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一種收獲和生產(chǎn)病毒的方法

文檔序號(hào):514027閱讀:356來源:國知局
一種收獲和生產(chǎn)病毒的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種收獲和生產(chǎn)病毒的方法,所述收獲病毒的方法包括將含有轉(zhuǎn)染了病毒的動(dòng)物細(xì)胞的懸浮液與可溶性鹽混合,所述可溶性鹽的用量使得可溶性鹽在混合體系中的濃度為400-1200mM;所述可溶性鹽為氯化鈉和/或氯化鉀;所述病毒為HSV-1病毒或腺病毒。所述生產(chǎn)病毒的方法包括培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞,用病毒轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞,按照以上方法收獲病毒和提純病毒。通過上述技術(shù)方案,本發(fā)明能夠在不需低溫設(shè)備的前提下操作簡單地收獲病毒,因此,本發(fā)明的方法特別適用于大規(guī)模生產(chǎn)。
【專利說明】一種收獲和生產(chǎn)病毒的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種收獲和生產(chǎn)病毒的方法,具體地,涉及一種收獲病毒的方法以及 包括該收獲方法的生產(chǎn)病毒的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 基于病毒的醫(yī)藥產(chǎn)品越來越受重視,包括疫苗和基因治療病毒載體。這也給病毒 類產(chǎn)品的生產(chǎn)工藝帶來機(jī)遇和挑戰(zhàn)。一般的生產(chǎn)工藝包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)、病毒的轉(zhuǎn)染、 病毒的收獲、澄清、超濾和柱層析等一系列步驟,目標(biāo)是提高產(chǎn)品的回收率以及純度。就基 因治療病毒載體而言,已經(jīng)有許多針對(duì)常用病毒載體純化策略的開發(fā)研究,包括腺病毒、腺 相關(guān)病毒和慢病毒等,并且取得了不錯(cuò)的效果。也有一些病毒載體包括皰疹病毒和痘病毒 等的生產(chǎn)工藝還處于摸索優(yōu)化過程中,取得的成就并不明顯。
[0003] 無論是哪種產(chǎn)品,下游生產(chǎn)工藝都從細(xì)胞培養(yǎng)物中收獲轉(zhuǎn)染的病毒開始。以I型 單純皰疫病毒(Herpes Simplex Virus Type I,HSV_1病毒)為例,在實(shí)際操作中,由于病 毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的頻率不同,病毒逃逸的時(shí)間不同,雖然病毒天然地會(huì)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行融合裂解,但 是仍然會(huì)有相當(dāng)多的一部分病毒位于細(xì)胞內(nèi)或者粘附在細(xì)胞碎片上,在下一步的澄清步驟 中,這部分病毒會(huì)隨著細(xì)胞碎片一起被丟棄,導(dǎo)致病毒回收率較低。
[0004] 在常規(guī)操作方法中,HSV-1病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,病毒在細(xì)胞內(nèi)部復(fù)制擴(kuò)增,引起細(xì)胞 病變現(xiàn)象發(fā)生,細(xì)胞變圓,從培養(yǎng)基質(zhì)表面脫落,細(xì)胞裂解,病毒逃逸出細(xì)胞釋放到收獲液, 這種病毒導(dǎo)致的細(xì)胞裂解是不完全的,無法完全釋放出病毒,因此必須對(duì)收獲液中的細(xì)胞 進(jìn)行徹底破碎。這時(shí)將收獲的細(xì)胞液在_80°C條件下反復(fù)凍融,通過物理方式使細(xì)胞完全破 碎,從而達(dá)到釋放病毒的目的。這種凍融方法的缺點(diǎn)是需要低溫設(shè)備,在處理大量收獲液時(shí) 采用此方法操作性不強(qiáng)且很費(fèi)時(shí),特別不利于工業(yè)大規(guī)模的生產(chǎn)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有的凍融方法對(duì)設(shè)備要求高而不利于大規(guī)模生產(chǎn)的缺陷, 提供一種無需低溫設(shè)備、操作簡單且適于大規(guī)模生產(chǎn)的病毒收獲方法。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的,本發(fā)明的發(fā)明人進(jìn)行了大量地研究,結(jié)果意外發(fā)現(xiàn),通過往含 有動(dòng)物細(xì)胞的懸浮液中添加可溶性鹽似乎能夠降低病毒與細(xì)胞碎片之間的粘附性,從而提 高病毒的回收率。因此,本發(fā)明提供了 一種收獲病毒的方法,該方法包括將含有轉(zhuǎn)染了病毒 的動(dòng)物細(xì)胞的懸浮液與可溶性鹽混合,所述可溶性鹽的用量使得可溶性鹽在混合體系中的 濃度為400-1200mM ;所述可溶性鹽為氯化鈉和/或氯化鉀;所述病毒為HSV-1病毒或腺病 毒。
