一種發(fā)酵谷物的乳酸菌及其用途
【專利摘要】本發(fā)明一種發(fā)酵谷物的乳酸菌及其用途，涉及食品生物【技術領域】。乳酸菌Dy-1，建議的分類名稱為植物乳桿菌，即Lactobacillusplantarum；該菌株于2012年4月18日送交位于中國北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號的中國科學院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為CGMCCNo.6016。利用上述乳酸菌凍干粉發(fā)酵麥胚或大麥，其發(fā)酵液經離心所得上清液再經冷凍干燥所獲得的發(fā)酵提取物，對HT-29結腸癌、SGC-7901胃癌細胞具有顯著的促進凋亡和抑制增殖作用；對HT-29結腸癌誘發(fā)的荷瘤裸鼠模型具有顯著的抑制腫瘤生長和提高其免疫力的功能。
【專利說明】一種發(fā)酵谷物的乳酸菌及其用途
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及食品生物【技術領域】，特指用于發(fā)酵小麥胚芽、大麥等谷物的乳酸菌，通過乳酸菌發(fā)酵實現谷物中營養(yǎng)物質的生物轉化，制備具有抑制腫瘤細胞增殖和腫瘤生長的發(fā)酵提取物。
【背景技術】 [0002]目前，中國因惡性腫瘤導致死亡的人數占全球的1/4，且數量仍在不斷攀升。而對于癌癥的治療主要有手術、化療、放療及祀向療法(免疫療法、基因療法、血管生成抑制劑及定向療法)等方式，其中藥物治療是目前的主要形式。但目前大量使用的抗腫瘤藥物具有較高的毒性和副作用，開發(fā)天然安全、無毒副作用的抗腫瘤活性物質及其功能制品是癌癥患者的渴求。
[0003]天然谷物中的活性成分已經被證實具有較好的抗腫瘤活性。日本專利(200510069392.8)公開了一種抗腫瘤制劑的制備方法。該方法是將麥胚芽、大豆胚芽、米胚芽等以一定的比例混合，將混合物用110°C熱蒸汽加熱，并將蒸汽加熱產物在30°C下用曲類(小麥曲霉)等發(fā)酵48h，所得的發(fā)酵提取物具有抗腫瘤效果，其抑制率在5%~15%，該專利未對發(fā)酵提取物中的抗腫瘤成分進行分析。日本崇城大學Kouta Funamoto, et al.在2008年研究得出大麥燒酒蒸餾后的殘留物具有抗腫瘤和免疫活性，在體外能顯著抑制人肺癌細胞的生長，誘導腫瘤細胞凋亡，在體內誘導能正常老鼠血清干擾素(IFN) - Y的產生，增加自然殺傷細胞(NK)的數量，通過尾靜脈注射，無急性毒性。
[0004]以谷物為原料結合微生物發(fā)酵技術提取抗腫瘤活性也日益引起人們的關注。美國專利(2010/135580A2)采用面包酵母對新鮮麥胚進行發(fā)酵，將其上清液冷凍干燥成粉，干燥粉用乙醇提取并通過分子篩和電泳等方法獲得多肽，相對分子質量在5~100KD之間。采用該范圍的多肽進行腫瘤細胞和荷瘤動物試驗，具有減少腫瘤細胞或抑制腫瘤細胞增殖作用。但總體來看，目前上述專利和文獻報道關于發(fā)酵產物的抗腫瘤研究，主要是采用酵母菌發(fā)酵，且其對腫瘤的抑制效果尚未達到令人滿意的效果。
[0005]利用乳酸菌發(fā)酵麥胚的產物主要可以抑制真菌的生長而采用乳酸菌發(fā)酵谷物獲得抗腫瘤提取物尚未見專利或其他文獻報道。乳酸菌(lactic acid bacterium,LAB)安全無毒，無致病性，無致癌性，已在世界范圍內被公認為“GRAS”等級的食品微生物，與機體的健康息息相關。目前的報道已證實乳酸菌具有預防與治療腫瘤的功能，但其功效尚有待進一步提高。篩選能發(fā)酵谷物并獲得具有高抑制腫瘤活力產物的乳酸菌，并驗證其抗腫瘤活性，是一個全新的研究領域，具有廣闊的發(fā)展前景。

【發(fā)明內容】

[0006]本發(fā)明提供的是一種以自然發(fā)酵泡菜為原料，通過篩選、分離、富集以及常規(guī)的理化分析，從中獲得一株發(fā)酵谷物取物具有抗腫瘤作用的乳酸菌。
