水配 制，調(diào)pH至5. 8?5. 9后加入植物凝膠4g/L。
[0038] 實施例3轉(zhuǎn)基因陽性株系的鑒定
[0039] 為檢測ubi :VP64-0sllg39000. 2基因在T2代轉(zhuǎn)基因水稻中的過表達情況，利用 VP64抗體對其在蛋白質(zhì)水平上進行鑒定，經(jīng)過SDS-PAGE蛋白電泳一免疫印記一免疫熒光 反應，Western Blot鑒定結果表明轉(zhuǎn)基因植株存在目的蛋白，而野生型未雜出條帶（圖3)。
[0040] 具體的Western Blot實驗流程如下：
[0041] 將適量樣品放入液氮冰凍后研磨成粉末，加入適量上樣緩沖液混勻，12000rpm離 心10分鐘；取5 μ 1上清加樣，以90V電壓SDS-PAGE電泳30分鐘后，120V電泳60-90分鐘， 當溴酚藍到達凝膠的底端即可停止電泳；電泳后采用半干轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)膜，并用麗春紅染色液 對膜進行染色，觀察轉(zhuǎn)膜效果；轉(zhuǎn)膜完畢后，將膜放入含5%的脫脂奶粉的PBST溶液中封閉 室溫封閉60分鐘或4°C過夜；室溫下一抗（VP64抗體）孵育1小時或4°C孵育過夜,然后用 PBST洗滌3次，每次5分鐘；室溫下二抗(羊抗兔，購自Abmart，貨號M21002S)孵育1小時， 然后用PBST洗滌3次，每次5分鐘；在膜上加入底物，進行曝光。
[0042] 其中，VP64抗體是由艾比瑪特生物醫(yī)藥(上海）有限公司根據(jù)VP64的氨基酸序列 合成多肽作為特異抗原而制備的兔源多抗。
[0043] 實施例4轉(zhuǎn)基因水稻表型分析和考種分析
[0044] 將本發(fā)明獲得的轉(zhuǎn)基因水稻種子和野生型（'kitaake'）水稻種子進行比較，發(fā)現(xiàn) 轉(zhuǎn)基因材料的籽粒明顯變長、變寬?？挤N數(shù)據(jù)分析表明，轉(zhuǎn)基因水稻籽粒的長、寬均顯著大 于野生型水稻籽粒。
[0045] 雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。
【權利要求】
1. 一種融合蛋白，其特征在于，該融合蛋白包括單純皰疫病毒（Herpes simplex virus)的VP16蛋白和水稻轉(zhuǎn)錄因子0sllg39000. 2。
2. 根據(jù)權利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白為（VP16) 4-Linker-0sllg39000. 2,其中 Linker 為 SEQ ID No. 3 所示的氨基酸序列。
3. 編碼權利要求1或2所述融合蛋白的基因。
4. 含有權利要求3所述基因的載體。
5. 含有權利要求3所述基因的工程菌。
6. 權利要求1或2所述融合蛋白或權利要求3所述基因在使水稻籽粒變長，變寬及提 高千粒重中的應用。
7. 水稻轉(zhuǎn)錄因子0sllg39000. 2基因在改良水稻籽粒性狀中的應用。
8. 根據(jù)權利要求7所述的應用，其特征在于，其是將水稻轉(zhuǎn)錄因子0sllg39000. 2基因 的CDS序列構建到4個轉(zhuǎn)錄因子激活基序VP16的下游，轉(zhuǎn)化植物，篩選并最終獲得轉(zhuǎn)基因 植物。
9. 根據(jù)權利要求8所述的應用，其特征在于，其是將水稻轉(zhuǎn)錄因子0sllg39000. 2基因 的⑶S序列通過Gateway系統(tǒng)構建到4個轉(zhuǎn)錄因子激活基序VP16的下游，轉(zhuǎn)化水稻，從而 使轉(zhuǎn)基因水稻籽粒變寬變長，提高籽粒千粒重。
【文檔編號】C12N15/82GK104250303SQ201310259618
【公開日】2014年12月31日 申請日期:2013年6月26日 優(yōu)先權日:2013年6月26日
【發(fā)明者】劉軍, 趙濤, 劉斌, 李宏宇, 林辰濤 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所