[0007] 此外,本發(fā)明還提供了一種生產(chǎn)病毒的方法,該方法包括培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞,用病毒轉(zhuǎn) 染培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞,收獲病毒和提純病毒,其中,所述收獲病毒的方法為上述方法。
[0008] 通過上述技術(shù)方案,本發(fā)明能夠在不需低溫設(shè)備的前提下操作簡單地收獲病毒, 因此,本發(fā)明的方法特別適用于大規(guī)模生產(chǎn)。
[0009] 本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)將在隨后的【具體實(shí)施方式】部分予以詳細(xì)說明。

【具體實(shí)施方式】
[0010] 以下對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】進(jìn)行詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解的是,此處所描述的具體 實(shí)施方式僅用于說明和解釋本發(fā)明,并不用于限制本發(fā)明。
[0011] 在本發(fā)明中,在未作相反說明的情況下,術(shù)語"含有轉(zhuǎn)染了病毒的動(dòng)物細(xì)胞的懸浮 液"是指因病毒轉(zhuǎn)染導(dǎo)致細(xì)胞脫離培養(yǎng)基質(zhì)以分散狀態(tài)存在的動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)液,與"懸浮 液"可以替換使用;"轉(zhuǎn)染"是指用病毒去感染其宿主細(xì)胞,可增殖出一群病毒后代的現(xiàn)象, 有些被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞會(huì)隨病毒后代的釋放而發(fā)生裂解。HSV-1病毒是指I型單純皰疹病毒 (Herpes simplex virus)。
[0012] 本發(fā)明提供的收獲病毒的方法包括將含有轉(zhuǎn)染了病毒的動(dòng)物細(xì)胞的懸浮液與可 溶性鹽混合,所述可溶性鹽的用量使得可溶性鹽在混合體系中的濃度為400-1200mM,優(yōu)選 為600-1000mM ;所述可溶性鹽為氯化鈉和/或氯化鉀,優(yōu)選為氯化鈉;所述病毒為HSV-1病 毒或腺病毒。
[0013] 本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn),當(dāng)使用的可溶性鹽的種類和用量在上述優(yōu)選范圍內(nèi)時(shí),能 夠進(jìn)一步促進(jìn)病毒的回收,提高病毒的回收率。
[0014] 根據(jù)本發(fā)明,所述可溶性鹽可以以固體的形式與懸浮液混合,也可以以溶液的形 式與懸浮液混合,為了使可溶性鹽與轉(zhuǎn)染了病毒的動(dòng)物細(xì)胞充分接觸,優(yōu)選情況下,所述 可溶性鹽以可溶性鹽溶液的形式與含有轉(zhuǎn)染了病毒的動(dòng)物細(xì)胞的懸浮液混合。其中,對(duì)所 述可溶性鹽溶液的濃度沒有特別的限制,優(yōu)選地,所述可溶性鹽溶液中可溶性鹽的濃度為 2-5M。
[0015] 根據(jù)本發(fā)明,對(duì)所述混合的條件沒有特別的要求,只要能夠使病毒從轉(zhuǎn)染了病 毒的動(dòng)物細(xì)胞中釋放即可,優(yōu)選地,所述混合的條件包括:混合的時(shí)間為〇. 5-24h,更優(yōu)選 為2_20h?;旌系臏囟瓤梢愿鶕?jù)動(dòng)物細(xì)胞的特性進(jìn)行適當(dāng)?shù)倪x擇,優(yōu)選地,混合的溫度為 0-40°C,更優(yōu)選為 4-30°C。
[0016] 本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn),本發(fā)明的方法特別適用于HSV-1病毒的收獲,因此,所述病 毒優(yōu)選為HSV-1病毒。