[0007]采用該乳酸菌發(fā)酵麥胚和大麥，控制發(fā)酵條件，獲取發(fā)酵提取物，采用MTT、細胞凋亡和細胞周期法研究其組分的體外抗腫瘤功能；采用荷瘤裸鼠模型(人源腫瘤細胞)研究該提取物體內抗腫瘤功能。
[0008]本發(fā)明通過以下步驟實現:
[0009]將采集到的泡菜樣品進行適當的梯度稀釋，涂布于MRS雙層平板上，恒溫箱中于30°C培養(yǎng)36h，待菌落長出來后進行觀察，觀察平板的生長情況，選擇平板中菌落合適(30~300個)和溶鈣圈明顯的便于挑取菌落的平板，記錄菌落特征，選擇菌落，挑取菌落。[0010]本發(fā)明乳酸菌Dy-1,其建議的分類名稱為植物乳桿菌，Lactobacillusplantarum ;該菌株于2012年4月18日送交位于中國北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號的中國科學院微生物研究所的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為 CGMCC N0.6016。
[0011]乳酸菌利用MRS液體培養(yǎng)基活化、擴大培養(yǎng)后，添加保護劑(20%脫脂乳、10%海藻糖、14%谷氨酸鈉、6%山梨醇和6%Vc)后利用真空冷凍干燥制備凍干粉，分裝于無菌真空包裝袋中密封保藏。
[0012]分別稱取篩分除雜后的新鮮麥胚和大麥，粉碎過30~140目篩，置于錐形瓶中，按照重量比1:6~1:15的比例加入蒸餾水，再加入乳酸菌到麥胚和水中，其中乳酸菌凍干粉占新鮮麥胚粉的質量為2~8%，混合均勻；將錐形瓶用紗布封口，置于恒溫培養(yǎng)箱中，在20~40°C下發(fā)酵12~72h，其中優(yōu)選發(fā)酵溫度30~35°C，發(fā)酵24~48h后，發(fā)酵物在室溫下8000~15000rpm/min離心10~40min ;收集上清液,并將其進行熱風干燥、噴霧干燥或冷凍干燥，優(yōu)選冷凍干燥，從而獲得到發(fā)酵麥胚提取物和發(fā)酵大麥提取物。
[0013]本發(fā)明的優(yōu)點:
[0014](I)本發(fā)明利用自主分離的乳酸菌，制備具有抗腫瘤功能的發(fā)酵提取物，具有自主知識產權。
[0015](2)本發(fā)明生產成本低，采用直投式發(fā)酵，方便快捷，安全穩(wěn)定，便于質控。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1PCR產物電泳圖，
[0017]圖2LFWGE對結腸癌HT-29細胞的生長抑制率，
[0018]圖3細胞凋亡圖譜，
[0019]圖4LFWGE濃度對結腸癌細胞周期的影響，
[0020]圖5LFWGE對荷瘤裸鼠瘤體積的影響，
[0021]圖6LFWGE對荷瘤裸鼠腫瘤的抑制率，
[0022]圖7FBE對結腸癌HT-29細胞的生長抑制率，
[0023]圖8FBE對荷瘤裸鼠瘤體積的影響，
[0024]圖9FBE對荷瘤裸鼠腫瘤的抑制率。
【具體實施方式】
[0025]1.乳酸菌的篩選過程
[0026]( I)初篩
[0027]將采集到的泡菜樣品進行適當的梯度稀釋，涂布于MRS雙層平板法，恒溫箱中于30°C培養(yǎng)36h，待菌落長出來后進行觀察，觀察平板的生長情況，選擇平板中菌落合適(30~300個)和溶鈣圈明顯的便于挑取菌落的平板，記錄菌落特征，選擇菌落，挑取菌落。
[0028](2)菌株初篩
[0029]將分離得到的菌株進行多次劃線或涂布分離，以獲得純菌株。從穿刺保存中挑取少量菌，進行革蘭氏染色，通過顯微觀察，對染色結果進行記錄，檢查分得菌株是否是純菌株，同時通過對菌株的形狀進行觀察，測定細菌大小，進行初步鑒定。對不純的菌再次富集和分離，方法同上。
[0030](3)菌株復篩