[0017] 根據(jù)本發(fā)明,所述動(dòng)物細(xì)胞可以為各種能夠被HSV-1病毒或腺病毒轉(zhuǎn)染的動(dòng)物細(xì) 胞,即,各種HSV-1病毒或腺病毒的宿主細(xì)胞,可以為原代細(xì)胞、傳代細(xì)胞系或腫瘤細(xì)胞系。 對(duì)于HSV-1病毒,所述動(dòng)物細(xì)胞可以為非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero細(xì)胞)、兔腎細(xì)胞、地鼠腎細(xì) 胞、人胚成纖維細(xì)胞、人羊膜細(xì)胞或人原代神經(jīng)細(xì)胞等。對(duì)于腺病毒,所述動(dòng)物細(xì)胞可以為 人胚腎細(xì)胞(HEK-293細(xì)胞)、人肺腺癌細(xì)胞(A549細(xì)胞)、人宮頸癌細(xì)胞(HeLa細(xì)胞)或人胚 原代細(xì)胞。
[0018] 本發(fā)明中,所述腺病毒可以為哺乳動(dòng)物腺病毒屬(Mastadenovirus)的腺病毒,也 可以為禽腺病毒屬(Aviadenovirus)的腺病毒,但優(yōu)選為哺乳動(dòng)物腺病毒屬的腺病毒,例 如,人5型腺病毒。
[0019] 根據(jù)本發(fā)明,含有轉(zhuǎn)染了病毒的動(dòng)物細(xì)胞的懸浮液可以采用本領(lǐng)域的常規(guī)方法獲 得,以哺乳動(dòng)物細(xì)胞為例,將哺乳動(dòng)物細(xì)胞在35-37°C、4-6%C0 2條件下培養(yǎng),形成致密單層 細(xì)胞層后,更換轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基,按照感染復(fù)數(shù)(Μ0Ι,表示轉(zhuǎn)染時(shí)病毒數(shù)量與細(xì)胞數(shù)量的比值) 為0. 01-5與HSV-1病毒混合或MOI為1-12與腺病毒混合,35-37°C繼續(xù)培養(yǎng)48-72h,即可 得到含有轉(zhuǎn)染了病毒的動(dòng)物細(xì)胞的懸浮液。其中,用于培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)基和/或轉(zhuǎn)染 培養(yǎng)基可以為各種常規(guī)使用的培養(yǎng)基。
[0020] 本發(fā)明的收獲病毒的方法特別適用于大規(guī)模的生產(chǎn),因此,在每次收獲病毒時(shí),可 以按照本發(fā)明的方法對(duì)大量懸浮液進(jìn)行處理以收獲病毒。優(yōu)選地,在每次與可溶性鹽混合 時(shí),含有轉(zhuǎn)染了病毒的動(dòng)物細(xì)胞的懸浮液的體積在20L以上,更優(yōu)選為20-100L。以上描述 并不是限定本發(fā)明的方法僅適用于處理20L以上的懸浮液,本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解,本 發(fā)明的方法同樣適于從少量(如l_40ml)的懸浮液中收獲病毒。
[0021] 本發(fā)明提供的生產(chǎn)病毒的方法包括培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞,用病毒轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞, 收獲病毒和提純病毒,其中,收獲病毒的方法為本發(fā)明提供的上述方法。
[0022] 根據(jù)本發(fā)明,培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞、用病毒轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞和提純病毒的方法均可 以參照本領(lǐng)域的常規(guī)方法進(jìn)行,且針對(duì)不同的動(dòng)物細(xì)胞,本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠選擇不同的 條件實(shí)施上述步驟,故在此不再贅述。
[0023] 以下將通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。
[0024] 以下實(shí)施例中,HSV-1病毒為于2006年6月14日保藏至中國微生物菌種保藏 管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)、保藏編號(hào)為CGMCC No. 1736的病毒株(已經(jīng)公開于 CN101230334A);腺病毒為人5型腺病毒(購自ATCC,貨號(hào)為ATCC? VR-1516? ;DMEM購自 Sigma (D5796)。
[0025] HSV-1病毒的回收液的滴度的測定方法為空斑方法,參照CN101376893A實(shí)施 例2中步驟(1)所描述的方法,滴度越大,表明HSV-1病毒的回收率越大;腺病毒的回收 液的滴度的測定方法為半數(shù)組織培養(yǎng)感染量方法(TCID50方法),參照"Sensitivity and Reproducibility in Adenoviral Infectious Titer Determination, Nyberg-Hoffman C,Shabram P,Li W等人,Nat.Med.,1997,3:808-811",滴度越大,表明腺病毒的回收率越 大。
[0026] 轉(zhuǎn)染了病毒的動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)(懸浮液的制備)
[0027] (1)將動(dòng)物細(xì)胞(購自ATCC,貨號(hào)為ATCC@CCL-81?)接種至完全培養(yǎng)基(含10體積% 血清的DMEM)中,在37°C、5%C0 2條件下培養(yǎng),待細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中形成致密單層細(xì)胞層后,更 換轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基(含1體積%血清的DMEM),按照Μ0Ι=0. 05加入HSV-1病毒,37°C下繼續(xù)培養(yǎng), 培養(yǎng)72小時(shí)后細(xì)胞全部變圓,搖晃后全部從培養(yǎng)瓶脫落,即獲得含有轉(zhuǎn)染了 HSV-1病毒的 動(dòng)物細(xì)胞的懸浮液。
[0028] (2)將動(dòng)物細(xì)胞(購自ATCC,貨號(hào)為ATCC@CRL-1573?)接種至完全培養(yǎng)基(含10體 積%血清的DMEM)中,在37°C、5%C0 2條件下培養(yǎng),待細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中形成致密單層細(xì)胞層 后,更換轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基(含1體積%血清的DMEM),按照M0I=10加入腺病毒,37°C下繼續(xù)培養(yǎng), 培養(yǎng)72小時(shí)后細(xì)胞全部變圓,搖晃后全部從培養(yǎng)瓶脫落,即獲得含有轉(zhuǎn)染了腺病毒的動(dòng)物 細(xì)胞的懸浮液。
[0029] 實(shí)施例1
[0030] 將(1)中獲得的含有轉(zhuǎn)染了 HSV-1病毒的動(dòng)物細(xì)胞的懸浮液(100L)與氯化鈉溶液 (濃度為2M,氯化鈉溶液的用量使得氯化鈉在混合體系中的濃度為600mM)在4°C下混合20 小時(shí),獲得HSV-1病毒的回收液。測得回收液的滴度為5. lX106pfu/ml。
[0031] 實(shí)施例2
[0032] 將(1)中獲得的含有轉(zhuǎn)染了 HSV-1病毒的動(dòng)物細(xì)胞的懸浮液(40L)與氯化鈉溶液 (濃度為5M,氯化鈉溶液的用量使得氯化鈉在混合體系中的濃度為1000mM)在30°C下混合5 小時(shí),獲得HSV-1病毒的回收液。測得回收液的滴度為2. 5X 106pfu/ml。
[0033] 實(shí)施例3
[0034] 將(1)中獲得的含有轉(zhuǎn)染了 HSV-1病毒的動(dòng)物細(xì)胞的懸浮液(20L)與氯化鈉溶液 (濃度為4M,氯化鈉溶液的用量使得氯化鈉在混合體系中的濃度為800mM)在25°C下混合2 小時(shí),獲得HSV-1病毒的回收液。測得回收液的滴度為2X 107pfu/ml。
[0035] 實(shí)施例4
[0036] 按照實(shí)施例3的方法收獲病毒,不同的是,混合的時(shí)間為1小時(shí)。測得回收液的滴 度為 4X106pfu/ml。
[0037] 實(shí)施例5
[0038] 按照實(shí)施例3的方法收獲病毒,不同的是,將"氯化鈉溶液"用"氯化鉀溶液"代替。 測得回收液的滴度為9X 106pfu/ml。
[0039] 實(shí)施例6
[0040] 按照實(shí)施例3的方法收獲病毒,不同的是,氯化鈉溶液的用量使得氯化鈉在混合 體系中的濃度為400mM。測得回收液的滴度為3. 5X 106pfu/ml。
[0041] 實(shí)施例7
[0042] 將(2)中獲得的含有轉(zhuǎn)染了腺病毒的動(dòng)物細(xì)胞的懸浮液與氯化鈉溶液(濃度為 5M,氯化鈉溶液的用量使得氯化鈉在混合體系中的濃度為800mM)在25°C下混合2小時(shí),獲 得腺病毒的回收液。測得回收液的滴度為lXl〇 1(lIU/ml。
[0043] 對(duì)比例1
[0044] 將(1)中獲得的含有轉(zhuǎn)染了 HSV-1病毒的動(dòng)物細(xì)胞的懸浮液(40ml)置于_80°C的 超低溫保存箱中l(wèi)h,取出融化,重復(fù)3次即獲得HSV-1病毒的回收液。測得回收液的滴度為 2X10 7pfu/ml〇
[0045] 對(duì)比例2
[0046] 按照實(shí)施例3的方法收獲病毒,不同的是,懸浮液不與氯化鈉溶液混合,而直接被 置于25°C下2小時(shí),測得回收液的滴度為1. 7X106pfu/ml。
[0047] 從以上實(shí)施例可以看出,通過本發(fā)明方法獲得的病毒回收液的滴度較高,說明本 發(fā)明方法能夠在不需低溫設(shè)備的前提下操作簡單地收獲病毒。