[0031]通過產酸產氣試驗對分得的菌株的產酸能力進行比較，以獲得產酸量高的菌株；同時通過觀察同時產酸和產氣的菌株，以獲得潛在的兼性厭氧乳酸菌。
[0032]從記錄的菌落的情況，選擇純的桿狀或鏈狀的革蘭氏陽性菌，在糖發(fā)酵產酸培養(yǎng)基進行產酸產氣試驗，接種后恒溫箱內25°C恒溫培養(yǎng)48h，然后用pH計測定pH值。
[0033]2.菌種鑒定
[0034]( I)形態(tài)學觀察
[0035]從泡菜中分離出三株產酸量最大的菌株在固體培養(yǎng)基上菌落凸起、圓形、邊緣整齊、表面光滑呈白色。在液體培養(yǎng)基中生長后混濁，兼性厭氧。革蘭氏染色觀察(見表1)，均為革蘭氏陽性，細菌為桿狀，單個或成對排列為多，少數成短鏈；菌體圓端直桿狀，寬0.8~
1.2 μ m，長I~2μπι單個或成對排列，不形成內生芽孢。下面結合實例對本發(fā)明做進一步闡述。
[0036](2)生理生化試 驗結果
[0037]從自然發(fā)酵甘藍中分離出產酸最高三株菌株，對其進行生理生化鑒定(見表2)，結果表明，它們的精氨酸產氨試驗、產硫化氫試驗、過氧化氫酶試驗、明膠液化試驗、硝酸鹽還原試驗和吲哚試驗均為陰性。乳酸定性試驗顯示，均產生乳酸。在糖發(fā)酵試驗中(見表3)，不發(fā)酵鼠李糖，部分弱發(fā)酵阿拉伯糖和松三糖，其余的糖醇均能發(fā)酵，均不產氣，經鑒定該三株菌都是植物乳桿菌(Lactobacillus Plantarum)。選擇發(fā)酵性能較好的Dy-1進行16srDNA擴增。
[0038](3) 16s rDNA PCR擴增產物的電泳圖
[0039]挑取Dy-1菌適量，加入MRS培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過夜，取ImL均液，5000X g離心5min，棄去上清液后加入300 μ L細胞裂解液和50 μ L蛋白酶K，90°C水浴裂解IOmin后，12000Xg離心IOmin取上清液，以v3通用引物進行PCR反應。PCR產物電泳圖如圖1所示。
[0040]PCR產物純化后交由上海生工測序，序列如下:
[0041 ] CTTGCAGTTCGAACGAACTTCTTGGTATCTGATCTGGTGCTTTGCATCATGATTTACATCC TGAGTGAGTGGCGAACTGGTGAGTAACACGTGGGAAACCTGCCCAGAAGCGGGGGATA ACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAACTTGGACCGCATGGTCCGAGTTTGA AAGATGGCTTCGGCTATCACTTTTGGATGGTCCCGCGGCGTATTAGCTAGATGGTGGGGT AACGGCTCACCATGGCAATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGG ACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGA CGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTC TGTTGTTAAAGAAGAACATATCTGAGAGTAACTGTTCAGGTATTGACGGTATTTAACCAG AAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTC CGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCTT CGGCTCAACCGAAGAAGTGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAG TGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAG GCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGTATGGGTAGCAAACAGGATT AGATACCCTGGTAGTCCATACCGTAAaCGATGAATGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGa AACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAA GCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATACTATGCAAATCTAAGAGATTAGACGTTCCCTTCGGGGACATGGATACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCG
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[0042]通過在Genbank中Blast分析結果可知，Dy-1的16S rRNA基因序列與Lactobacillus plantarum strain L3的16S rRNA基因序列只有3個喊基的差異且相似性為 99% 以上，應屬于同一種即:Lactobacillus plantarum。
[0043]3.用途
[0044](I)發(fā)酵谷物提取物的體外抗腫瘤作用:將本發(fā)明的乳酸菌發(fā)酵小麥胚芽或大麥，其提取物以0.125~4mg/mL的濃度加入到人的HT-29結腸癌、SGC-7901胃癌細胞中，培養(yǎng)一段時間(如48h)，觀察評價其抗腫瘤效果。其方法如下:
[0045]①細胞增殖試驗:采用MTT法。
[0046]②細胞凋亡與細胞周期試驗:采用流式細胞儀進行分析。
[0047]與未加本發(fā)明發(fā)酵麥胚提取物的情況相比較，腫瘤活細胞數可降至50%或以下，最優(yōu)的可使活細胞數降至10%或以下；其腫瘤凋亡率可達50%或以上，最高可達90%或以上。
[0048](2)發(fā)酵谷物提取物的體內抗腫瘤作用:將4~6周齡的BALB/c裸鼠的腹部皮下接種人結腸癌HT-29細胞(接種量:I X IO6~2 X IO7細胞/裸鼠)，2~15天后肉眼可見裸鼠接種部位有腫瘤長出后開始灌胃乳酸菌發(fā)酵麥胚或大麥的提取物；將荷瘤裸鼠隨機分成
5組，即陰性對照組、5-FU陽性對照組、高劑量組、低劑量組和高劑量組+5-FU組，每組10~12只裸鼠，連續(xù)灌胃14~50天；每日測定瘤體積，繪制腫瘤生長曲線，根據腫瘤重量計算抑瘤率。
[0049]與陰性對照組相比較，灌胃組的抑瘤率可達30%~60%。
[0050]實施例1
[0051]稱取粉碎的新鮮麥胚粉20.0g于500mL錐形瓶中，向其中加入IOOml的蒸懼水,再加入0.4g的植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum Dy-1),混合均勻；將錐形瓶用紗布封口，置于恒溫培養(yǎng)箱中在30°C下發(fā)酵24h后，將其在12000rpm/min下離心20min收集上清液進行冷凍干燥，得到發(fā)酵麥胚提取物(LFWGE)
[0052]稱取0.5g的LFWGE溶于50ml的去離子水中，過0.22um的濾膜，將濾液按照0.125mg/mL、0.25mg/mL、0.5mg/mL、l.0mg/mL、2.0mg/ml>4.0mg/ml 分別加入到 HT-29 結腸癌細胞中，培養(yǎng)細胞24h、48h、72h，并分別通過MTT法測定LFWGE對結腸癌HT-29細胞的抑制率(圖2)。結果表明，提取物濃度與腫瘤細胞增殖抑制率呈正相關，最大抑制率達到94.2%ο