[0048] 從實(shí)施例3和實(shí)施例4-6的結(jié)果可以看出,控制各個(gè)條件(可溶性鹽種類和終濃度 等)在本發(fā)明優(yōu)選的范圍內(nèi)能夠進(jìn)一步提1?病毒的回收率。
[0049] 此外,從實(shí)施例1-7和對(duì)比例1可以看出,采用現(xiàn)有的凍融的方法從懸浮液中收獲 病毒需要使用超低溫保存箱,而通常1臺(tái)超低溫保存箱處理1L懸浮液所需要的時(shí)間約為 1. 5天,如果增加懸浮液的量,為了保證懸浮液充分冷凍,則需要大大延長冷凍時(shí)間,顯然凍 融方法不適合用于大規(guī)模生產(chǎn)中。而采用本發(fā)明的方法可以直接從較大量的懸浮液中收獲 病毒,對(duì)設(shè)備的要求低,無需使用超低溫保存箱即可實(shí)現(xiàn)病毒的收獲。
[0050] 以上詳細(xì)描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式,但是,本發(fā)明并不限于上述實(shí)施方式中 的具體細(xì)節(jié),在本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思范圍內(nèi),可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行多種簡單變型,這 些簡單變型均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0051] 另外需要說明的是,在上述【具體實(shí)施方式】中所描述的各個(gè)具體技術(shù)特征,在不矛 盾的情況下,可以通過任何合適的方式進(jìn)行組合,為了避免不必要的重復(fù),本發(fā)明對(duì)各種可 能的組合方式不再另行說明。
[0052] 此外,本發(fā)明的各種不同的實(shí)施方式之間也可以進(jìn)行任意組合,只要其不違背本 發(fā)明的思想,其同樣應(yīng)當(dāng)視為本發(fā)明所公開的內(nèi)容。
【權(quán)利要求】
1. 一種收獲病毒的方法,其特征在于,該方法包括將含有轉(zhuǎn)染了病毒的動(dòng)物細(xì)胞 的懸浮液與可溶性鹽混合,所述可溶性鹽的用量使得可溶性鹽在混合體系中的濃度為 400-1200mM ;所述可溶性鹽為氯化鈉和/或氯化鉀;所述病毒為I型單純皰疹病毒或腺病 毒。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其中,可溶性鹽的用量使得可溶性鹽在混合體系中的 濃度為 600-1000mM。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法,其中,所述可溶性鹽為氯化鈉。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)所述的方法,其中,所述可溶性鹽以可溶性鹽溶液的 形式與含有轉(zhuǎn)染了病毒的動(dòng)物細(xì)胞的懸浮液混合,且可溶性鹽溶液中可溶性鹽的濃度為 2-5M。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其中,所述混合的條件包括:混合的溫度為0_40°C,混 合的時(shí)間為〇. 5-24h。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1或5所述的方法,其中,所述混合的條件包括:混合的溫度為 4-30°C,混合的時(shí)間為2-20h。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其中,所述病毒為I型單純皰疹病毒。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其中,在每次與可溶性鹽混合時(shí),含有轉(zhuǎn)染了病毒的動(dòng) 物細(xì)胞的懸浮液的體積為20-100L。
9. 一種生產(chǎn)病毒的方法,該方法包括培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞,用病毒轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞,收獲 病毒和提純病毒,其特征在于,收獲病毒的方法為權(quán)利要求1-8中任意一項(xiàng)所述的方法。
【文檔編號(hào)】C12N7/02GK104250639SQ201310268249
【公開日】2014年12月31日 申請(qǐng)日期:2013年6月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月28日
【發(fā)明者】田超, 李小鵬, 王杰, 趙婧姝, 周華 申請(qǐng)人:北京奧源和力生物技術(shù)有限公司
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