[0053]將1.0mg/mL的LFWGE加入到結腸癌細胞中，培養(yǎng)細胞48h后，收集細胞，流式細胞儀檢測細胞凋亡(圖3)。結果表明，早期凋亡是66.5% (圖2，右下角)，晚期凋亡是27.6%(圖2，右上角)。將0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.8mg/mL的LFWGE加入到結腸癌HT-29細胞中，培養(yǎng)細胞48h后，收集細胞，流式細胞儀檢測細胞周期(圖4)。結果表明，隨著濃度的增加，G1期也隨之延長，而S期則隨之縮短，說明LFWGE能有效阻滯細胞的G1期。
[0054]實施例2 [0055]將上述制備的LFWGE溶解于生理鹽水中，制備成濃度為0.2g/ml和0.lg/ml水溶液，并且通過無菌膜處理備用。人HT-29結腸癌細胞接種到4-6周齡的BALB/c裸鼠腹部皮下，2 天后采用 2g/kg/d、lg/kg/d、2g/kg/d+5-FU (25mg/kg/d, 1.p, 7 天)劑量的 LFWGE 給荷瘤裸鼠灌胃，連續(xù)灌胃30天，同時與灌胃相同劑量的生理鹽水組和腹腔注射(25mg/kg/d, 1.p，7天)的5-FU組進行比較，通過測定瘤體積的變化和最后的抑瘤率來確定LFWGE的抗腫瘤效果(圖5，6)。結果表明，2g/kg/d、lg/kg/d、2g/kg/d+5-FU LFWGE劑量組的抑瘤率分別達到 49.37%、40.7%, 47.8%。
[0056]實施例3
[0057]稱取粉碎過60目篩的大麥粉20.0g于500mL錐形瓶中，向其中加入1:6比例的水混合均勻，先用0.015%的β -葡聚糖酶40°C水解30min，再用4%的植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum Dy-1)在30 °C下發(fā)酵48h,發(fā)酵完成后將FBE在室溫下6000rpm/min離心20min，收集上清液，并將其進行冷凍干燥24h，從而獲得到發(fā)酵大麥提取物(FBE)。
[0058]稱取0.5g的FBE溶于50ml的去離子水中，過0.22um的濾膜,將濾液按照0.125mg/mL、0.25mg/mL、0.5mg/mL、l.0mg/mL、2.0mg/ml>4.0mg/ml 分別加入到 HT-29 腫瘤細胞中，培養(yǎng)細胞24h、48h、72h，并分別通過MTT法測定FBE對結腸癌HT-29細胞的抑制率。結果表明，提取物濃度與腫瘤細胞增殖抑制率呈正相關，最大抑制率達到95.6%(圖7)。
[0059]實施例4
[0060]將上述制備的FBE溶解于生理鹽水中，制備成濃度為0.2g/ml和0.lg/ml，并且通過無菌膜處理備用。將人的HT-29結腸癌細胞接種到4-6周齡的BALB/c裸鼠腹部皮下，2天后采用 2g/kg/d、lg/kg/d、2g/kg/d+5-FU (25mg/kg/d, 1.p,7 天)劑量的 FBE 給荷瘤裸鼠灌胃，連續(xù)灌胃30天，同時與灌胃相同劑量的生理鹽水組和腹腔注射(25mg/kg/d，7天)的5-FU組做比較，通過用游標卡尺測量的移植瘤體積和最后的抑瘤率來確證FBE的抗腫瘤作用(圖8，9)。結果表明，2g/kg/d+5-FU混合劑量組的抑瘤率可達到53.36%。
[0061]表1分離得到產酸量最高的菌株的形態(tài)學特征
[0062]
【權利要求】
1.乳酸菌Dy-1,其建議的分類名稱為植物乳桿菌，;保藏編號為 CGMCC N0.6016。
2.乳酸菌的應用，用于發(fā)酵小麥胚芽或大麥谷物。
【文檔編號】C12R1/25GK103468600SQ201310261606
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年6月26日 優(yōu)先權日:2013年6月26日
【發(fā)明者】董英, 程新, 崔恒林, 肖香, 伍靜 申請人:江蘇大學